ISOLASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER PADA FRAKSI

n-BUTANOL DAN ETIL ASETAT AKAR PLETEKAN (Ruellia tuberosa L.) SERTA UJI
AKTIVITAS TERHADAP BAKTERI Escherichia coli DAN Staphylococcus aureus

SKRIPSI

Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Guna Memperoleh Gelar

Sarjana Pendidikan pada Program Studi Pendidikan Kimia Fakultas Keguruan dan Ilmu
Pendidikan Universitas Nusa Cendana

OLEH :
MITFAH ASHANI DJENAL
1301061005

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN KIMIA

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS NUSA CENDANA
KUPANG
2018
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tinjauan Ruellia tuberosa L.

2.1.1. Klasifikasi Tanaman

Tanaman Ruellia tuberosa L. secara taksonomi mempunyai klasifikasi sebagai berikut

(Amri, 2014):

Kingdom : Plantae

Divisi : Spermatophyta

Subdivisi : Angiospermae

Kelas : Dicotyledoneae

Bangsa : Solanales

Familia : Acanthaceae Gambar 2.1 Ruellia tuberosa L.

(Sumber: dokumentasi pribadi)
Marga : Ruellia

Jenis : Ruellia tuberosa L.

2.1.1 Nama Daerah

Indonesia : Ceplikan

Jawa : Ceplikan, Pletekan, Pecah beling hutan

Lampung : Kencana ungu

NTT : Bom air, Uki-uki (Ditjen POM, 2009)

7
 Berdasarkan perbedaannya didalam menyerap zat warna Gram bakteri dibagi atas dua

golongan yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif. Bakteri Gram positif menyerap zat

warna pertama yaitu kristal violet yang menyebabkan berwarna ungu, sedangkan bakteri Gram

negatif menyerap zat warna kedua yaitu safranin dan menyebabkannya berwarna merah muda

(Dwijoseputro,1982). Bakteri Gram positif memiliki kandungan peptidoglikan yang tinggi (dapat

mencapai 50%) dibandingkan bakteri Gram negatif (sekitar 10%). Sebaliknya kandungan lipida

dinding sel bakteri Gram positif rendah sedangkan pada dinding sel bakteri Gram negatif tinggi

yaitu sekitar 11-22% (Lay, 1992). Hampir semua bakteri gram positif adalah kemohetetrof.

Analisis kimiawi menunjukkan bahwa dinding sel bakteri gram positif terdiri atas peptidoglikan

sebagai polimer utama yang berhubungan dengan polisakarida dan kelas polimer tertentu yaitu

asam teikoat. Bakteri gram negatif ada yang bersifat kemoheterotrof (Stanier, dkk, 1980).

2.4.1. Bakteri Escherichia coli

Klasifikasi bakteri Escherichia coli menurut Dwidjoseputro (1985) sebagai berikut:

Kingdom : Monera
Divicio : Protophyta
Kelas : Schizomycetes
Ordo : Eubatiales
Family : Enterobacteriaceae

Gambar 2.10 Bentuk bakteri Escherichia coli

pada mikroskop elektron
Sumber: Stevens (2009)

28
1.4.1.1 Morfologi
Menurut Volk dan Wheeler (1989), morfologi dan ciri-ciri E. coli adalah

berbentuk batang gram negatif, terdapat tunggal, berpasangan dan dalam rantai

pendek tetapi biasanya tidak berkapsul, tidak berspora motil atau tidak motil

peritrikus, anaerobik fakultatif, penghuni normal usus dan seringkali menyebabkan

infeksi. E. coli dianggap sebagai genus dengan hanya satu spesies yang mempunyai

beberapa ratus tipe antigenik. E. coli yang menyebabkan diare akut dapat

dikelompokkan menjadi tiga kategori yaitu E. coli Enteropatogenik, E. coli

Enteroinvasif, E. coli Enterotoksigenik.

2.4.1.2 Fisiologi
E. coli tumbuh baik pada hampir semua media yang dipakai di laboratorium

mikrobiologi. Sebagian besar strain E. coli tumbuh sebagai koloni yang

memfermentasi laktosa dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada

suhu 350C (Lukman, 2000).

2.4.2. Bakteri Staphylococcus aureus

Klasifikasi Dari Rosenbach (1884) klasifikasi Staphylococcus aureus yaitu:

Kingdom : Eubacteria

Divicio : Firmicutes

Kelas : Bacilli

Ordo : Bacillales
Gambar 2.11. Mikroskopis Staphylococcus
Family : Staphylococcaceae aureus
http://doclol.blogspot.com/2013/12.html

30
 pengeringan juga berfungsi untuk mengurangi kadar air sehingga mencegah

terurainya kandungan zat aktif karena pengaruh enzim dan mencegah kerusakan

bahan akibat aktivitas biologis. Selama proses pengeringan, akar kehilangan kadar

airnya sehingga menyebabkan terjadinya perubahan warna dan bentuk. Sebelum

dikeringan, akar pletekan segar berwarna cokelat dan setelah dikeringkan berubah

menjadi kerut dan berwarna kehitaman.

(a) (b)

Gambar 4.1 (a) akar Pletekan sebelum dikeringkan, (b) akar pletekan setelah
dikeringkan

Setelah kering, akar pletekan dihaluskan dengan menggunakan blender. Proses

penghalusan bertujuan untuk memperluas permukaan bidang kontak antara sampel

dengan pelarut. Semakin luas permukaan bidang kontak sampel maka proses

penarikan komponen senyawa aktif oleh pelarut akan semakin efektif pada saat

proses ekstraksi. Sampel berupa serbuk kemudian diayak untuk memperoleh ukuran

sampel yang benar-benar seragam sehingga proses ekstraksi dapat berlangsung secara

64
 untuk dilanjutkan ke tahap berikutnya yaitu ekstraksi dengan menggunakan

1500 mL pelarut metanol yang bersifat polar. Menurut Arsyanti (2011), pelarut

metanol merupakan pelarut yang mampu menembus dinding sel dan masuk ke dalam

rongga sel yang mengandung zat aktif di dalam sel sehingga komponen yang

diinginkan dapat tersedak keluar. Proses ekstraksi dilakukan tanpa pengadukan

sehingga proses penarikan komponen dimaksimalkan dengan mengatur waktu

perendaman. Semakin lama waktu ekstraksi, maka kesempatan untuk bersentuhan

akan semakin besar sehingga hasil yang diperoleh juga akan bertambah sampai pada

titik jenuh larutan. Menurut Neolaka (2009), lama waktu perendaman serbuk 2-14

hari, semakin lama waktu kontak pelarut dengan sampel maka hasilnya semakin baik.

Proses perendaman menggunakan pelarut n-heksan selama 7 hari sedangkan 10 hari

menggunakan pelarut metanol. Filtrat yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan

pelarut n-heksan berwarna merah sedangkan dengan pelarut metanol berwarna hitam

pekat.

Gambar 4.2 (a) Ekstraksi dengan n-heksana (b) Ekstraksi dengan metanol

(a) (b) (c)

(c) Ampas hasil ekstraksi dengan metanol

67
terlebih dahulu dengan HCl sehingga dapat terbentuk Mg2+ yang kemudian akan

membentuk kompleks berwarna merah. Senyawa kompleks ini dibentuk dengan

adanya ikatan kovalen koordinasi antara Mg2+ dengan atom O dari gugus OH fenolik

pada flavonoid (Dayanti dan Suyanto, 2013). Reaksi dugaan flavonoid dengan

pereaksi shibata ditunjukkan pada gambar 4.3.

O
OH Mg

OH O
O
OH

OH
O

(a) O O

Mg
MgCl2
OH O Cl Cl

Flavonoid Kompleks flavo-Mg (Merah)

(b)
Gambar 4.3 (a) Hasil uji fitokimia dengan pereaksi shibata (b) Mekanisme Reaksi
flavonoid dengan perekasi shibata (Markam, 1988).

4.3.2. Uji Fenolik

Uji golongan senyawa fenolik dilakukan dengan mereaksikan ekstrak metanol akar

pletekan (Ruellia tuberosa L.) dengan beberapa tetes FeCl3 10%. Ekstrak metanol

akar Ruellia tuberosa L. menunjukkan hasil positif terhadap uji fenol. Hal ini

dibuktikan dengan terbentuknya warna hijau kehitaman yang menandakan positif

senyawa fenol. Terbentuknya warna hijau kehitaman ketika penambahan beberapa

70
tetes FeCl3 10% karena kemungkinan senyawa tanin membentuk kompleks dengan

ion Fe3+. Mekanisme reaksi senyawa fenol dengan FeCl3 ditunjukkan pada gambar 4.4.

-
O 3-

OH

+ 3HCl
3H+ + Fe
6
6
(a)
+ FeCl3

Kompleks dengan Fe3+ (hijau (b)

kehitaman)

Gambar 4.4 (a) Hasil uji fitokimia dengan pereaksi FeCl3 10%, (b) Mekanisme
reaksi senyawa fenol dengan FeCl3 (Siadi, 2012).

4.3.3. Uji Terpenoid

Uji reagen Lieberman-Burchard merupakan uji reagen yang spesifik pada

senyawa triterpenoid. Pereaksi Lieberman–Burchard merupakan campuran antara

asetat anhidrida dan H2SO4 pekat. Uji dilakukan dengan mengambil sedikit ekstrak

kemudian ditambahkan dengan beberapa tetes pereaksi Lieberman-Burchard. Hasil

pengujian fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak metanol akar Ruellia tuberosa L.

negatif mengandung terpenoid karena tidak terbentuk cincin merah kecokelatan.

Hasil uji fitokimia ekstrak metanol akar Ruellia tuberosa dengan pereaksi Lieberman-

Burchard ditunjukkan pada gambar 4.5.

71
 Gambar 4.5 Hasil uji fitokimia dengan pereaksi Lieberman-Burchard.

4.3.4. Uji Steroid

Uji steroid dilakukan dengan mereaksikan ekstrak metanol akar Ruellia

tuberosa L. dengan beberapa tetes asam sulfat dingin. Senyawa steroid akan

mengalami dehidrasi dengan penambahan asam kuat dan membentuk garam yang

memberikan sejumlah reaksi warna (Paul, 2002). Hasil positif adanya steroid

ditandai dengan terbentuknya warna hijau-biru. Hasil pengujian fitokimia

menunjukkan bahwa ekstrak metanol akar Ruellia tuberosa L. positif mengandung

steroid yang ditandai dengan terbentuknya warna hijau kehitaman. Mekanisme reaksi

pada steroid ditunjukkan pada gambar 4.6.

(a)

72
 fraksinasi menggunakan pelarut n-butanol diulangi hingga diperoleh filtrat

yang jernih. Setelah itu, fraksi air-metanol yang diperoleh dipartisi lagi menggunakan

pelarut etil asetat sebanyak 100 mL. Saat didiamkan, terbentuk dua lapisan, fraksi

bagian atas adalah fraksi etil asetat sedangkan lapisan bagian bawah adalah fraksi air-

metanol. Berat jenis etil asetat 0,89 g/cm3. Berat jenis etil asetat lebih kecil dari air-

metanol sehingga lapisan etil asetat berada di atas sedangkan lapisan air-metanol

berada di bagian bawah. Selanjutnya fraksi air-metanol dipartisi sekali lagi dengan

menggunakan pelarut petroleum eter sebanyak 100 mL. Setelah didiamkan, terbentuk

pula dua lapisan dimana fraksi petroleum eter berada di bagian atas sedangkan fraksi

air-metanol berada dibagian bawah. Proses fraksinasi untuk setiap pelarut terus

diulangi hingga filtratnya jernih. Fraksi n-butanol dan etil asetat yang diperoleh

kemudian dievaporasi menggunakan rotary vacum evaporator untuk mendapatkan

ekstrak kental dari kedua fraksi. Hasil fraksinasi dapat dilihat pada gambar 4.7.

(a) Fraksinasi (b) Fraksinasi (c) Fraksinasi

dengan n-butanol dengan Etil Asetat dengan Petroleum
Eter

Gambar 4.7. Proses fraksinasi

75
 Tabel 4.3 Data Hasil Evaporasi Fraksi n-butanol dan Etil Asetat Akar Pletekan
(Ruellia Tuberosa L.)
Berat ekstrak kental hasil
Hasil Fraksinasi Warna Fraksi evaporasi
(gram)
Fraksi n-butanol Cokelat kehitaman 0,6
Fraksi etil asetat Cokelat kehitaman 0,26

Setelah diperoleh ekstrak kental hasil fraksi, kemudian dilanjutkan dengan uji

fitokimia. Dalam analisis fitokimia kali ini, dilakukan pengujian terhadap senyawa

metabolit sekunder golongan flavonoid, fenolik dan steroid.

Untuk mengetahui keberadaan senyawa fenolik dalam fraksi n-butanol dan

etil asetat dalam akar Ruellia tuberosa L. maka dilakukan uji dengan mereaksikan

masing-masing fraksi n-butanol dan etil asetat akar Ruellia tuberosa L. dengan

beberapa tetes FeCl3 10%. Hasil positif adanya senyawa fenolat ditunjukkan dengan

terbentuknya senyawa kompleks berwarna hijau, biru, ungu, atau hitam. Hasil

pengujian fitokimia menunjukkan bahwa fraksi n-butanol dan etil asetat akar Ruellia

tuberosa L. positif mengandung senyawa fenolik karena terbentuk warna hijau

kehitaman (lihat reaksi pada halaman 70).

(a) (b)

Gambar 4.8 (a) Hasil Uji Fenolik Fraksi n-Butanol, (b) Hasil Uji Fenolik Fraksi Etil
Asetat

76
dan petroleum eter tidak berpengaruh terhadap hasil uji karena aquades yang bersifat

netral. Selain itu dalam penelitian ini digunakan dua medium yaitu nutrient broth dan

medium mueller hington agar. Kedua medium ini merupakan medium yang paling

umum digunakan untuk semua jenis bakteri karena media ini bukan merupakan media

selektif oleh sebab itu semua jenis bakteri dapat tumbuh dengan baik pada medium

ini. Medium ini dapat berfungsi untuk menumbuhkan mikroba, memperbanyak

jumlah, menguji sifat fisiologi dan perhitungan jumlah mikroba sehingga selama

proses pembuatan medium hingga penggunaan medium untuk pengujian, semua

medium ditutup dengan kapas dan alumunium foil serta alat-alat yang digunakan

disterilkan menggunakan autoklaf selama 1 jam pada suhu 1500C agar semua bahan

dan alat terbebas dari bakteri pengganggu yang dapat mempengaruhi hasil uji.

Salah satu hasil uji aktivitas antibakteri fraksi n-butanol dan atil asetat yang

mengandung senyawa fenolik terhadap bakteri Escherichia coli dan Staphyloccocus

aureus menggunakaan metode difusi agar dapat dilihat pada gambar 4.11.

(a) (b)

86
 (c) (d)

Gambar 4.11 Hasil uji akivitas antibakteri isolat pada (a) fraksi n-butanol
dengan bakteri uji E. coli, (b) fraksi n-butanol dengan bakteri uji S. Aureus, (c) fraksi
etil asetat dengan bakteri uji E. coli, (d) fraksi etil asetat dengan bakteri uji S. aureus
pada pengulangan I.

Hasil yang diperoleh pada gambar 4.10 menunjukkan aktivitas antibakteri

pada ulangan pertama kedua fraksi terhadap kedua bakteri uji dengan aquades sebagai

kontrol negatif dan amoxilin sebagai kontrol positif. Natheer (2012) menyebutkan

bahwa kontrol negatif adalah pelarut yang digunakan sebagai pengencer ekstrak,

tujuannya agar kontrol negatif tidak mempengaruhi uji aktivitas ekstrak. Selain itu

digunakan antibiotik sinetik amoxilin sebagai kontrol positif karena spektrumnya luas

dimana dapat menghambat bakteri baik bakteri gram positif maupun bakteri gram

negatif. Zona bening yang terbentuk mengindikasikan adanya hambatan terhadap

bakteri oleh antibiotik pada permukaan media agar. Kerusakan pada bakteri yang

disebabkan oleh senyawa antibakteri yang bersifat dapat membunuh bakteri

87
Gambar Hasil Uji Aktifitas Fraksi n-Butanol:
Escherichia coli Staphylococcus aureus

Pengulangan I Pengulangan I

Pengulangan II Pengulangan II

Pengulangan III Pengulangan III

128
Gambar Hasil Uji Aktifitas Fraksi Etil Asetat:
Escherichia coli Staphylococcus aureus

Pengulangan I Pengulangan I

Pengulangan II Pengulangan II

Pengulangan III Pengulangan III

129
Lampiran VIII

Dokumentasi Penelitian

7.1 Preparasi Sampel

(a) Akar Pletekan sebelum (b) Akar Pletekan setelah (c) Peneliti sedang
dikeringkan dikeringkan menghaluskan sampel
menggunakan blender

7.2 Ekstraksi Sampel

(a) Ekstraksi dengan n- (b) Hasil ekstraksi dengan metanol (c) Evaporasi
Heksana

7.3 Uji Fitokimia Ekstrak Metanol

 (a) Flavonoid (b) Terpenoid (c) Saponin (d) Steroid (e) Fenol

7.4 Fraksinasi

(a) Fraksinasi dengan n-butanol (b) Fraksinasi dengan Etil Asetat (c) Fraksinasi dengan Petroleum
Eter
7.5 Uji Fitokimia Senyawa FenolikFraksi Etil Asetat dan n-Butanol

(a) fraksi n-butanol (b) fraksi etil asetat

7.6 Kromatografi Lapis Tipis

(a) Mengelusi plat KLT (b) Hasil KLT Fraksi Etil Asetat (c) Hasil KLT Fraksi n-Butanol
7.7 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(a) Proses pemisahan komponen senyawa dengan KLTP

(b) Hasil KLTP Fraksi n-butanol (c) Hasil KLTP Fraksi Etil Asetat

(d) Isolat n-butanol (e) Isolat I etil asetat

7.8 Uji Aktivitas Antibakteri

(a) Medium MHA (kiri) dan (b) Peremajaan Bakteri Pada Medium Nutrient
Nutrient Broth (kanan) Broth

(c) Pengujian Aktifitas Antibakteri Fraksi n-butanol dengan (d) Pengujian Aktifitas Antibakteri Fraksi
Metode Sumuran etil asetat dengan Metode Sumuran

(e) Media Antibakteri Setelah diinkubasi 24 (d) Perhitungan Diameter Zona Hambat
jam