Kromatografi

KROMATOGRAFI

Pengertian Kromatografi
Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan perbedaan pola
pergerakan antara fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen (berupa molekul)
yang berada pada larutan.
Kromatografi adalah suatu cara pemisahan dimana komponen-komponen yang akan
dipisahkan didistribusikan antara 2 fase, salah satunya yang merupakan fase stasioner (diam),
dan yang lainnya berupa fasa mobil (fasa gerak).
Kromatografi adalah teknik pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan
perambatan komponen dalam medium tertentu.
Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi komponennya
dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen
Prosedur pemisahan zat terlarut oleh suatu proses migrasi diferensial dinamis dalam
sistem yang terdiri dari dua fase atau lebih, salah satu diantaranya bergerak secara
berkesinambungan dalam arah tertentu dan di dalamnya zat-zat itu menunjukkan perbedaan
mobilitas disebabkan adanya perbedaan dalam absorpsi, partisi, kelarutan, tekanan uap,
ukuran molekul atau kerapatan muatan ion dinamakan kromatografi sehingga masing-masing
zat dapat diidentifikasi atau ditetapkan dengan metode analitik (Anonim, 1995).
Dari beberapa pengertian tersebut, maka dapat diambil sebuah kesimpulan bahwa
kromatografi adalah teknik analisis yang diterapkan untuk memisahkan komponen-
komponen dalam campuran berdasarkan 2 jenis fase yaitu fase diam (stationer) dan fase
gerak (mobil).
 2.2 Sejarah penemuan Kromatografi
Perkembangan kimia modern dengan teknik pemisahan yang cepat, tidak dapat
terlaksana bila tidak adanya ilmuan yang menemukannya. Kromatografi merupakan salah
satu alat yang ada dalam perkembangan kimia modern, sehingga suatu analisis dapat
dilakukan dengan cepat dan baik.
Di awal abad ke-20, kimiawan Rusia Mikhail Semënovich Tsvet (1872-1919)
menyiapkan kolom yang diisi dengan serbuk kalsium karbonat, dan kedalamnya dituangkan
campuran pigmen tanaman yang dilarutkan dalam eter. Secara mengejutkan, pigmen
memisahkan dan membentuk lapisan berwarna di sepanjang kolom. Ia menamakan
kromatografi pada teknik pemisahan baru ini (1906). Kemudian kimiawan dari Swiss Richard
Martin Willstätter (1872-1942) menerapkan teknik ini untuk risetnya yakni khlorofil untuk
menunjukkan manfaat teknik ini, dan sejak itu banyak perhatian diberikan pada kromatografi.
Dan untuk Kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Izmailoff dan Schraiber pada
tahun 1938. Serta Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah
orang pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas.
Saat campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena
kapiler, partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada
selulosa berlangsung berulang-ulang. Ketiak pelarut mencapai ujung atas kertas proses
dihentikan. Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R,
masing-masing asam amino diidentifikasi.

2.3 Klasifikasi Kromatografi

Kromatografi dibagi menjadi beberapa jenis bergantung pada jenis fasa mobil dan
mekanisme pemisahannya.
Secara umum, fase gerak (mobil):
a. Kromatografi Cair (Liquid Chromatography)
Kromatografi cair merupakan teknik yang tepat untuk memisahkan ion atau molekul
yang terlarut dalam suatu larutan. Jika larutan sampel berinteraksi dengan fase stasioner,
maka molekul-molekul didalamnya berinteraksi dengan fase stasioner; namun interaksinya
berbeda dikarenakan perbedaan daya serap (adsorption), pertukaran ion (ion exchange),
partisi (partitioning), atau ukuran. Perbedaan ini membuat komponen terpisah satu dengan
 yang lain dan dapat dilihat perbedaannya dari lamanya waktu transit komponen tersebut
melewati kolom. Terdapat beberapa jenis kromatografi cair, diantaranya: reverse phase
chromatography, High Performance Liquid Chromatography (HPLC), size exclusion
chromatography, serta supercritical fluid chromatography.
Reverse phase chromatography

Reverse phase chromatography merupakan alat analitikal yang kuat dengan memadukan sifat
hidrofobik serta rendahnya polaritas fase stasioner yang terikat secara kimia pada padatan
inert seperti silika.Metode ini biasa digunakan untuk proses ekstraksi dan pemisahan senyawa
yang tidak mudah menguap (non-volatile).

High performance liquid chromatography

High performance liquid chromatography (HPLC) mempunyai prinsip yang mirip dengan
reverse phase. Hanya saja dalam metode ini, digunakan tekanan dan kecepatan yang tinggi.
Kolom yang digunakan dalam HPLC lebih pendek dan berdiameter kecil, namun dapat
menghasilkan beberapa tingkatan equilibrium dalam jumlah besar.

Akhir-akhir ini, untuk pemurnian (misalnya untuk keperluan sintesis) senyawa organik skala
besar, HPLC (high precision liquid chromatography atau high performance liquid
chromatography) secara ekstensif digunakan. Bi la zat melarut dengan pelarut yang cocok, zat
tersebut dapat dianalisis. Ciri teknik ini adalah penggunaan tekanan tinggi untuk mengirim
fasa mobil kedalam kolom. Dengan memberikan tekanan tinggi, laju dan efisiensi pemisahan
dapat ditingkatkan dengan besar.

Silika gel atau oktadesilsilan yang terikat pada silika gel digunakan sebagai fasa stationer. Fasa
stationer cair tidak populer. Kolom yang digunakan untuk HPLC lebih pendek daripada kolom
yang digunakan untuk kromatografi gas. Sebagian besar kolom lebih pendek dari 1 m.

Size exclusion chromatography

Size exclusion chromatography, atau yang dikenal juga dengan gel permeation atau filtration
chromatography biasa digunakan untuk memisahkan dan memurnikan protein. Metode ini
tidak melibatkan berbagai macam penyerapan dan sangat cepat. Perangkat kromatografi
berupa gel berpori yang dapat memisahkan molekul besar dan molekul kecil. Molekul besar
akan terelusi terlebih dahulu karena molekul tersebut tidak dapat penetrasi pada pori-pori.

b. Kromatografi Gas
 Campuran gas dapat dipisahkan dengan kromatografi gas. Fasa stationer dapat berupa
padatan (kromatografi gas-padat) atau cairan (kromatografi gas-cair).
Umumnya, untuk kromatografi gas-padat, sejumlah kecil padatan inert misalnya karbon
teraktivasi, alumina teraktivasi, silika gel atau saringan molekular diisikan ke dalam tabung
logam gulung yang panjang (2-10 m) dan tipis. Fasa mobil adalah gas semacam hidrogen,
nitrogen atau argon dan disebut gas pembawa. Pemisahan gas bertitik didih rendah seperti
oksigen, karbon monoksida dan karbon dioksida dimungkinkan dengan teknik ini.
Dalam kasus kromatografi gas-cair, ester seperti ftalil dodesilsulfat yang diadsorbsi di
permukaan alumina teraktivasi, silika gel atau penyaring molekular, digunakan sebagai fasa
diam dan diisikan ke dalam kolom. Campuran senyawa yang mudah menguap dicampur
dengan gas pembawa disuntikkan ke dalam kolom, dan setiap senyawa akan dipartisi antara
fasa gas (mobil) dan fasa cair (diam) mengikuti hukum partisi. Senyawa yang kurang larut
dalam fasa diam akan keluar lebih dahulu.
Metoda ini khususnya sangat baik untuk analisis senyawa organik yang mudah
menguap seperti hidrokarbon dan ester. Analisis minyak mentah dan minyak atsiri dalam
buah telah dengan sukses dilakukan dengan teknik ini.
Efisiensi pemisahan ditentukan dengan besarnya interaksi antara sampel dan
cairannya. Disarankan untuk mencoba fasa cair standar yang diketahui efektif untuk berbagai
senyawa. Berdasarkan hasil ini, cairan yang lebih khusus kemudian dapat dipilih. Metoda
deteksinya, akan mempengaruhi kesensitifan teknik ini. Metoda yang dipilih akan bergantung
apakah tujuannya analisik atau preparatif.

Komponen alat kromatografi gas

Alat GLC atau GC terdiri atas 7 bagian yang pokok seperti pada gambar, yaitu:
1. Silinder tempat gas pembawa/pengangkut
2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan
3. Tempat injeksi cuplikan
4. Kolom
5. Detector
6. Pencatat
7. Terminal untuk 3, 4 dan 5
1. Gas pengangkut/pemasok gas
 Gas pengangkut (carrier gas) ditempatkan dalam silinder bertekanan tinggi. Biasanya
tekanan dari silinder sebesar 150 atm. Tetapi tekanan ini sangat besar untuk digunakan
secara Iansung.
Gas pengangkut harus memenuhi persyaratan :
a. Harus inert, tidak bereaksi dengan cuplikan, cuplikan-pelarut, dan material dalam kolom.
b. Murni dan mudah diperoleh, serta murah.
c. Sesuai/cocok untuk detektor.
d. Harus mengurangi difusi gas
Gas-gas yang sering dipakai adalah : helium, argon, nitrogen, karbon dioksida dan
hidrogen. Gas helium dan argon sangat baik, tidak mudah terbakar, tetapi sangat mahal.
H2 mudah terbakar, sehingga harus berhati-hati dalam pemakaiannya. Kadang-kadang
digunakan juga C02.
Pemilihan gas pengangkut atau pembawa ditentukan oleh ditektor yang digunakan.
Tabung gas pembawa dilengkapi dengan pengatur tekanan keluaran dan pengukur tekanan.
Sebelum masuk ke kromatografi, (harusnya) ada pengukur kecepatan aliran gas serta sistem
penapis molekuler untuk memisahkan air dan pengotor gas lainnya. Pada dasarnya
kecepatan alir gas diatur melalui pengatur tekanan dua tingkat yaitu pengatur kasar (coarse)
pada tabung gas dan pengatur halus (fine) pada kromatograf. Tekanan gas masuk ke
kromatograf (yaitu tekanan dari tabung gas) diatur pada 10 s.d 50 psi (di atas tekanan
ruangan) untuk memungkinkan aliran gas 25 s.d 150 mL/menit pada kolom terpaket dan 1
s.d 25 mL/menit untuk kolom kapiler.

2. Pengatur aliran dan pengatur tekanan

Ini disebut pengatur atau pengurang Drager. Drager bekerja baik pada 2,5 atm, dan
mengalirkan massa aliran dengan tetap. Tekanan lebih pada tempat masuk dari kolom
diperlukan untuk mengalirkan cuplikan masuk ke dalam kolom. Ini disebabkan, kenyataan
lubang akhir dari kolom biasanya mempunyai tekanan atmosfir biasa. Juga oleh kenyataan
bahwa suhu kolom adalah tetap, yang diatur oleh thermostat, maka aliran gas tetap yang
masuk kolom akan tetap juga.
Demikian juga komponen-komponen akan dielusikan pada waktu yang tetap yang
disebut waktu penahanan (the retention time), t R. Karena kecepatan gas tetap, maka
 komponen juga mempunyai volume karakteristik terhadap gas pengangkut = volume
penahanan (the retention volume), v r. Kecepatan gas akan mempengaruhi effisiensi kolom.
Harga-harga yang umum untuk kecepatan gas untuk kolom yang memiliki diameter
luar.
1/4" O.D : kecepatan gas 75 ml/min
1/8" O.D : kecepatan gas 25 ml/min.

3. Tempat injeksi (The injection port)

Dalam pemisahan dengan GLC cuplikan harus dalam bentuk fase uap. Gas dan uap
dapat dimasukkan secara langsung. Tetapi kebanyakan senyawa organik berbentuk cairan
dan padatan. Hingga dengan demikian senyawa yang berbentuk cairan dan padatan
pertama-tama harus diuapkan. Ini membutuhkan pemanasan sebelum masuk dalam kolom.
Panas itu terdapat pada tempat injeksi seperti pada gambar 9. bagan injektor.

Tempat injeksi dari alat GLC selalu dipanaskan. Dalam kebanyakan alat, suhu dari
tempat injeksi dapat diatur. Aturan pertama untuk pengaturan suhu ini adalah batiwa suhu
tempat injeksi sekitar 50°C lebih tinggi dari titik didih campuran dari cuplikan yang
mempunyai titik didih yang paling tinggi. Bila kita tidak mengetahui titik didih komponen
dari cuplikan maka kita harus mencoba-coba. Sebagai tindak lanjut suhu dari tempat injeksi
dinaikkan. Jika puncak-puncak yang diperoleh lebih baik, ini berarti bahwa suhu percobaan
pertama terlalu rendah. Namun demikian suhu tempat injeksi tidak boleh terlalu tinggi,
sebab kemungkinan akan terjadi perubahan karena panas atau penguraian dari senyawa
yang akan dianalisa.

Cuplikan dimasukkan ke dalam kolom dengan cara menginjeksikan melalui tempat

injeksi. Hal ini dapat dilakukan dengan pertolongan jarum injeksi yang sering disebut "a gas
tight syringe".

Perlu diperhatikan bahwa kita tidak boleh menginjeksikan cuplikan terlalu banyak,
karena GC sangat sensitif. Biasanya jumlah cuplikan yang diinjeksikan pada waktu kita
mengadakan analisa 0,5 -50 ml gas dan 0,2 - 20 ml untuk cairan seperti pada gambar di
bawah.

4. Kolom
 Kolom merupakan jantung dari kromatografi gas. Bentuk dari kolom
dapat lurus, bengkok, misal berbentuk V atau W, dan kumparan/spiral.
Biasanya bentuk dari kolom adalah kumparan. Kolom selalu merupakan bentuk tabung.
Tabung ini dapat terbuat dari :
a. Tembaga (murah dan mudah diperoleh)
b. Plastik (teflon), dipakai pada suhu yang tidak terlalu tinggi.
c. Baja (stainless steel), (mahal)
d. Alumunium
e. Gelas
Panjang kolom dapat dari 1 m sampai 3 m. Diameter kolom mempunyai berbagai
ukuran, biasanya pengukuran berdasarkan diameter dalam dari kolom gelas yaitu antara
0,3 mm hingga 5 min. Kebanyakan kolom yang digunakan berupa stainles steel dengan
diameter luar (OD) dari I/S atau 1/4 inch (0,3 atau 0,6 cm). Pada GSC kolom diisi dengan
penyerap (adsorbent), sedangkan pada GLC kolom diisi dengan "solid support" (padatan
pendukung) yang diikat oleh fase diam.

5. Detektor
Detektor berfungsi sebagai pendeteksi komponen-komponen yang telah dipisahkan
dari kolom secara terus-menerus, cepat, akurat, dan dapat melakukan pada suhu yang lebih
tinggi. Detektor harus dapat dipercaya dan mudah digunakan. Fungsi umumnya mengubah
sifat-sifat molekul dari senyawa organik menjadi arus listrik kemudian arus listrik tersebut
diteruskan ke rekorder untuk menghasilkan kromatogram. Detektor yang umum digunakan:
a. Detektor hantaran panas (Thermal Conductivity Detector_ TCD)
b. Detektor ionisasi nyala (Flame Ionization Detector_ FID)
c. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector _ECD)
d. Detektor fotometrik nyala (Falame Photomertic Detector _FPD)
e. Detektor nyala alkali
f. Detektor spektroskopi massa
Detektor yang peka terhadap senyawa organik yang mengandung fosfor adalah FID,
ECD, dan FPD. Detektor penangkap elektron (Electron Capture Detector – ECD). Pada
penetapan ini, digunakan detektor penangkap elektron. Detektor ini merupakan modifikasi
dari FID yaitu pada bagian tabung ionisasi. Dasar dari ECD ialah terjadinya absorbsi e- oleh
 senyawa yang mempunyai afinitas terhadap e- bebas (senyawa-senyawa elektronegatif).
Dalam detektor gas terionisasi oleh partikel yang dihasilkan dari 3H atau 63Ni. Detektor ini
mengukur kehilangan sinyal ketika analit terelusi dari kolom kromatografi. Detektor ini peka
terhadap senyawa halogen, karbonil terkoyugasi, nitril, nitro, dan organo logam, namun tidak
peka terhadap hidrokarbon, ketone, dan alkohol.
6. Oven kolom
Kolom terletak didalam sebuah oven dalam instrumen. Suhu oven harus diatur dan
sedikit dibawah titik didih sampel. Jika suhu diset terlalu tinggi, cairan fase diam bisa
teruapkan, juga sedikit sampel akan larut pada suhu tinggi dan bisa mengalir terlalu cepat
dalam kolom sehingga menjadi terpisah (Hendayana, 2001).
7. Rekorder
Rekorder berfungsi sebagai pengubah sinyal dari detektor yang diperkuat melalui
elektrometer menjadi bentuk kromatogram. Dari kromatogram yang diperoleh dapat
dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif dengan cara membandingkan
waktu retensi sampel dengan standar. Analisis kuantitatif dengan menghitung luas area
maupun tinggi dari kromatogram (Hendayana, 2001). Sinyal analitik yang dihasilkan
detektor dikuatkan oleh rangkaian elektronik agar bisa diolah oleh rekorder atau sistem
data. Sebuah rekorder bekerja dengan menggerakkan kertas dengan kecepatan tertentu. di
atas kertas tersebut dipasangkan pena yang digerakkan oleh sinyal keluaran detektor
sehingga posisinya akan berubah-ubah sesuai dengan dinamika keluaran penguat sinyal
detektor. Hasil rekorder adalah sebuah kromatogram berbentuk pik-pik dengan pola yang
sesuai dengan kondisi sampel dan jenis detektor yang digunakan.

Rekorder biasanya dihubungkan dengan sebuah elektrometer yang dihubungkan

dengan sirkuit pengintregrasi yang bekerja dengan menghitung jumlah muatan atau jumlah
energi listrik yang dihasilkan oleh detektor. Elektrometer akan melengkapi pik-pik
kromatogram dengan data luas pik atau tinggi pik lengkap dengan biasnya.

Sistem data merupakan pengembangan lebih lanjut dari rekorder dan elektrometer
dengan melanjutkan sinyal dari rekorder dan elektrometer ke sebuah unit pengolah pusat
(CPU, Central Procesing Unit).

Kromatografi gas dibagi lagi menjadi 2, yaitu kromatografi gas-cair, dan

kromatografi gas-padat.
 Kromatografi Gas-Cair
Dalam kromatografi gas-cair, fase gerak adalah gas seperti helium dan fase diam
adalah cairan yang mempunyai titik didih yang tinggi diserap pada padatan.
Sebagaimana kecepatan suatu senyawa tertentu bergerak melalui mesin, akan
tergantung pada seberapa lama waktu yang dihabiskan untuk bergerak dengan gas dan
sebaliknya melekat pada cairan dengan jalan yang sama.

Kromatografi gas pada prinsipnya mirip dengan kromatografi kolom (dan juga
bentuk kromatografi yang lain, seperti HPLC, TLC), namun memiliki beberapa perbedaan.
Pertama, proses memisahkan senyawa dalam campuran dilakukan antara fase diam cair dan
gas fase bergerak. Kedua, kolom yang melaluinya melewati fase gas terletak di oven dimana
temperatur gas dapat dikendalikan, dan ketiga, konsentrasi senyawa dalam fase gas adalah
semata-mata fungsi dari tekanan uap gas.

c. Kromatografi Pertukaran Ion (Ion-Exchange

Chromatography)

Kromatografi pertukaran ion (ion-exchange chromatography) biasa digukanan untuk

pemurnian materi biologis, seperti asam amino, peptida, protein. Metode ini dapat dilakukan
dalam dua tipe, yaitu dalam kolom maupun ruang datar (planar). Terdapat dua tipe
pertukaran ion, yaitu pertukaran kation (cation exchange) dan pertukaran anion (anion
exchange). Pada pertukaran kation, fase stasioner bermuatan negatif; sedangkan pada
pertukaran anion, fase stasioner bermuatan positif. Molekul bermuatan yang berada pada
fase cair akan melewati kolom. Jika muatan pada molekul sama dengan kolom, maka molekul
tersebut akan terelusi. Namun jika muatan pada molekul tidak sama dengan kolom, maka
molekul tersebut akan membentuk ikatan ionik dengan kolom. Untuk mengelusi molekul yang
menempel pada kolom diperlukan penambahan larutan dengan pH dan kekuatan ionik
tertentu. Pemisahan dengan metode ini sangat selektif dan karena biaya untuk menjalankan
metode ini murah serta kapasitasnya tinggi, maka metode ini biasa digunakan pada awal
proses keseluruhan.
 Berdasarkan Fase stasioner (Fase diam) :
1. Kromatografi Kolom
a. Kromatografi Adsorpsi
Kromatografi Adsorpsi adalah pemisahan akibat daya tarik fase diam yang kuat
terhadap komponen yang dipisahkan adanya interaksi kimiawi dan elusi bertahap.
Syarat fase diam dalam kromatografi Adsorpsi adalah :
1. Tidak larut dalam fase gerak
2. Inert
3. Cukup aktif
4. Sebaiknya tidak berwarna
5. Memungkinkan aliran baik dan teratur fase gerak. Missal : sukrosa, pati, CaCO 3, MgCO3, Mg
Silikat aktif, alumina aktif, arang aktif, florisil
b. Kromatografi Partisi
Prinsip kromatografi partisi dapat dijelaskan dengan hukum partisi yang dapat
diterapkan pada sistem multikomponen yang dibahas di bagian sebelumnya. Dalam
kromatografi partisi, ekstraksi terjadi berulang dalam satu kali proses. Dalam percobaan, zat
terlarut didistribusikan antara fasa stationer dan fasa mobil. Fasa stationer dalam banyak
kasus pelarut diadsorbsi pada adsorben dan fasa mobil adalah molekul pelarut yang mengisi
ruang antar partikel yang teradsorbsi.
Kolomnya (tabung gela) diisi dengan bahan seperti alumina, silika gel atau pati yang
dicampur dengan adsorben, dan pastanya diisikan kedalam kolom. Larutan sampel kemudian
diisikan kedalam kolom dari atas sehingga sammpel diasorbsi oleh adsorben. Kemudian
pelarut (fasa mobil; pembawa) ditambahkan tetes demi tetes dari atas kolom.
Partisi zat terlarut berlangsung di pelarut yang turun ke bawah (fasa mobil) dan
pelarut yang teradsorbsi oleh adsorben (fasa stationer). Selama perjalanan turun, zat terlarut
akan mengalami proses adsorpsi dan partisi berulang-ulang. Laju penurunan berbeda untuk
masing-masing zat terlarut dan bergantung pada koefisien partisi masing-masing zat terlarut.
Akhirnya, zat terlarut akan terpisahkan membentuk beberapa lapisan.

c. Kromatografi Adsorpsi dan Partisi

d. Kromatografi pertukaran Ion
e. Kromatografi Ekslusif molekul
f. Kromatografi Afinitas
2. Kromatografi Kertas
Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan
sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino
larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino
adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi
penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kimiawan Inggris Richard Laurence Millington Synge (1914-1994) adalah orang
pertama yang menggunakan metoda analisis asam amino dengan kromatografi kertas. Saat
campuran asam amino menaiki lembaran kertas secara vertikal karena ada fenomena kapiler,
partisi asam amino antara fasa mobil dan fasa diam (air) yang teradsorbsi pada selulosa
berlangsung berulang-ulang. Ketika pelarut mencapai ujung atas kertas proses dihentikan.
Setiap asam amino bergerak dari titik awal sepanjang jarak tertentu. Dari nilai R, masing-
masing asam amino diidentifikasi.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan
lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.
Kromatografi kertas hampir sama dengan kromatografi lapis tipis. Kromatografi
kertas memisahkan larutan organic air dan larutan anorganik atau komponen polar yang
tinggi seperti asam amino dan gula. Kertas yang digunakan mengandung air yang merupakan
fase diam. Fase gerak umumnya adalah fase pelarut organik polar dan air (campuran pelarut
yang mengandung air sebagai komponen). Fase diam kromatografi kertas bersifat cair (air)
sedangkan fase geraknya juga cairan (pelarut organic dan air). Campuran sampel menjalani
partisi atau distribusi di antara dua fase cairan. Sampel akan terpisah dengan nilai koefesien
partisi yang berbeda.
Kromatografi kertas merupakan salah satu contoh kromatografi partisi. Ketika
fase gerak diiletakkan di atas chamber, teknik dikenal dengan descending. Ketika fase
geraknya diletakkan di bawah maka disebut ascending. Jika hasil kromatografi kertas kurang
berwarna, ada dua metode umum yang digunakan untuk mendeteksi lokasi spot, yaitu
menggunakan sinar UV dan reagen pewarna. Sinar UV digunakan ketika komponen
mengandung zat fluoresens (berpendar). Kation seperti Co, Ni, Zn, dan Mn menggunakan
reagen pewarna difenil karbazid sehingga menghasilkan warna masing-masing adalah ungu,
merah, pink, da pink pucat. Reagen pewarna tersebut disemprotkan pada kertas dan hasilnya
 yang terlihat dilingkari oleh pensil (Krupadanam et al 2001). Kromatografi kertas terdapat
distribusi antara air (diadsorbsi oleh kertas saring sekitar 20 %) dan pelarut bergerak (Bansal
2003).

Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan

mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas
saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian
digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang
mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau
campuran zat-zat ini dapat digunakan.
Satu keuntungan utama Kromatogrfi Kertas ialah kemudahan dan
kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring
yang berlaku sebagai medium pemisahan dan juga sebagai penyangga. Keuntungan lain ialah
keterulangan bilangan Rp yang besar pada kertas sehingga pengukuran Rp merupakan para-
meter yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Memang, untuk senyawa
antosianin yang tidak mempunyai ciri fisika lain yangjelas, Rjr adalah sarana terpenting dalam
memaparkan dan membedakan pigmen yang satu dengan pigmen yang lain (Harborne, 1967).

3. Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi
komponen-komponennya. Seluruh bentuk kromatografi berkerja berdasarkan prinsip ini.
Semua kromatografi memiliki fase diam (dapat berupa padatan, atau kombinasi
cairan-padatan) dan fase gerak (berupa cairan atau gas). Fase gerak mengalir melalui fase
diam dan membawa komponen-komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-
komponen yang berbeda bergerak pada laju yang berbeda. Kita akan membahasnya lebih
lanjut.
Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan sebuah bentuk dari kromatografi
adsorpsi padat cair yang fase diamnya dilumuri di atas plat. Ada perbedaan cara dalam
melapisi plat, yaitu menuangkan, mencelupkan, menyemprotkan, dan melapisi. Plat yang
digunakan dapat berupa plat kaca dan aluminium. Adsorban padat yang sering digunakan,
yaitu silikia dan alumina. Bahan tersebut dicampur dengan bahan pengikat agar tidak
terkelupas pada plat yang kering. Sampel ditambahkan sebagai larutan di dalam pelarut yang
non polar di ujung plat dengan membentuk spot yang simetri. Proses pengulangan
penambahan bertujuan mendapatkan beberapa miligram sampel. Pengamatan pada plat
yang menggunakan silikia (mengandung larutan fluoresens) dengan menggunakan sinar UV
memperlihatkan lokasi spot-spot yang berpendar. Ketika fase gerak diiletakkan di atas
chamber, teknik dikenal dengan descending. Ketika fase geraknya diletakkan di bawah maka
disebut ascending (Bansal 2003).
Bila KLT dibandingkan dengan KKt, kelebihan khas KLT ialah keser-baeunaan,
kecepatan, dan kepekaannya. Keserbagunaan KLT di-sebabkan oleh kenyataan bahwa di
samping selulosa, sejumlah pen-jerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada pelat kaca
atau penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Walau pun silika gel paling banyak
digunakan, lapisan dapat pula dibuat dari alumuni-um oksida, 'celite', kalsium hidroksida,
damar penukar ion, magnesium fosfat, poliamida, 'sephadex', polivinil pirolidon, selulosa, dan
campuran dua bahan di atas atau lebih. Kecepatan KLT yang lebih besar disebabkan oleh sifat
penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada pelat dan merupakan keuntungan bila kita
menelaah senyawa labil. Akhirnya, kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diper-lukan
dapat dipisahkan bahan yang jumlahnya lebih sedikit dari ukuran µg.
Satu kekurangan KLT yang asli ialah kerja penyaputan pelat kaca dengan
penjerap. Kerja ini kemudian agak diringankan dengan ada-nya penyaput otomatis. Meski pun
begitu, dengan menggunakan alat itu pun tetap diperlukan tindakan pencegahan tertentu.
Pelat kaca harus dibersihkan hati-hati dengan aseton untuk menghilangkan lemak. Kemudian
bubur silika gel (atau penjerap lain) dalam air harus dikocok kuat-kuat selama jangka waktu
tertentu (misalnya 90 detik) sebelum penyaputan. Tergantung pada ukuran partikel penjerap,
mungkin harus ditambahkan kalsium sulfat hemihidrat (15%) untuk membantu melekatkan
penjerap pada pelat kaca. Akhirnya, setelah penyaputan, pelat harus dikeringkan pada suhu
kamar dan kemudian diaktifkan dengan pemanasan dalam tanur pada 100—110°C selama 30
menit. Pada beberapa pemisahan biasanya akan menguntungkan bila sifat penjerap diubah
dengan menambahkan garam anorganik (misalnya perak nitrat untuk KLT pemerakan), dan
hal ini paling balk dikerjakan ketika pelat sedang disaput. Alasan lain masih digu-nakannya
pelat yang disaput sendiri di laboratorium ialah karena kadar air silika gel dapat dikendalikan.
Hal ini merupakan faktor yang kritis untuk beberapa pemisahan.
Tetapi sekarang menggunakan pelat pralapis niaga dalam kebanyakan
pemisahan sudah merupakan suatu hal yang biasa karena pelat tersedemikian dengan
 penjerap yang berbeda-beda, disaputkan pada kaca, lembaran alumunium, atau plastik. Pelat
dapat mengandung indikator fluoresensi atau tidak. Penambahan indikator ini
memungkinkan pendeteksian semua senya-wa yang memadamkan fluoresensi bila pelat
diamati dengan disinari sinar UV berpanjang gelombang 254 nm. Jenis KLT yang paling baru
ialah KLT yang menggunakan pelat bersaputkan mikropartikel silika halus yang biasa
digunakan untuk kolom KCKT. Kromatografi yang demikian disebut kromatografi lapis tipis
kinerja tinggi (KLTKT) dan biasanya menghasilkan pemisahan yang lebih efisien dan lebih
cepat daripada pemisahan pada lapisan silika yang biasa.

2.4 Komponen Utama Kromatografi

Kromatografi adalah teknik untuk memisahkan campuran menjadi
komponennya dengan bantuan perbedaan sifat fisik masing-masing komponen. Alat yang
digunakan terdiri atas kolom yang di dalamnya diisikan fasa stasioner (padatan atau cairan).
Campuran ditambahkan ke kolom dari ujung satu dan campuran akan bergerak dengan
bantuan pengemban yang cocok (fasa mobil). Pemisahan dicapai oleh perbedaan laju turun
masing-masing komponen dalam kolom, yang ditentukan oleh kekuatan adsorpsi atau
koefisien partisi antara fasa mobil dan fasa diam (stationer).
Komponen utama kromatografi adalah fasa stationer dan fasa mobil.
a. Fase Stationer (Fase diam)
Pelaksanaan kromatografi lapis tipis menggunakan lapis tipis silica atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastic yang keras.
Jel silica (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis
tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendar flour dalam sinar
ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.
Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah alumina-aluminium oksida. Atom
aluminium pada permukaan juga memiliki gugus –OH. Apa yang kita sebutkan tentang jel
silica kemudian digunakan serupa untuk alumina.
b. Fase Mobil (Fase gerak)
Dalam kromatografi, eluent adalh fase gerak yang berperan penting pada proses
elusi bagi larutan umpan (feed) untuk melewati fase diam (adsorbent). Interaksi antara
adsorbant dengan eluent sangat menentukan terjadinya pemisahan komponen. Oleh sebab
 itu, pemisahan komponen gula dalam tetes secara kromatografi dipengaruhi oleh laju alir
eluent dan jumlah umpan.
Eluent dapat digolongkan menurut ukuran kekuatan teradsorpsinya pelarut atau
campuran pelarut tersebut pada adsorben dan dalam hal ini yang banyak digunakan adalah
jenis adsorban alumina atau sebuah lapis tipis silica. Penggolongan ini dikenal sebagai deret
eluotropik pelarut. Suatu pelarut yang bersifat larutan relative polar dapat mengusir pelarut
yang relative tak polar dari ikatannya dengan alumina (jel silica). (Kantasubrata,1993).
Kecepatan gerak senyawa-senyawa ke atas pada lempengan itu, tergantung pada
:
 Bagaimana kelarutan senyawa dalam pelarut. Hal ini bergantung pada bagaimana besar
atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
 Bagaimana senyawa melekat pada fase diam, misalnya silica. Hal ini tergantung pada
bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan silica gel.
Anggaplah bercak awal pada alumina mengandung dua senyawa, yang satu dapat
membentuk ikatan hydrogen, dan yang lainnya hanya dapat mengambil tiap-tiap bagian
interaksi van der Waals yang lemah.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hydrogen akan melekat pada jel silica lebih kuat
disbanding senyawa lainnya. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari
senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi
pada permukaan.
Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat pergerakan tetap dari molekul antara yang
terjerap pada permukaan jel silica dan yang kembali pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada silica gel untuk sementara waktu proses
penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa senyawa
semakin kuat senyawa dijerap, semakin kurang jarak yang ditempuh ke atas lempengan.

Sumber : http://tlbio006.blogspot.co.id/2015/09/kromatografi.html