Anda di halaman 1dari 10

PENENTUAN TRANSMINASE GLUTAMAT PIRUVAT SERUM DARAH SAPI

Tujuan

Untuk menentukan trasminase glutamat piruvat yang terdapat pada serum darah

Dasar teori

Asam amino mempunyai peran yang sangat penting bagi tubuh. Di dalam tubuh, asam-
asam amino dapat menyediakan kebutuhan nitrogen untuk:

- Struktur basa nitrogen DNA dan RNA,


- Heme dan struktur lain yang serupa mioglobin, hemoglobin, sitokrom, enzim dll.
- Asetilkolin dan neurotransmitter lainnya.
- Hormon dan fosfolipid

Selain menyediakan kebutuhan nitrogen, asam-asam amino dapat juga digunakan sebagai
sumber energi jika nitrogen dilepas.

Asam-asam amino tidak dapat disimpan oleh tubuh. Jika jumlah asam amino berlebih atau
terjadi kekurangan sumber energi lain (karbohidrat dan protein), tubuh akan menggunakan
asam amino sebagai sumber energi.

Tidak seperti karbohidrat dan lipid, asam amino memerlukan pelepasan gugus amin.
Gugus amin ini kebudian dibuang karena bersifat toksik bagi tubuh. Terdapat dua tahap
pelepasan gugus amin dari asama amino yaitu transaminasi dan deaminasi oksidatif.

Transaminasi merupakan proses utama untuk melepaskan gugus nitrogen dari asam
amino. Umumnya nitrogen dipindahkan sebagai gugus amino dari asam amino α-
ketoglutarat untuk menghasilkan glutamat. Sedangkan asam amino semula diubah menjadi
asam keto padanannya (Tika, 2010).

Gambar 1. Pelepasan nitrogen pada transaminasi


Salah satu contoh dari reaksi transaminasi adalah reaksi alanin yang mengalami
transaminasi menjadi glutamat. Pada reaksi ini dibutuhkan enzim alanin aminotransferase.
Gugus α-amino dipindahkan secara enzimatis ke atom karbon α pada α-ketoglutarat
sehingga dihasilkan asam α-keto yang analog dari asam amino yang bersangkutan. Reaksi
ini menyebabkan aminasi α-ketoglutarat membentuk L-glutamat.
-
COO -
COO
R R
CH2 Transaminase CH2
+
H C NH3 + CH2 C O +
- Piridoksal fosfat -
CH2
COO C O COO H +
C NH3
-
COO -
COO

Gambar 2. Reaksi transaminasi glutamate


Kebanyakan enzim transaminase bersifat spesifik bagi α-ketoglutarat sebagai molekul penerima
gugus amino. Glutamat dapat mengalami deaminasi oksidatif melalui reaksi yang dikatalisis oleh
glutamat dehidrogenase yang menghasilkan ion amonium dan α-glutamat (Tika, 2010).

NADPH -
-
COO NADP + NH4+ COO
CH2 CH2

CH2 Piridoksal fosfat CH2


+ C O
H C NH3
- -
COO COO

Gambar 3. Reaksi yang dikatalisis oleh glutamat dehidrogenase


NADP+ berfungsi sebagai kofaktor, reaksi yang berlangsung di mitokondria sebagian besar
bersifat reversibel. Reaksi ini dapat menggabungkan amonia ke glutamat atau membebaskan
amonia dari glutamat. Akibat reaksi transaminasi glutamat, dapat diperoleh nitrogen dari asam
amino lain dan melepaskan amonia melalui reaksi glutamat dehidrogenase. Proses ini merupakan
salah satu sumber amonia yang masuk dalam siklus urea (Tika, 2010).
Namun demikian, enzim tersebut tidak terlalu spesifik bagi substratnya, yaitu asam L-amino
yang memberikan gugus aminonya. Berikut ini beberapa transaminase yang paling penting, yang
dinamakan sesuai dengan molekul pemberi gugus aminonya.
Asam L-alanin + α-ketoglutarat piruvat + L-glutamat
Asam L-aspartat + α-ketoglutarat oksaloasetat + L-glutamat
Asam L-leusin + α-ketoglutarat α-ketoisokaroat + L-glutamat
Asam L-tirosin + α-ketoglutarat p-hidroksifenilpiruvat + L-glutamat
Asam amino aspartat dapat mengalami transaminasi membentuk asam α-
ketoasetoasetat. Dalam proses ini gugus amino dipindahkan ke α-ketoglutarat menjadi L-
glutamat.
- -
COO COO - -
COO COO
H2C CH2 Transaminase CH2
+ H2C +
H C NH3 + CH2
Piridoksal fosfat CH2
- C O C O +
COO - H C NH3
- COO
COO -
COO
Gambar 4. Reaksi transaminasi pada asam L-aspartat
Semua asam amino kecuali asam amino lisin dan treonin dapat mengalami reaksi
transaminasi. Untuk sebagian besar reaksi ini, α-ketoglutarat dan L-glutamat berfungsi
sebagai salah satu pasangan asam α-keto, asam amino. Kofaktornya adalah piridoksal
fosfat.
Reaksi pemindahan gugus α-amino dari satu kerangka karbon ke yang lainnya atau
transaminasi meliputi beberapa tahapan reaksi, sebagai berikut (1) suatu molekul asam
amino bereaksi dengan enzim dan terikat pada sisi aktif enzim, kemungkinan melalui
gugus karboksilnya, (2) ikatan rangkap berpindah dari atom N lisin ke atom N aspartat,
melepaskan gugus amino lisin dan membentuk aldimin dari aspartat. Jauh lebih mudah
membentuk suatu aldimin melalui pertukaran gugus-gugus dengan aldimin yang sudah ada
sebelumnya daripada melalui penggabungan suatu amin dengan suatu aldehid, (3) ikatan
rangkap dari aldimin berpindah, membentuk suatu ketimin. Tautomerisasi ini merupakan
tahap penentu laju reaksi dari keseluruhan urutan reaksi, (4) ketimin tersebut kemudian
dihidrolisis membentuk oksaloasetat dan piridoksamin fosfat. Oksaloasetat akan terlepas,
tetapi piridoksamin fosfat masih terikat pada enzim melalui gugus-gugus lain pada
koenzim, (5) suatu ketimin, terbentuk antara α-ketoglutarat dari piridoksamin fosfat, (6)
ikatan rangkap sekali lagi berpindah, membentuk aldimin dari L-glutamat dan piridoksal
fosfat dan (7) ikatan rangkap aldinin berpindah dari hidrogen L-glutamat ke gugus lisin
pada protein menyebabkan glutamat terlepas, dan mengembalikan enzim ke keadaan
semula sehingga dapat mengulang seluruh proses dengan mengikat molekul aspartat yang
baru.
Hati, ginjal dan otot mengandung banyak transaminase glutamat-oksaloasetat (TGO),
disebut juga sebagai aspartat aminotransferase dan transaminase glutamat-piruvat (TGP).
Serum pada keadaan normal menunjukkan adanya aktivitas enzim tersebut, tetapi rendah.
Hanya apabila terjadi kerusakan pada jaringan-jaringan tersebut, maka enzim-enzim
intraseluler di atas akan keluar sel dan masuk ke darah. Kenaikan aktivitas TGO dan TGP
serum, dapat dijumpai pada penyakit yang menyangkut jaringan tertentu. Contohnya dapat
dilihat pada tabel di bawah ini.

Tabel 1. Hasil pemeriksaan ALT dan AST

Hasil Pemeriksaan
Pemeriksaan Untuk Mengukur
Menunjukkan

Enzim yang dihasilkan


di hati, yang
Alanin Transaminase Luka pada sel hati
dilepaskan ke dalam
(ALT) (hepatitis)
darah jika sel hati
mengalami luka

Enzim yang
dilepaskan dalam
Aspartat Transaminase Luka di hati, jantung,
darah jika hati,
(AST) otot atau otak
jantung, otot atau otak
mengalami luka

Secara keseluruhan, reaksi transaminasi bersifat reversible. Reaksi ini dapat


digunakan untuk mengeluarkan nitrogen dari asam amino atau untuk memindahkan
nitrogen ke dalam α-keto untuk membentuk asam amino. Dengan demikian, reaksi
tersebut berperan pada penguraian maupun pembentukan asam amino, sehingga reaksi ini
sangat penting dalam metabolisme asam amino (Dawn, Marks, dkk.2000). Adapun cara
untuk menghitung piruvat dari hasil percobaan adalah sebagai berikut:

TK 1 1000 T  K
x4x x 0,1 x  x 66,7 mmol
S B 1000 0,1 S  B

Keterangan:
T = serapan untuk zat yang diperiksa/diukur
K = serapan untuk control
S = serapan untuk standar
B = serapan untuk blanko

Alat dan bahan

No Nama alat Jumlah Nama bahan Jumlah


1 Tabung reaksi 1 rak Buffer fosfat pH 7,4 250 mL
2 Spektronik 20+ 1 buah Asam L-alanin 4,45 gram
3 Batang pengaduk 3 buah NaOH 18 gram
4 Gelas kimia 100 mL 3 buah Asam α-ketoglutamat 0,073 gram
5 Gelas ukur 5 mL 3 buah 2,4-dinitrofenilhidrazin 19,8 gram
6 Pipet tetes 5 buah HCl pekat 50 mL
7 Pipet volume 5 mL 1 buah Aquades Secukupnya
8 Spatula 3 buah Tissue Secukupnya
9 Labu ukur 50 mL 1 buah
10 Labu ukur 250 mL 1 buah
11 pH meter 1 buah
12 Cawan petri 1 buah
13 Thermometer 1 buah
14 Pemanas air 1 buah
15 Gelas kimia 500 mL 1 buah
16 Sentrifuse 1 buah

Prosedur keja

No Prosedur kerja Hasil pengamatan


1 Pembuatan buffer fosfat pH 7,4
Buffer ditambahkan dengan larutan Buffer fosfat dengan pH 3,6 di ambil
NaOH sampai diperoleh pH larutan sebanyak 150 mL kemudian
buffer fosfat 7,4 ditambahkan NaOH 1N hingga pH
menjadi 7,4
Gambar 5. Buffer fosfat pH 7,44
2 Pembuatan larutan NaOH 0,4 N
Sebnyak 0,3979 gram padatan NaOH Sebanyak 1,6 gram padatan NaOH
dilarutkan dalam aquades sampai dilarutkan dalam aquades sampai
volume larutan menjadi 25 mL volume larutan menjadi 100 mL
Larutan bening tidak berwarna

3 Pembuatan larutan NaOH 1N


Sebanyak 4,0140 gram padatan NaOH Sebanyak 10,0772 gram padatan
dilarutkan dalam aquades sampai NaOH dilarutkan dalam aquades
volume larutan menjadi 100 mL hingga volume menjadi 250 mL
Larutan bening tidak berwarna

Gambar 6. Larutan NaOh 1,0 N


4 Pembuatan larutan substrat  Asam L-alanin yang berupa serbuk
 Sebanyak 4,461 gram padatan L- berwarna putih ditimbang sebanyak
alanin dilarutkan dalam buffer fosfat 1,7849 gram. Kemudian ditambahkan
buffer fosfat 20 mL
 Kemudian ditambahkan 0,0759 gram  Asam α-ketoglutamat yang berupa
asam α-ketoglutamat kemudian diaduk serbuk berwarna putih ditimbang
sampai melarut sebanyak 0,0291 gram kemudian
ditambahkan larutan asam L-alanin
 Kedalam larutan yang terbentuk dan diaduk hingga larut.
ditambahkan tetes demi tetes NaOH  Selanjutnya ditambahkan tetes demi
sampai pH 7,4. Selanjutnya tetes NaOH sampai pH 7,4.
ditambahkan buffer fosfat sampai Ditambahkan buffer fosfat hingga
volume larutan menjadi 250 mL. volume 100 mL
5 Pembuatan larutan standar piruvat Sebanyak 0,022 gram natrium piruvat
Sebanyak 0,022 gram natrium piruvat ditimbang, serbuk berwarna coklat
dilarutkan dengan aquades sampai ditambahkan aquades hingga volume
volume menjadi 50 mL menjadi 50 mL. Menghasilkan larutan
bening tidak berwarna

Gambar 7. Laritan standar piruvat


6 Pembuatan larutan 2,4 DNFH ditimbang sebanyak 1,985
dinitrofenilhidrazin berupa serbuk berwarna oranye.
Sebanyak 0,9808 gram DNFH Dilarutkan dalam 5 mL HCl
dilarutkan dalam 5 mL HCl, kemudian terbentuk larutan berwarna kuning.
diencerkan dengan aquades sampai Diencerkan dengan aquades sampai
volume 100 mL volume 100 mL warna larutan oranye
kemerahan.

Gambar 8. Larutan 2,4-


dinitrofenilhidrazin
7 Pembuatan larutan uji  Sebanyak 0,5 mL substrat
 Sebanyak 0,6 mL substrat dimasukkan dimasukkan ke dalam tabung reaksi
ke dalam tabung reaksi dan di inkubasi dan diinkubasi dan menghasilkan
selama 60 menit larutan tidak berwarna.
 Ke dalam larutan yang terbentuk  Setelah ditambahkan 0,1 mL serum
ditambahkan 0,1 mL serum, campur menghasilkan larutan berwarna
dengan baik dan diinkubasi selama 60 merah. Inkubasi selama 60 menit
menit  Ditambahkan larutan 2,4-
 Ditambahkan 0,5 mL larutan 2,4 dinitrofenilhidrazin larutan berwarna
dinitrofenilhidrazin, dikocok dengan merah setelah diinkubasi selama 20
baik dan diinkubasi pada suhu kamar menit menghasilkanlarutan berwarna
selama 20 menit hitam. Panjang gelombang yang
 Kemudian ditambahkan 5 mL NaOH, dihasilkan adalah 0,646 nm
diaduk dan diinkubasi pada suhu
kamar selama 10 menit, diukur
serapannya pada panjang gelombang
510 nm.

Gambar 9. Larutan Uji


8 Pembuatan laruan kontrol Sebanyak 0,5 mL substrat tidak
 Sebanyak 0,5 mL substrat berwarna ditambahkan 0,5 mL DNFH
ditambahkan dengan 0,5 mL larutan menghasilkan larutan berwarna
2,4-dinitro-fenilhidrazin, setelah oranye. Setelah dicampur
tercampur ditambahkan 0,1 mL serum, ditambahkan 0,1 mL serum
larutan yang terbentuk diinkubasi menghasilkan larutan berwarna
selama 20 menit. kehitaman inkubasi selam 20 menit.
 Ke dalam larutan ditambahkan 5 mL Panjang gelombang yang dihasilkan
NaOH, diaduk dan diinkubasi pada adalah 0,69 nm
suhu kamar selama 10 menit, diukur
serapannya pada panjang gelombang
510 nm
Gambar 10. Larutan Kontrol
9 Pembuatan larutan blanko Sebanyak 0,5 mL substrat
 Sebanyak 0,5 mL substrat ditambahkan 0m1 mL aquades
ditambahkan dengan 0,1 mL aquades menghasilkan larutan tidak berwarna
dan 0,5 mL larutan 2,4- dan ditambahkan 0,5 mL larutan 2,4-
dinitrofenilhidrazin, larutan yang dinitrofenilhidrazin menghasilkan
terbentuk diinkubasi selama 20 menit larutan berwarna kuning kemudian
 Ke dalam larutan ditambahkan 5 mL diinkubasi selama 20 menit.
NaOH, diaduk dan diinkubasi pada Setelah diinkubasi warna larutan tetap
suhu kamar selama 10 menit, diukur kuning. Penambahan NaOH
serapannya pada panjang gelombang menghasilkan larutan berwarna coklat
510 nm muda kemudian diinkubasi pada suhu
kamar selama 10 menit.
Panjang gelombang yang dihasilkan
adalah 0,465 nm

Gambar 11. Larutan Blanko


10 Pembuatan larutan standar Sebanyak 0,1 mL larutan standar
 Sebanyak 0,1 mL larutan standar piruvat ditambahkan 0,4 mL substrat
pirufat ditambahkan dengan 0,4 mL dan 0,1 mL aquades menghasilkan
substrat, 0,1 mL aquades dan 0,5 mL larutan tidak berwarna. Kemudian
larutan 2,4-dinitrofenilhidrazin larutan ditambahkan o,5 mL larutan 2,4-
yang terbentuk diinkubasi selama 20 dinitrofenilhidrazin menghasilkan
menit larutan berwarna kuning. Kemudian
 Ke dalam larutan ditmbahkan 5 mL diinkubasi selama 20 menit larutan
NaOH, diaduk dan diinkubasi selama tetap berwarna kuning dan terbentuk
10 menit , diukur serapannya pada endapan berwarna oranye.
panjang gelombang 510 nm Ke dalam larutan substrat
ditambahkan 5 mL NaOH dan
diinkubasi menghasilkan larutan
berwarna coklat pekat. Kemudian
diinkubasi selama 10 menit pada suhu
kamar dan diukur panjang
gelombangnya.
Panjang gelombang yang diperoleh
yaitu 0,548 nm.

Gambar 12. Larutan Standar