Laporan Praktikum KI-3161

Struktur dan Fungsi Biomolekul

Percobaan 2
Penentuan Kadar Protein Secara Lowry

Nama : Faudillah Alhumairah

NIM : 10515040
Tanggal Praktikum : 26 September 2017
Tanggal Pengumpulan : 3 Oktober 2017
Asisten : Ode (20517034)

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
 Penentuan Kadar Protein Secara Lowry

I. Tujuan percobaan
1. Menentukan kadar protein dalam sampel dengan metode Lowry.
2. Menentukan berat molekul sampel protein dengan SDS-PAGE.

II. Teori dasar

Protein merupakan polimer dari asam-asam amino yang dihubungkan dengan
ikatan peptida atau disebut juga ikatan amida. Untuk menentukan konsentrasi atau
kadar dari protein dapat dilakukan dengan berbagai metode diantanya metode
Kjeldahl, Biuret, Bradford dan Lowry. Metode Kjeldahl merupakan metode yang
penentuan kadar protein dilakukan dengan menentukan nitrogen total pada asam
amino. Bahan yang ingin dianalisis didestruksi dengan asam sulfat pekat
menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Ammonia yang diperoleh
ditampung dan dititrasi. Metode Kjeldahl banyak diaplikasikan pada penentuan kadar
protein pada makanan. Metode ini akurat untuk penentuan kadar protein kasar. Akan
tetapi, atom nitrogen yang diukur bisa saja tidak hanya berasal dari protein.
Metode Biuret digunakan untuk mendeteksi adanya ikatan peptida. Kompleks
Cu-protein yang terbentuk akan berwarna ungu. Larutan yang berwarna ungu ini
diukur absorbansinya menggunakan spektrometer. Absorbansi yang diperoleh akan
sebanding dengan konsentrasi protein. Waktu yang dibutuhkan untuk analisis dengan
menggunakan metode Biuret lebih cepat, substansi lain yang terdeteksi sangat sedikit,
dan ikatan yang bukan peptida tidak akan terdeteksi. Akan tetapi, metode Biuret
kurang sensitif dibandingkan dengan metode Lowry dan penyimpangan warna dapat
terjadi pada larutan yang mengandung kadar lemak dan karbohidrat yang tinggi.
Metode Bradfod didasarkan pada pengikatan zat warna Coomassie Blue G-
250 dengan protein. Zat warna ini memilki empat formasi ion yang berbeda. Kation
dari zat warna ini berwarna merah dan hijau. Sedangkan, anion dari zat warna ini
berwarna biru. Pengukuran protein dilakukan dengan menentukan jumlah zat warna
 dalam bentuk anion (biru) yang dilakukan dengan mengukur absorbansi larutan pada
panjang gelombang 595 nm. Waktu analisis dengan metode Bradford lebih cepat,
kompleks warna biru yang terbentuk bersifat stabil dan dapat mengukur protein
dengan berat molekul lebih dari 4000 dalton. Akan tetapi, adanya variasi warna
menyebabkan pemilihan standar protein harus lebih hati-hati. Selain itu, kompleks
protein yang diperoleh dapat berikatan dengan kuvet dari kwarsa dan absorbansi
larutan dapat terpengaruh dengan adanya senyawa ionik ataupun non-ionik.
SDS-PAGE atau Sodium Dodecil Sulphate Polyacrilamide Gel
Electrophoresis merupakan salah satu metode yang digunakan untuk menentukan
berat molekul protein. SDS merupakan detergen ionik yang dapat melarutkan
molekul hidrofobik dan memberikan muatan negatif pada keseluruhan struktur
protein. SDS-PAGE bekerja dengan menghambat interaksi hidrofobik dan merusak
ikan hidrogen.

III. Data pengamatan

𝜆 = 700 nm
Tabel 1. Data pengamatan penentuan kadar protein
Nomor Tabung
Penambahan (mL)
1 2 3 4 5 6 7
Standar BSA (200μg/mL) - 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 -
Sampel protein - - - - - - 0.5
H2O 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 - -
Reagen biuret 2 2 2 2 2 2 2
Reagen fenol 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
A700nm (1) 0 0.092 0.178 0.249 0.331 0.386 0.195
A700nm (2) 0 0.062 0.188 0.256 0.176 0.265 0.199
 Gambar 1. Pengamatan hasil reaksi Lowry

Pita 5

Pita 4
Pita 3

Pita 2

Pita 1

Gambar 2. Pita marker Gambar 3. Hasil SDS-PAGE

 Keterangan Gambar 3:
Dari kiri ke kanan yaitu marker, BSA standar, fraksi 50-70%, fraksi 20-50%

Sumber Gambar 2: https://www.fishersci.co.uk/shop/products/pageruler-prestained-10-170kda-

protein-ladder/11812124

IV. Pengolahan Data

Dari data absorbansi standar (1) yaitu pada tabung 2 sampai dengan tabung 6 dibuat
kurva kalibrasi aborbansi standard terhadap konsentrasi standar. Penentuan
konsentrasi standar menggunakan persamaan:
M[std]V[std+air] = M[BSA]V[BSA] M[BSA] = 200 μg/mL, V[std+air] = 0.5 mL
Pada tabung 2 konsentrasi standar yaitu:
200𝜇g
M[BSA]V[BSA] x 0.1 mL
ml
M[std] = = = 40 μg/mL ,
V[std+air] 0.5 mL

Dengan perhitungan yang sama diperoleh konsentrasi standar pada tabung 3 sampai
6 pada Tabel 2.
Tabel 2. Konsentrasi Standar
Tabung 2 3 4 5 6
Konsentrasi (μg/mL) 40 80 120 160 200

Kurva Kalibrasi Standar

0.45
0.4
0.35
0.3 y = 0.0019x + 0.0249
Absorbansi

0.25 R² = 0.9953
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250
M[std] (μg)

Gambar 4. Kurva kalibrasi standar

Kadar protein sampel dapat dihitung dengan menstubsitusi nilai absorbansi sampel
(A = 0.195) kedalam persamaan garis y = 0.0019x + 0.0249 ( y merupakan absorbansi,
x merupakan konsentrasi)
y = 0.0019x + 0.0249
0.195 = 0.0019x + 0.0249
x = 89.53
Jadi, kadar protein yang terdapat didalam sampel yaitu 89.53 μg/mL.
Kadar protein didalam sampel secara teoritis yaitu 80 μg/mL, maka diperoleh persen
kesalahan yaitu :
μg
|hasil percobaan−hasil sebenarnya| |89.53 − 80 μg/mL|
mL
% kesalahan = . 100 = . 100 = 11.9
|hasil sebenarnya| 80 μg/mL

SDS-PAGE
Dari Gambar 3 dapat diperoleh berat molekul dari masing-masing fraksi dengan
membandingkan dengan Gambar 2.
1. Fraksi 20-50%
Tabel 3. Berat molekul fraksi 20-50%
Pita Berat molekul (kDa)
1 10
2 35
3 55
4 70
5 250

2. Fraksi 50-70%
Tabel 4. Berat molekul fraksi 50-70%
Pita Berat molekul (kDa)
1 10
2 35
 3 55

3. BSA standar
Tabel 5. Berat molekul BSA standar
Pita Berat molekul (kDa)
3 55
4 70
5 250

VII. Pembahasan
Pada percobaan ini dilakukan penentuan kadar protein yang terdapat didalam
sampel dengan menggunakan metoda Lowry. Penentuan kadar protein dengan
metoda Lowry menggunakan dua reagen yaitu reagen Biuret dan reagen Folin-
Ciocalteu. Ion Cu2+ yang terdapat didalam reagen Biuret akan membentuk kompleks
dengan ikatan peptida pada protein. Kompleks Cu-protein yang terbentuk akan
menyebabkan fosfotungstat dan fosfomolibdat yang terdapat pada reagen Folin-
Ciocalteu tereduksi dan Cu akan teroksidasi dari Cu2+ menjadi Cu+. Selain itu,
adanya residu tirosin dan triptofan juga dapat mereduksi fosfotungstat dan
fosfomolibdat. Sekitar 75% reduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat dilakukan oleh
kompleks Cu-potein sedangkan 25% lainnya direduksi oleh tirosin dan triptofan.
Hasil dari reduksi fosfotungstat dan fosfomolibdat adalah tungsten dan molibdenum
yang berwarna biru. Banyaknya produk tungsten dan molibdenum yang dihasilkan
berbanding lurus dengan banyaknya residu protein. Semakin pekat warna biru yang
dihasilkan, semakin banyak produk tungsten dan molibdenum yang dihasilkan dan
semakin tinggi juga konsentrasi protein yang terkadung didalam larutan.
Selanjutnya, larutan yang berwarna biru akan dianalisis secara spektrofotometri
pada panjang gelombang 700 nm.
 Gambar 5. Kompleks Cu-protein

Gambar 6. Reaksi oksidasi tirosin

Gambar 7. Reduksi pereaksi Folin-Ciocalteu oleh senyawa Fenol (gugus R

dari tirosin)

Sebelum dilakukan pengukuran absorbansi dari sampel protein terlebih

dahulu dilakukan pengukaran absorbansi dari larutan protein standar. Protein
standar yang digunakan yaitu BSA (Bovine Serum Albumin) yang merupakan
serum darah sapi. Tujuan dari pengukuran absorbansi standar yaitu agar dapat
ditentukan kadar protein sampel menggunakan kurva kalibrasi standar protein.
Berdasarkan percobaan yang dilakukan diperoleh kadar protein dalam sampel
yaitu 89.53 μg/mL. Sedangkan, kadar protein dalam sampel secara teoritis
80μg/mL sehingga kesalahan yang dilakukan 11.9%. Kesalahan yang timbul
diakibatkan karena pada saat pengukuran absorbansi, kuvet yang digunakan tidak
dibersihkan terlebih dahulu. Hal ini menyebabkan absorbansi yang diukur bukan
dari konsentrasi protein teoritis (konsentrasi protein yang diukur lebih besar dari
konsentrasi protein teoritis).
Metode lain yang dapat digunakan untuk menentukan kadar protein
diantaranya metode Kjeldahl, metode Biuret, dan motede Bradford. Kelebihan dari
menggunakan metode Lowry dibandingkan metode lainnya yaitu metode Lowry
dapat mendeteksi konsentrasi protein sampai 0.01 mg/mL (sangat sensitif) dan
kurang dipengaruhi turbiditas. Sedangkan kelemahan dari metode Lowry ini yaitu
jika ada senyawa fenol yang bukan berasal dari protein juga bisa menghasilkan
warna biru, hanya dapat mengukur kadar protein pada konsentrai rendah dan reaksi
dapat dipengaruhi oleh adanya sukrosa, lipid, buffer fosfat, monosakarida dan
heksoamin. Pada industri pengukuran kadar protein biasanya digunakan metode
Kjeldahl.
Protein dapat diidentifikasi dan dikarakterisasi menggunakan metode
elektroforesis SDS-PAGE. Elektroforesis merupakan salah satu teknik untuk
memisahkan protein dengan menggunakan media berpori dan bermedan listrik.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrilamide Gel Electrophoresis)
merupakan teknik elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamida untuk
memisahkan protein berdasarkan berat molekul. Penambahan SDS akan membuat
protein bermuatan negatif dan mempermudah menyamakan kondisi protein.
Didalam SDS-PAGE digunakan stacking gel dan separating gel. Stacking gel
berfungsi untuk mencetak sumur yang digunakan untuk memekatkan protein
menjadi satu jalur yang sempit sebelum protein memasuki separating gel. Selain itu,
juga berfungsi sebagai penahan protein sementara agar protein bermigrasi
 bersamaan. Separating gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat
molekulnya.
Protein yang ukurannya lebih besar akan tertahan di gel, sedangkan protein
yang memiliki ukuran lebih kecil akan termobilisasi menuju anoda sehingga jarak
migrasinya lebih jauh. Untuk melihat jalannya elektroforesis dilakukan pewarnaan
atau staining gel. Jarak migrasi yang terlihat menggambarkan berat molekul protein.
Fraksi 20-50% memiliki lima pita dengan berat molekul 10 kDa, 35 kDa, 55 kDa,
70 kDa dan 250 kDa secara berurutan dari bawah ke atas. Sedangkan fraksi 50-70%
memiliki tiga pita dengan berat molekul 10 kDa, 35 kDa dan 55 kDa secara
berurutan dari bawah ke atas. BSA standar digunakan untuk membandingkan pita
yang diperoleh pada percobaan dengan pita albumin teoritis. Pita yang dihasilkan
dari BSA memiliki berat molekul 55 kDa, 70 kDa dan 250 kDa. Adanya pita yang
diperoleh dari fraksi tetapi pita tersebut tidak ditemukan pada BSA standar, hal ini
dapat disebabkan karena konsentrasi BSA standar yang digunakan sedikit sehingga
pita yang dihasilkan tidak jelas.

VIII. Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang dilakukan, diperoleh kadar protein dalam sampel
dengan menggunakan metode Lowry yaitu 89.53 μg/mL. Berat protein yang terdapat
didalam fraksi 20-50% dari hasil SDS-PAGE adalah 10 kDa, 35 kDa, 55 kDa, 70 kDa
dan 250 kDa secara berurutan dari bawah ke atas. Sedangkan fraksi 50-70% memiliki
tiga pita dengan berat molekul 10 kDa, 35 kDa dan 55 kDa secara berurutan dari
bawah ke atas.

IX. Daftar pustaka

Girinda, A. 1986. Biokimia 1. Gramedia: Jakarta.
Lechninger, A. 1982. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Erlangga: Jakarta.
Lowry, D., Rosebrough, N., Fair, L., Randall, R. (1951). Protein Measurement with
the Folin Phenol Reagent. The Journal of Biological Chemistry. page 265-275.