Laporan Praktikum KI-3161

Struktur dan Fungsi Biomolekul

Percobaan 4
Kinetika Reaksi Enzimatis

Nama : Faudillah Alhumairah

NIM : 10515040
Kelompok :4
Tanggal Praktikum : 3 Oktober 2017
Tanggal Pengumpulan : 10 Oktober 2017
Asisten : Yovin

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
 Kinetika Reaksi Enzimatis

I. Tujuan percobaan
1. Menentukan parameter kinetika Vmaks dan Km dari reaksi enzimatis.
2. Menentukan aktivitas enzim amilase.

II. Teori dasar

Enzim merupakan suatu protein yang berfungsi sebagai katalis. Enzim dapat
mempercepat laju reaksi pembentukan produk dengan cara menurunkan energi
aktivasi. Enzim mempengaruhi laju pada saat kesetimbangan dicapai tetapi tidak
mempengaruhi kesetimbangn total reaksi.
E + S ↔ ES
ES → P + E
Reaksi enzimatis berlansung melalui pembentukan kompleks enzim substrat
(ES). Apabila enzim berada dalam keadaan ES (system dijenuhkan oleh substrat)
maka laju reaksi akan mencapai nilai maksimum (Vmaks).
Persamaan Michaelis -Menten menyatakan hubungan kuantitatif antara
kecepatan reaksi awal (V0), kecepatan reaksi maksimum (Vmaks), konsentrasi
substrat ([S]) dan konstanta Michaelis-Menten (Km). Pendekatan dengan teori
keadaan tunak menurut Briggs-Haldane menyatakan laju reaksi pembentukan
kompleks ES sama dengan laju reaksi penguraian ES menjadi P dan E. sehingga
diperoleh hubungan laju reaksi enzim dengan konsentrasi substrat.
Vmaks [S]
V0 =
K m + [S}

𝛼-Amilase merupakan enzim glikosil hydrolase (EC. 3.2.1.1) family 13

(GH13). Fungsi 𝛼-Amilase adalah menghidrolisis ikatan 𝛼-1,4- glikosisdik pada pati
menghasilkan campuran oligosakarida dan glukosan dalam jumlah yang kecil.
 Penentuan aktivitas 𝛼-Amilase digunakan metode Fuwa. Metode ini didasarkan pada
berkurangnya intensitas warna yang dibentuk oelh kompleks larutan pati dengan
iodin. Perubahan warna dianalisis spektrofotometri.

III. Data pengamatan

1. Substrat 0.002%
Acontrol = 0.172
Tabel 1. Absorbansi substrat 0.002%

Waktu ∆A
A1 A2 Arata-rata
(s) (Akontrol-Arata-rata)
10 0.056 0.027 0.0415 0.104
20 0.04 0.021 0.0305 0.1275
30 0.031 0.013 0.022 0.146
40 0.026 0.009 0.0175 0.159
50 0.023 0.008 0.0155 0.1655
60 0.021 0.007 0.014 0.1695
70 0.02 0.007 0.0135 0.172
80 0.02 0.007 0.0135 0.173
90 0.019 0.007 0.013 0.1735
100 0.018 0.007 0.0125 0.174
110 0.018 0.006 0.012 0.1745
120 0.018 0.006 0.012 0.1745
130 0.017 0.006 0.0115 0.1745
140 0.017 0.006 0.0115 0.1745
150 0.016 0.006 0.011 0.1745
160 0.016 0.006 0.011 0.1745
170 0.016 0.006 0.011 0.1745
180 0.015 0.006 0.0105 0.1745
190 0.015 0.006 0.0105 0.1745
200 0.015 0.006 0.0105 0.1745
210 0.015 0.006 0.0105 0.1745
220 0.015 0.006 0.0105 0.1745
230 0.015 0.006 0.0105 0.1745
240 0.015 0.006 0.0105 0.1745
250 0.015 0.006 0.0105 0.1745
260 0.015 0.006 0.0105 0.1745
2. Substrat 0.004%
Acontrol = 0.2165
Tabel 2. Absorbansi substrat 0.004%

∆A
Waktu
A1 A2 Arata-rata (Akontrol-Arata-
(s)
rata)
10 0.102 0.013 0.0575 0.159
20 0.056 0.003 0.0295 0.187
30 0.037 0.001 0.019 0.1975
40 0.027 0.001 0.014 0.2025
50 0.023 0.001 0.012 0.2045
60 0.021 0.001 0.011 0.2055
70 0.019 0.001 0.01 0.2065
80 0.018 0.001 0.0095 0.207
90 0.017 0.001 0.009 0.2075
100 0.016 0.001 0.0085 0.208
110 0.015 0.001 0.008 0.2085
120 0.014 0.001 0.0075 0.209
130 0.013 0.001 0.007 0.2095
140 0.012 0.001 0.0065 0.21
150 0.011 0.001 0.006 0.2105
160 0.011 0.001 0.006 0.2105
170 0.011 0.001 0.006 0.2105
180 0.011 0.001 0.006 0.2105
190 0.011 0.001 0.006 0.2105
200 0.011 0.001 0.006 0.2105
210 0.01 0.001 0.0055 0.211
220 0.01 0.001 0.0055 0.211
230 0.01 0.001 0.0055 0.211
240 0.01 0.001 0.0055 0.211
250 0.01 0.001 0.0055 0.211
260 0.01 0.001 0.0055 0.211

3. Substrat 0.006%
Acontrol = 0.1755
 Tabel 3. Absorbansi substrat 0.006%

∆A
Waktu
A1 A2 Arata-rata (Akontrol-Arata-
(s)
rata)
10 0.06 0.083 0.0715 0.104
20 0.034 0.062 0.048 0.1275
30 0.018 0.041 0.0295 0.146
40 0.011 0.022 0.0165 0.159
50 0.007 0.013 0.01 0.1655
60 0.005 0.007 0.006 0.1695
70 0.004 0.003 0.0035 0.172
80 0.003 0.002 0.0025 0.173
90 0.003 0.001 0.002 0.1735
100 0.003 0 0.0015 0.174
110 0.002 0 0.001 0.1745
120 0.002 0 0.001 0.1745
130 0.002 0 0.001 0.1745
140 0.002 0 0.001 0.1745
150 0.002 0 0.001 0.1745
160 0.002 0 0.001 0.1745
170 0.002 0 0.001 0.1745
180 0.002 0 0.001 0.1745
190 0.002 0 0.001 0.1745
200 0.002 0 0.001 0.1745
210 0.002 0 0.001 0.1745
220 0.002 0 0.001 0.1745
230 0.002 0 0.001 0.1745
240 0.002 0 0.001 0.1745
250 0.002 0 0.001 0.1745
260 0.002 0 0.001 0.1745
4. Substrat 0.008%
Acontrol = 0.2345

Tabel 4. Absorbansi substrat 0.008%

∆A
Waktu (s) A1 A2 Arata-rata
(Akontrol-Arata-rata)
10 0.055 0.031 0.043 0.1915
20 0.017 0.014 0.0155 0.219
30 0.01 0.01 0.01 0.2245
40 0.008 0.008 0.008 0.2265
50 0.007 0.007 0.007 0.2275
60 0.006 0.007 0.0065 0.228
70 0.006 0.007 0.0065 0.228
80 0.006 0.006 0.006 0.2285
90 0.006 0.006 0.006 0.2285
100 0.005 0.006 0.0055 0.229
110 0.005 0.006 0.0055 0.229
120 0.005 0.007 0.006 0.2285
130 0.006 0.006 0.006 0.2285
140 0.006 0.006 0.006 0.2285
150 0.005 0.006 0.0055 0.229
160 0.005 0.005 0.005 0.2295
170 0.005 0.005 0.005 0.2295
180 0.005 0.005 0.005 0.2295
190 0.005 0.005 0.005 0.2295
200 0.005 0.005 0.005 0.2295
210 0.005 0.005 0.005 0.2295
220 0.005 0.005 0.005 0.2295
230 0.005 0.005 0.005 0.2295
240 0.005 0.005 0.005 0.2295
250 0.005 0.005 0.005 0.2295
260 0.005 0.005 0.005 0.2295

5. Substrat 0.01%
Acontrol = 0.299
 Tabel 5. Absorbansi substrat 0.01%

∆A
Waktu (s) A1 A2 Arata-rata
(Akontrol-Arata-rata)
10 0.153 0.132 0.1425 0.1565
20 0.106 0.065 0.0855 0.2135
30 0.068 0.039 0.0535 0.2455
40 0.041 0.026 0.0335 0.2655
50 0.028 0.019 0.0235 0.2755
60 0.019 0.015 0.017 0.282
70 0.013 0.013 0.013 0.286
80 0.011 0.011 0.011 0.288
90 0.009 0.009 0.009 0.29
100 0.009 0.009 0.009 0.29
110 0.009 0.008 0.0085 0.2905
120 0.008 0.008 0.008 0.291
130 0.007 0.008 0.0075 0.2915
140 0.006 0.007 0.0065 0.2925
150 0.006 0.007 0.0065 0.2925
160 0.006 0.006 0.006 0.293
170 0.006 0.006 0.006 0.293
180 0.006 0.006 0.006 0.293
190 0.006 0.006 0.006 0.293
200 0.006 0.006 0.006 0.293
210 0.006 0.006 0.006 0.293
220 0.006 0.006 0.006 0.293
230 0.005 0.005 0.005 0.294
240 0.005 0.005 0.005 0.294
250 0.006 0.005 0.0055 0.2935
260 0.006 0.005 0.0055 0.2935

IV. Pengolahan Data

Dari data pengamatan absorbansi tiap satuan waktu pada sampel diperoleh kurva
Gambar 1.
 Grafik Absorbansi terhadap waktu
0.35 y1= 6E-05x + 0.1493
R² = 0.4664
0.3
y2 = 9E-05x + 0.1936
0.25 R² = 0.4

0.2
y3 = 0.0001x + 0.149
R² = 0.3909
∆A

0.15
y4 = 5E-05x + 0.2202
0.1 R² = 0.2547

0.05 y5 = 0.0003x + 0.2453

R² = 0.4003
0
0 50 100 150 200 250 300

Waktu
konsentrasi 0.002% konsentrasi 0.004% konsentrasi 0.006%

konsentrasi 0.008% konsentrasi 0.01%

Keterangan: y1, y2, y3, y4, y5 merupakan persamaan garis dari konsentrasi substrat
0.002%, 0.004%, 0.006%, 0.008% dan 0.01%
Gambar 1. Grafik A terhadap waktu

Berdasarkan grafik, diperoleh V0 pada masing-masing substrat seperti Tabel 6.

Tabel 6. Kecepatan awal
Konsentrasi substrat Kecepatan awal 1 1
(%) (M/s) [𝑆] V
0.002 6 x 10-5 500 1.67 x 104
0.004 9 x 10-5 250 1.11 x 104
0.006 1 x 10-4 166.6667 1.00 x 104
0.008 5 x 10-5 125 2.00 x 104
0.01 3 x 10-4 100 3.33 x 104
 Grafik Lineweaver-Burk
2.50E+04

2.00E+04

1.50E+04

1/V
1.00E+04
y = 15.751x + 8625.6
5.00E+03
R² = 0.1578
0.00E+00
0 100 200 300 400 500 600
1/[𝑆]

Gambar 2. Grafik Lineweaver-Burk

Dari grafik diatas didapatkan persamaan regresi sebagai berikut:

1 1 Km 1
= V maks + V maks [S],
V

y = 15.751x + 8625.6
Sehingga didapatkan bahwa,
Vmaks = 1.1593 x 10-4 M/s
Km = 1.8260 x 10-3

Penentuan Aktivitas 𝜶-Amilase

Grafik Absorbansi Maksimum Terhadap [S]

0.35
0.3
0.25
Amaks

0.2
0.15 y = 14.175x + 0.1291
0.1 R² = 0.7329
0.05
0
0 0.002 0.004 0.006 0.008 0.01 0.012
[S]

Gambar 3. Hubungan absorbansi maksimum dan [S]

 Dari grafik diatas didapatkan persamaan regresi sebagai berikut:
A = ∈b x b x C, b = 1 cm
y = 14.175x + 0.1291
diperoleh ∈b = 14.175

V0 Vtotal aktivitas
Aktivitas 𝛼 -amilase = ∈b x Venzim , Aktivitas spesifik = ]enzim]

Pada saat [S] = 0.002% , V0 = 6 x 10-5 M/s

6 x 10−5 1000
Aktivitas 𝛼 -amilase = x = 3.5273 x 10-5
14.175 120
3.5273 𝑥 10^−5
Aktivitas spesifik = = 1.8873 x 10-7
186.9

Dengan cara yang sama diperoleh Tabel 7.

Tabel 7. Aktivitas 𝛼 -Amilase

Konsentrasi substrat Kecepatan awal Aktivitas 𝛼- Aktivitas

(%) (M/s) Amilase Spesifik
0.002 6 x 10-5 3.5273 x 10-5 1.8873 x 10-7
0.004 9 x 10-5 5.2910 x 10-5 2.8309 x 10-7
0.006 1 x 10-4 5.8789 x 10-5 3.1455 x 10-7
0.008 5 x 10-5 2.9395 x 10-5 1.5728 x 10-7
0.01 3 x 10-4 1.7637 x 10-4 9.4366 x 10-7

VII. Pembahasan
Enzim merupakan protein yang berperan sebagai biokatalisis. Adanya
penambahan enzim dalam reaksi kimia akan mempercepat laju reaksi pembentukan
produk tanpa mengalami perubahan kimiawi. Reaksi dapat berjalan dengan cepat
karena dengan ada penmbahan enzim energi aktivasi akan menurun. Enzim dapat
menurunkan energi aktivasi dengan menyediakan jalur alternatif yang menghindari
tahap lambat atau penentu laju pada reaksi tanpa katalis dengan cara pembentukan
keadaan transisi.
 Laju awal dari reaksi yang dikatalisis enzim meningkat dengan bertambahnya
konsnetrasi substrat hingga dicapai keadaan yang penambahan substrat tidak
mempengaruhi laju reaksi. Laju reaksi pada keadaan ini merupakan laju reaksi
maksimum. Laju maksimum tercapai saat system dijenuhkan oleh substrat.
Enzim yang digunakan pada percobaan ini adalah 𝛼-Amilase. 𝛼-Amilase
merupakan salah satu enzim hidrolase. 𝛼-amilase berfungsi mengidrolisis ikatan 𝛼-
1,4- glikosisdik pada pati. Amilase terbagi menjadi dua kelas yaitu endoamilase dan
eksoamilase. Endoamilase memutuskan ikatan 𝛼-1,4- glikosisdik bagian dalam pati
dengan menghasilkan produk oligosakarida berbagai ukuran. Sedangkan,
eksoamilase memetuskan ikatan 𝛼-1,4- glikosisdik dari ujung pereduksi pati dengan
produk hanya berupa glukosa atau maltosa. Kemapuan 𝛼-Amilase untuk
menhidrolisis pati dapat ditentukan dengan pengujian aktivitas enzim.
Aktivitas 𝛼-Amilase dapat ditentukan dengan dua metode yaitu metode DNS
dan metode Fuwa. Metode DNS berdasarkan prinsip reduksi-oksidasi. Oligosakarida
hasil hidrolisis mengandung gugus pereduksi yang akan mereduksi asam dinitro
salisilat. Proses reduksi ini akan menghasilkan perubahan warna dari kuning menjadi
jingga. Perubahan warna ini dapat ditentukan absorbansinya dengan menggunakan
spektrofotometer pada pengukuran panjang gelombang 500 nm.
Pada percobaan ini dilakukan penentuan aktivitas 𝛼-Amilase dengan
menggunakan metode Fuwa. Pati yang digunakan sebagai substrat terlebih dahulu
direaksikan dengan I2 sehingga akan membentuk kompleks. Kompleks pati-I2
berwarna biru sedangkan larutan iodin berwarna kuning. Kompleks yang terbentuk
ditambahkan 𝛼-Amilase. Pati yang terdapat pada kompleks akan terhidrolisis
sehingga konsentrasi kompleks berkurang. Pengurangan konsentrasi kompleks akan
membuat intensitas warna larutan berkurang. Perubahan intensitas warna akan
dianalisis dengan menggunakan spectrometer pada panjang gelombang 600 nm.
 Gambar. Struktur pati-iod
Sumber: http:// http://digilib.itb.ac.id/files/disk1/683/jbptitbpp-gdl-
lulusetiya-34147-3-2009ta-2.pdf
𝛼-Amilase memiliki gugus asam glutamate (Glu) dan asam aspartat (Asp)
pada sisi aktif. Mekanisme pemutusan ikatan 𝛼-1,4- glikosisdik pada substrat terjadi
secara bertahap. Substrat (pati) terikat pada sisi aktif enzim. Proton dari asam
glutamat (Glu) diserahkan ke atom oksigen substrat yang terikat pada C1. Asam
aspartat berfungsi sebagai nukleofil dan menyerang atom C1 pada substrat dan
membentuk ion oksokarbanium. Reaksi tersebut diikuti dengan pembentukan
intermediet. Glukosa yang terprotonasi terlepas dari sisi aktif dan menyerang ikatan
antara glukosa dan residu asam aspartat. Residu asam glutamat berfungsi sebagai
katalis basa yang menarik proton pada molekul air. Oksigen dari molekul air akan
menggantikan ikatan oksokarbanium.
I2 tidak larut dalam air tetapi larut didalam KI. Sehingga pada percobaan
digunakan I2 dalam KI. kontrol yang digunakan terdiri dari substrat, lautan HCl,
larutan I2/KI dan enzim. Penggunaan asam klorida berfungsi untuk mendenaturasi
enzim sehingga tidak terjadi hidrolisis terhadap pati. Sedangkan, komposisi yang
terdapat pada larutan sampel yaitu subsrat, air , larutan I2/KI dan enzim. Air
digunakan untuk membantu dalam proses hidrolisis.
Dengan mengalurkan waktu terhadap absorbansi didapatkan persamaan
regresi yang sloe dari persamaan tersebut merupakan kecepatan awal untuk masing-
masing konsentrasi substrat. Untuk menentukan Vmaks dan Km diperoleh dari 𝛼-
Amilase dibuat grafik 1/V0 terhadap 1/[S]. Km merupakan konstanta Michaelis-
 Menten yang menunjukan kemampuan enzim berinteraksi dengan substrat. Km
tergantung pada jenis substrat dan kondisi lingkungan seperti pH, suhu dan kekuatan
ionik. Nilai Km yang tinggi menunjukan ikatan yang lemah antara enzim dan substrat
sehingga kinerja enzim kurang baik sedangkan nilai Km yang rendah menunjukan
ikatan enzim dan substrat yang kuat sehingga kinerja enzim baik.
Berdasarkan percobaan yang dilakukan diperoleh nilai Vmaks 1.1593 x 10 -4
M/s dan Km 1.8260 x 10-3. Untuk menentukan aktivitas enzi diplotkan grafik antara
absorbansi maksimum terhadap konsentrasi substrat. Aktivitas enzim 𝛼 -Amilase
untuk setiap substrat berbeda-beda. Nilai aktivitas enzim 𝛼- Amilase terdapat pada
Tabel 7.

VIII. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan diperoleh nilai Vmaks dan Km yaitu
1.1593 x 10-4 M/s dan 1.8260 x 10-3. Sedangkan aktivitas enzim 𝛼- Amilase dengan
konsentrasi substrat 0.002%, 0.004%, 0.006%, 0.008% dan 0.01% berturut-turut
yaitu 3.5273 x 10-5 ; 5.2910 x 10-5; 5.8789 x 10-5; 2.9395 x 10-5; dan 1.7637 x 10-4.

IX. Daftar pustaka

Fuwa H., A new Method for Microdetermination of Amylase Activity by Use
Amylose as the Substrate, The Journal of Biochemistry, vol. 41, No.5, 1954.
Girinda, A. 1986. Biokimia 1. Gramedia: Jakarta.
Lechninger, A. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga: Jakarta.