LA FOSFORILACIÓN DEL NÚCLEO DE LA HISTONA REGULA LA ACCESIBILIDAD DEL ADN.

La dinámica de desenvolvimiento de los nucleosomas proporciona acceso transitorio a los

complejos implicados en la transcripción, reparación y replicación del ADN, mientras que
la regulación del desencadenamiento de nucleosomas modula la ocupación de estos
complejos. La histona H3 se fosforila en tirosina 41 (H3Y41ph) y treonina 45 (H3T45ph).
H3Y41ph está implicado en la regulación de la transcripción, mientras que H3T45ph está
involucrado en la replicación del ADN y la apoptosis. Estas modificaciones se ubican en la
interfaz ADN-histona cerca de donde el ADN sale del nucleosoma y, por lo tanto, están
preparadas para interrumpir las interacciones ADN-histona. Sin embargo, se desconoce el
impacto de la fosforilación de histonas sobre el desenvolvimiento de nucleosomas y su
accesibilidad. Encontramos que la fosforilación imita a H3Y41E y H3T45E, y la modificación
químicamente correcta, H3Y41ph, aumenta significativamente el desenvolvimiento de
nucleosomas. Esto mejora la accesibilidad de ADN a la unión de proteínas por 3 veces. La
acetilación de H3K56 (H3K56ac) también se localiza en la misma interfaz ADN-histona y
aumenta el desenvolvimiento del ADN. H3K56acis implicado en la regulación de la
transcripción, lo que sugiere que H3Y41ph y H3K56ac podrían funcionar juntos.

Vemos que la combinación de H3Y41ph con H3K56ac aumenta la accesibilidad de ADN en

un orden de magnitud. Estos resultados sugieren que la fosforilación dentro de la región
de entrada y salida del ADN del nucleosoma aumenta el acceso a los complejos de unión a
ADN y que la combinación de fosforilación con acetilación tiene el potencial de influir
significativamente en la accesibilidad del ADN a los complejos reguladores de la
transcripción.
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES.

Preparación de construcciones de ADN: se preparó el ADN nucleosómico (Figura 1)

utilizado para la dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS) y ensayos de digestión
con nucleasa micrococal (MNasa) como se describe en la Ref. 38, mientras que el ADN
nucleosomal utilizado para las mediciones FRET (DNA-LexA, Fig. 1) se preparó por PCR
como se describe en Refs. 27 y 28. La plantilla para la PCR era un plásmido que contenía la
secuencia de posicionamiento de 601-nucleosomas con los pares de bases 8º a 27º
reemplazados con la secuencia de reconocimiento de LexA (TACTGTATGAGCATACAGTA)
(13, 28). Los oligonucleótidos utilizados como cebadores (Sigma-Aldrich) en la PCR fueron
Cy3 CTGGAGATACTGTATGAGCATACAGTACAATTGGTCGTAGCA y
ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGGAGACTA. El oligonucleótido que contiene el sitio
LexA contenía una amina unida al 5? final y se marcó con Cy3-NHS (GE Healthcare) y luego
se purificó por HPLC de fase inversa. El producto 601 LexA PCR se extrajo con fenol y luego
se purificó por cromatografía de intercambio aniónico. La secuencia 601 es asimétrica en
su propensión a desenvolver (39, 40). Aquí el sitio LexA se ha introducido en el lado del
nucleosoma que tiene una probabilidad reductora de desplegarse.

La preparación de H3Y41ph con y sin H3K56ac-H3Y41ph totalmente sintético y H3Y41ph

/ K56ac se prepararon mediante ligación química nativa secuencial como se describió
previamente con los siguientes cambios. Los péptidos se sintetizaron con Fmoc-N
estándar? estrategias de protección que utilizan la activación de HCTU en un sintetizador
de péptidos automatizado AAPPTec Apex 396. Todos los residuos Met se sustituyeron con
norleucina para eliminar los productos secundarios oxidativos. El péptido C-terminal H3-
A91C, C110A se sintetizó en resina Rink Amide MBHA LL (Novabiochem). Los péptidos H3-
A47Thz con o sin K56ac y H3 con o sin Tyr (P) -41 se prepararon sobre resina derivatizada
con Fmoc-Dbz (Alloc) (donde Dbz es ácido 3,4-diaminobenzoico y Alloc es aliloxicarbonilo)
como se describe en Ref. . 42 y escindidos y purificados como derivados C-terminalesN-
acilurea. Las histonas sintéticas se analizaron mediante RP-HPLC y MALDI-TOF MS (figura
2).

Los octámeros de histona recombinante de preparación de octómero se replegaron y se

purificaron como se describió previamente. Las mutaciones para H3Y41E, H3T45E,
H3K56Q y H3Y41E / K56Q se introdujeron en el plásmido que expresa H3C110A mediante
mutagénesis dirigida indirectamente. Cada histona se expresó y replegó en octámero de
histona siguiendo procedimientos publicados. El octámero de histona replegado se
purificó por cromatografía de filtración en gel. El octámero de histona que iba a ser
marcado con fluoróforo se volvió a plegar con H2AK119C y se marcó antes de la
purificación por filtración en gel.
Etiquetado de octómero cíclico marcado con fluoróforo Cy5: los octámeros de histona
utilizados en las mediciones de FRET incluyeron las sustituciones de H3C110A y H2AK119C
y se marcaron con maleimida de Cy5 tal como se describe. Brevemente, se añadió tris (2-
carboxietil) - fosfina (TCEP) a 10 mM para replegar el octámero de histona y se incubó
durante 30 minutos. TCEP luego se eliminó mediante diálisis en tubos de 5 mM, pH 6,1,
con NaCl 2M. La muestra se expuso luego a una corriente de argón durante 15 minutos. A
continuación, se añadió HEPES, pH 7,1, que se desgasificó bajo gas de argón, a la muestra
a una concentración final de 100 mM. La cianimida de Cy5, que se resuspendió en
dimetilformamida anhidra, se añadió luego a un exceso 10 molar al octámero de histona.
La reacción de marcaje se incubó durante 1 ha temperatura ambiente y luego durante la
noche a 4 ° C, y luego se inactivó añadiendo DTT a 10 mM. El exceso de colorante se
eliminó durante la purificación de octamero de histona mediante cromatografía de
filtración en gel.

Reconstitución de nucleosomas: los nucleosomas se reconstituyeron con ADN que

contiene la secuencia de posicionamiento 601-nucleosoma mediante diálisis de sal. Los
nucleosomas usados en los experimentos de digestión con SAXS y nucleasa micrococal se
prepararon como se describe en la Ref. 38. Los nucleosomas utilizados en las mediciones
de FRET se prepararon como se describe en la Ref. 27 y luego se purifica en un gradiente
de sacarosa del 5-30%. La calidad de todas las muestras de nucleosomas se analizó
mediante EMSA en geles de poliacrilamida al 5% (Fig. 1). Los geles de los nucleosomas
marcados con fluoróforos se formaron mediante la detección de la fluorescencia de Cy3
con un escáner de fluorescencia Typhoon (GE Healthcare).

LexA Preparation-LexA se expresó en células Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen)
a partir del plásmido pJWL288 y se purificó como se describió previamente.

Mediciones de nucleasa micrococal de la accesibilidad del ADN del nucleosoma Los

nucleosomas reconstituidos con ADN de 207 pb que contenían una secuencia de
posicionamiento de 601 nucleosomas de 147 pb situada en el centro se sometieron a
estudios de digestión de MNasa. Las reacciones de MNasa se realizaron combinando 30 μl
de nucleosoma (20 ng / μl) o ADN (20 ng / μl) en 2,5 μl de BSA (10 mg / ml), 25 μl de
tampón de 10 μNasa (New England). Biolabs), 2 \ mu l (200 unidades / \ mu l) de MNasa y
H2O doblemente destilada para aumentar el volumen de reacción total a 250 \ mu l. Se
recogieron 60 μl de la mezcla de reacción en diferentes puntos de tiempo. La reacción se
sofocó con 5 μl de EDTA 0,5 M y se almacenó en hielo. Se añadieron 4,2 \ mu l de SDS al
10% y 1 \ mu l de proteinasa K (20 mg / ml) en cada mezcla de reacción y se incubaron a
55ºC durante 30 minutos. El ADN se aisló por extracción con fenol-cloroformo. La cantidad
y longitud de ADN después de una digestión con MNasa de nucleosomas con H3 canónica,
H3Y41E o H3T45E se analizaron mediante PAGE nativa al 6% (véase la Fig. 3). La movilidad
relativa (Rf) de cada banda de la cámara ADN y producto de digestión MNasa se midió con
ImageQuant TL. El Rf y la longitud de cada banda de escalera de ADN se correlacionaron y
se usaron para calcular la longitud de cada banda observada en las reacciones de MNasa.

Cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz de ángulo múltiple (SEC-

MALS) La columna Superdex 200 HR 10/30 (volumen total de 24 ml, GE Healthcare) se
ejecutó en línea con el instrumento MALS. El caudal fue de 0,3 ml / min. Se inyectaron 100
μl de nucleosomas a 0,3 mg / ml en un tampón que contenía Tris 20 mM, pH 7,5, EDTA 1
mM, pH 8,0, TCEP 1 mM, KCl 0 mM. Las mismas muestras se usaron en SAXS (a una
concentración de KCl diferente). El peso molecular para cada muestra se calculó usando el
software ASTRA (tecnologías Wyatt).

Se usaron SAXS-Nucleosomas que contenían la secuencia de posicionamiento de ADN 601-

nucleosoma de 147 pb y los octámeros WT, H3Y41E o H3T45E en las mediciones de SAXS.
SEC-MALS (ver Fig. 4) se usó para verificar la pureza y la monodispersidad de cada muestra
de nucleosoma. Toda la recopilación de datos SAXS se realizó en la línea de haz SIBYLS
(12.3.1) en Advanced Light Source (Berkeley, CA). Los nucleosomas se midieron en el
tampón de referencia (Tris-HCl 20 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) o en el tampón de
referencia con KCl 50 mM para investigar la influencia de la fuerza iónica en la estructura
del nucleosoma. Para optimizar la calidad de los datos y minimizar el daño por radiación,
se realizaron series de exposición de 0.5, 1, 2 y 6 s. Los datos fueron procesados por
PRIMUS. La dimensión de los nucleosomas fue estimada por GNOM. Diez envolturas
moleculares aleatorias fueron construidas para cada nucleosoma por DAMMIN. Ellos
fueron superpuestos por DAMSUP. DAMAVER calculó las envolventes moleculares
promedio de estos 10 modelos aleatorios. El modelo promediado fue filtrado por
DAMFILT. Se construyeron y visualizaron proyectiles convexos de todos los modelos (ver
Fig. 5).

Para la determinación del radio de giro (Rg), se usaron datos de diluciones 1/16, expuestas
durante 1 s. Esto proporcionó datos sólidos a bajo ángulo con repulsión mínima entre
partículas debido a la naturaleza cargada de los nucleosomas. Un ejemplo típico para WT
se recolectó a \ sim 0,1 mg / ml. Los datos de los experimentos replicados se evaluaron
simultáneamente para cada mutante individual. Los valores del radio de giro se calcularon
mediante el análisis de Guinier, con un nuevo algoritmo5 aplicado a los triplicados de los
datos de dispersión experimental. El algoritmo optimiza un criterio de compensación de
sesgo-varianza y nos permite determinar los valores de Rg con la mayor precisión posible,
y al mismo tiempo proporcionar incertidumbres estadísticamente bien fundamentadas.
Fluorescencia de Resonancia Transferencia de Energía Mediciones de Desembalaje de
ADN-Se determinaron las eficacias de FRET a partir de los espectros de fluorescencia como
se describió previamente (27). Los espectros de fluorescencia se midieron con un
fluorómetro de estado estacionario de cuenta fotónica Fluoromax-4 (Horiba) a
temperatura ambiente (véase la Fig. 6). El fluoróforo donador de Cy3 se excitó a 510 nm, y
la emisión de fluorescencia se midió de 550 nm a 750 nm. El fluoróforo aceptor de Cy5 se
excitó directamente a 610 nm, y la emisión de fluorescencia se tomó de 650 nm a 750 nm.
A partir de estos espectros de fluorescencia, se determinaron las emisiones del aceptor
debidas a las excitaciones del donante y del aceptor. Las emisiones de fluorescencia (F) se
midieron integrando el espectro de fluorescencia de 656 a 674 nm después de restar los
espectros de fluorescencia del tampón de muestra sin nucleosomas. La eficiencia FRET, E,
se calculó mediante el método (ratio) A como se describió anteriormente con….
Los superíndices se refieren a los fluoróforos donadores (D) y aceptores (A), y los
subíndices se refieren a las frecuencias de iluminación de 510 nm para la excitación del
donador y 610 nm para la excitación del aceptor directo. Un prefactor de 2 refleja la
presencia de dos moléculas aceptoras por molécula donante. FA 510 es la emisión de
fluorescencia del aceptor después de la sustracción de la emisión del donante
superpuesto