Construyendo la Nueva Universidad

Producción de bioinoculantes eficientes para el cultivo

de leguminosas, gramíneas y solanáceas: mediante
la utilización de cepas nativas de microorganismos
diazotróficos
Investigador: Ing. Iván Granda Mora

Resumen

H
asta la fecha se han obtenido resul-
tados muy positivos del proyecto en
mención, tanto a nivel de laboratorio,
invernadero y de campo, los mismos que es-
tán siendo escritos para su publicación en
revistas indexadas, por lo que en esta sec-
ción solo nos remitiremos a los resultados
iniciales obtenidos del estudio de la determi-
nación de la variabilidad de aislados diazo-
tróficos simbióticos procedentes del cultivo
de frejol común (Phaseolus vulgaris L.) en dife-
rentes zonas agroecológicas de la provincia
de Loja, Ecuador. Para el efecto se muestrea-
ron un total de 12 cantones con diferentes
zonas agroclimáticas, las cuales se geo-refe-
renciaron mediante el Sistema de Posiciona-
miento Global. La determinación de la varia-
bilidad de los aislados se realizó mediante
la caracterización morfológica de las colo-
nias obtenidas, donde se evaluó la tinción
al Gram, crecimiento, color, producción de
mucus, bordes y elevación. La caracteriza-
ción bioquímica se llevó a cabo mediante el
crecimiento de los aislados en medios selec-
tivos: Mac Conkey, Agar Kligler, Extracto de
Levadura Manitol Agar-Rojo Congo y Pepto-
na Glucosa Agar. De un total de 50 aislados
iniciales, 34 de ellos presentaron diferencias
en al menos un parámetro evaluado en los
análisis morfológicos. Los resultados de las
pruebas bioquímicas demostraron la pureza
de las cepas aisladas, las cuales correspon-
den con las características pertenecientes al
género Rhizobium, lo que demuestra la varia-
bilidad morfológica y bioquímica de estas
especies para este género al sur del Ecuador,
las cuales pueden ser la base para obtención
de cepas eficientes en la realización de ino-
culantes para este cultivo.

Introducción
Los procesos naturales de fijación biológica
del nitrógeno (FBN) juegan un importante rol
en la activación de los sistemas agrícolas sus-
tentables por su beneficio ambiental (Beever,
2007). El incremento de su aplicación puede
mitigar la necesidad del uso de fertilizantes
nitrogenados sintéticos con su consiguiente
efecto benéfico al ciclo del nitrógeno (N), el
calentamiento global y el saneamiento de
las aguas subterráneas y superficiales (Cerón
et al., 2012). Este proceso depende básica-
mente de la acción de los microorganismos
en conjunto con las plantas. Existen algunas
especies de microorganismos que poseen
la habilidad de convertir el dinitrógeno (N2)
atmosférico a amonio (NH4+) mediante la
acción del complejo enzimático nitrogenasa
(Martínez, 2000). Estas especies son deno-
minados diazótrofos y requieren de energía
para realizar su metabolismo (Martínez-Ro-
mero, 2003). Dentro de los diazótrofos ca-
paces de realizar este proceso se encuentran
los denominados fijadores simbióticos, los
cuales fijan N2 atmosférico en interacción
con organismos superiores, siendo la familia
Rhizobiaceae la que agrupa los géneros más
importantes utilizados en la biofertilización
en diferentes cultivos, conociéndose gené-
ricamente como rizobia (Bauer, 2001). Entre
los diferentes sistemas biológicos capaces
de fijar N2 atmosférico, la simbiosis Rhizo-
bium-leguminosa constituye con la mayor
cantidad de N aportada al ecosistema y a la
producción de alimentos (Lindström, 2010).
Se estima que esta puede oscilar entre 200
y 250 kg N ha-1 año (Cerón et al., 2012)
constituyendo la asociación más elaborada
y eficiente entre plantas y microorganismos
(Olivares et al., 2013).
En Ecuador, leguminosas como el frejol co-
mún (Phaseolus vulgaris), constituyen un ali-
mento básico para el consumo humano direc-
to, no solamente por el aporte de proteínas y
minerales, sino a la vez por la superficie cul-
tivada que garantiza la seguridad y soberanía
alimentaria. El área cultivada de este grano
en el país supera las 400 000 ha año-1 (INEC,
2012). A pesar de la importancia de este culti-
vo para el país, los estudios relacionados con
la interacción Rhizobium-frejol común para
incrementar los rendimientos agrícolas me-
diante esta asociación son muy escasos (Ber-
nal, 2004). Según Michiels et al., (1998), el
frejol común es una leguminosa promiscua, la
cual interacciona con diferentes especies del
género Rhizobium, disminuyendo de forma
sustancial la eficiencia del proceso simbióti-
co. Estos aspectos ponen en evidencia que se
hace imprescindible el conocimiento de los
géneros y especies de microsimbiontes en di-
ferentes condiciones agroecológicas del Sur
del Ecuador.

Materiales y Métodos
Se colectaron de forma aleatoria muestras de plantas de fréjol co-
mún con presencia de nódulos en sus raíces en diferentes zonas agro-
climáticas de la provincia de Loja. No se tuvo en cuenta la edad de
los cultivos de frejol ni el tipo de suelo, solo la presencia de nódulos
en sus raíces. Los puntos de muestreos se ubicaron según las zonas
más productoras de esta leguminosa (ver figura 1). Estas áreas fueron
geo-referenciadas mediante la utilización del Sistema de Posiciona-
miento Global (GPS). Luego de la obtención de las muestras, estas
se acondicionaron en bolsas ziploc y llevadas al laboratorio para su
procesamiento antes de las 24 horas. En todos los casos se comprobó
la actividad de los nódulos mediante la escisión de los mismos con el
objetivo de observar la pigmentación de la leghemoglobina, lo cual
indica la viabilidad de los bacteroides dentro del nódulo y por consi-
guiente la vitalidad de estos para su posterior aislamiento.
Preparación de las muestras y aislamiento de colonias bacterianas
Las muestras se procesaron mediante el método de siembra en placas

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Petri y agotamiento por estrías (Torres-Gutiérrez, 2008). Se tomaron
entre 15-20 nódulos por cada muestra para realizar la esterilización
de los mismos mediante la inmersión 1 minuto en etanol 70% y 3
minutos en hipoclorito de sodio (NaOCl) al 3 %. Posteriormente se
procedió al lavado intenso de los nódulos (hasta 10 veces) con agua
destilada estéril, con el propósito de eliminar todo resto de sustancia
tóxica a las bacterias. Luego del lavado se realizó la maceración de
los nódulos en 500 µl de agua destilada estéril en microtubos de 2ml.
De la suspensión obtenida del macerado en cada muestra se sembró
por estrías en placas Petri conteniendo medio Agar Triptona Extracto
de Levadura (ATEL) e incubadas a 28°C durante 3 días. Al finalizar el
periodo de incubación todas las colonias crecidas se purificaron me-
diante la siembra repetida en medio Extracto de Levadura Manitol
Agar (ELMA) e incubadas a 28°C durante 72 horas (Remans et al.,
Resultados
Geo-localización de las zonas muestreadas
Un amplio muestreo se llevó a cabo en la investigación para obtener
la mayor representatividad de localidades de la provincia de Loja. El
muestreo se realizó en 50 localidades abarcando 12 cantones (Loja,
Figura 1. Zonas muestreadas ( ) para el aislamiento de cepas de Rhizobium, en diferentes condiciones agroclimáticas de
la provincia de Loja.
Caracterización morfológica
Un total de 50 aislados se obtuvieron luego del procesamiento de
las muestras. De ellos treinta y cuatro contaron con características
morfológicas pertenecientes al género Rhizobium. La variabilidad de
los caracteres morfológicos de las bacterias diazotróficas se evidenció
teniendo en cuenta que de los treinta y cuatro aislados seleccionados,
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2007). Luego del periodo de incubación las cepas se conservaron a
-80°C en glicerol (50 % v/v).
Caracterización morfológica y bioquímica de los aislados
Todos los aislados obtenidos mediante el proceso de aislamiento se
caracterizaron morfológicamente mediante la diferenciación de las
colonias respecto a: tinción al Gram, tipo de crecimiento, color, pro-
ducción de mucus, bordes y elevación de las colonias (Granda-Mora
et al., 2009). La caracterización bioquímica consistió en determinar el
crecimiento de los aislados en los medios selectivos Peptona Glucosa
Agar (PGA), Mc Conkey, Agar Kligler y ELMA con adición de Rojo Con-
go (ELMA-RC).
Calvas, Gonzanamá, Catamayo, Espíndola, Olmedo, Paltas, Célica,
Macará, Saraguro, Pindal, Sosoranga) repartidos entre las áreas de
mayor producción de frejol común a nivel de la provincia de Loja
(ver figura 1) con alturas que se encontraron entre los 700 hasta
2060 msnm.
todos presentaron características diferentes en al menos un paráme-
tro morfológico evaluado. El resto de aislados analizados presentaron
características en su crecimiento colonial que no corresponden a las
descritas para el género Rhizobium. Estos aislados por no ser parte
de nuestros estudios no se presentan en resultados. En la figura 2, se
muestran algunos ejemplos de imágenes de las tinciones de Gram y el
crecimiento de las colonias purificadas.
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Tabla 1. Caracterización morfológica de los aislados de nódulos de frejol común con diferencia en al menos un parámetro morfológico evaluado.

CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS
Aislado Crec.a Colorb Mucusc Bordesd Elevac.e Gramf Morfol.g
VP1 + 4 ++ 2 ++ - BC
VP2 +++ 4 +++ 3 + - BC
RC1 + 5 +++ 2 ++ - BC
Tur1 ++ 5 ++ 2 ++ - BC
Cañ1 +++ 5 + 3 ++ - BC
Rai1 ++ 4 ++ 3 ++ - BC
Tabl1 ++ 4 ++ 1 ++ - BC
Namb1 +++ 3 ++ 2 ++ - BC
Tamb1 ++ 4 ++ 1 ++ - BC
CB1 +++ 4 + 2 ++ - BC
Nar1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC
LP1 ++ 4 +++ 2 ++ - BC
VP3 ++ 2 +++ 1 ++ - BC
VP4 ++ 4 ++ 1 ++ - BC
RC2 ++ 4 + 2 ++ - CB
Tur2 +++ 2 + 3 + - BC
Cañ2 +++ 4 ++ 2 ++ - BC
Rai2 +++ 4 ++ 3 ++ - BC
Tabl2 +++ 4 ++ 2 ++ - BC
Namb2 +++ 4 +++ 2 ++ - BC
Tamb2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC
CB2 +++ 4 +++ 3 ++ - BC
Nar2 ++ 2 ++ 1 ++ - BC
LP2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC
Q4 + 4 ++ 2 ++ - BC
Z1 + 2 ++ 3 ++ - BC
Z3 ++ 4 ++ 2 ++ - BC
Z4 ++ 4 ++ 3 ++ - BC
Pindal1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC
Pindal 3.2 ++ 4 +++ 2 ++ - BC
Col 1 +++ 4 +++ 2 ++ - BC
Col 6.2 +++ 4 +++ 3 ++ - BC
Soso 1.1 +++ 2 +++ 1 ++ - BC
Soso 4.2 +++ 4 +++ 2 ++ - BC
a: Crecimiento: (+) ligero, (++) moderado; (+++) abundante; b: Color: (2) traslucido, (3) opaco, (4) blanco opaco, (5) crema; c: Mucosidad: (+) ligero, (++) moderado,
(+++) abundante; d: Bordes: (1) liso, (2) ondulado, (3) lobulado; e: Elevación: (+) plana, (++) elevado f: Gram: (-) negativo; g: Morfología: BC (bacilo corto), BL (bacilo
largo), CB (coco-bacilo); h: Forma de crecimiento en siembra por estrías: (1) Continua en línea recta, (2) Continua con bordes filiforme, (3) Espinoso, (4) Punteado, (5)
rizoide. Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turupamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb:
Nambacola, Tamb: El Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos. Q: Quiskinchir, Z: Zhindar, Pindal, Col: Colaisaca, Soso: Sosoranga.

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Figura 2. Representación de la tinción al Gram y caracterización morfológica de los aislados.

Con excepción de la localidad de Virgen Pamba, donde se obtuvieron
cuatro aislados, en el resto de las localidades se obtuvo dos y tres
aislados. Se destaca de las características morfológicas la producción
de mucus de los aislados obtenidos. En un total de 15 cepas la pro-
ducción de mucus es abundante, aspecto que se pudo corroborar en
el crecimiento al cabo de las 72 h de incubación.
Caracterización bioquímica
En el Tabla 1 y la Figura 3 se presentan los resultados de las pruebas
bioquímicas para determinar la pureza de los aislados de Rhizobium.
En este análisis se determinó el crecimiento de las bacterias en los
medios PGA, Agar Mac Conkey, Agar Kligler y ELMA-RC.
La Figura 3 muestra el crecimiento de algunos de los aislados en los
medios Mc Conkey (Fig. 3-A) y PGA (Fig. 3-B), donde no se observa
crecimiento colonial de los aislados diazotróficos. En el panel C se
observa el crecimiento en estrías de las colonias bacterianas en me-
dio ELMA-Rojo Congo. Los tubos del crecimiento en Agar Kligler no
muestran cambio de coloración en el medio, evidenciando que no se
fermenta glucosa ni lactosa.

Figura 3. Pruebas bioquímica de los aislados. A: Cultivo en medio Mac Conkey. B: Cultivo en medio PGA. C: Cultivo en medio ELMA-Rojo Congo. D: Cultivo en
medio Kliger.

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Tabla 2. Caracterización bioquímica de los aislados obtenidos de Rhizobium

Aislados PGA Mac Conkey ELMA-RC Crecimiento Agar Kligler

Glucosa Lactosa Sulfhídrico
VP1 - - + - - -
VP2 - - + - - -
RC1 - - + - - -
Tur1 - - + - - -
Cañ1 - - + - - -
Rai1 - - + - - -
Tabl1 - - + - - -
Namb1 - - + - - -
Tamb1 - - + - - -
CB1 - - + - - -
Nar1 + + - + + -
LP1 + + - + + -
VP3 - - + - - -
VP4 - - + - - -
RC2 - - + - - -
Tur2 - - + - - -
Cañ2 - - + - - -
Rai2 - - + - - -
Tabl2 - - + - - -
Namb2 - - + - - -
Tamb2 + + - + - -
CB2 - - + + - -
Nar2 - - + - - -
LP2 - - + - - -
Q4 - - + - - -
Z1 - - + - - -
Z3 - - + - - -
Z4 - - + - - -
Pindal1 - - + - - -
Pindal 3.2 - + + - - -
Col 1 - - + - - -
Col 6.2 - - + - - -
Soso 1.1 - + + - - -
Soso 4.2 - - + - - -
Leyenda: Crecimiento en medio PGA (peptona-glucosa-agar): - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Mac Conkey: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio ELMA
suplementado con Rojo Congo: - (negativo), + (positivo). Crecimiento en medio Klligler (fermentación de glucosa, lactosa o producción de ácido sulfhídrico): - (negativo), + (positivo).
Abreviaturas de las localidades de aislamientos: V.P: Virgen Pamba, R.C: Reina del Cisne, Tur: Turupamba, Cañ: Cañaro, Rai: Raiminche, Tabl: Tabloncillo, Namb: Nambacola, Tamb: El
Tambo, C.B: Capilla Baja, Nar: Naranjo, L.P: Los Pinos. Q: Quiskinchir, Z: Zhindar, Pindal, Col: Colaisaca, Soso: Sosoranga.

Como se aprecia en la tabla 2, con excepción de los aislados de la
localidad de Naranjo 1, Los Pinos 1, Tambo 2, Capilla baja 2, Pindal
3.2 y Sosoranga 1.1 todas las demás bacterias diazotróficas tuvieron
comportamientos según su crecimiento en los medios de cultivos que
corroboran las características del desarrollo del género Rhizobium. Al
analizar estos resultados nos encontramos con poca variabilidad entre
los aislados, aspecto este de gran importancia, ya que demuestra que
la gran mayoría de los aislados diazotróficos obtenidos concuerdan
con las características deseadas para este tipo de estudio.

Conclusiones
• Un total de 50 aislados se obtuvieron del procesamiento de las • Los análisis morfológicos y bioquímicos demuestran la diversidad
muestras. De ellos treinta y cuatro contaron con características de especies pertenecientes al género Rhizobium en los suelos de
morfológicas pertenecientes al género Rhizobium. esta región Sur del Ecuador.

Palabras claves: aislamientos, morfología, pruebas bioquímicas, Rhizobium

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