DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA

Sumary

The chemical reactions that occur in living beings could not take place without the presence
of enzymes. These macromolecules, which generally are proteins, catalyze biochemical
reactions, allowing substrates become the products needed by the cell. Like any catalyst,
enzymes are not consumed in the reactions they catalyze, but unlike other catalysts of
inorganic nature, which catalyze reactions are very specific: only interact with certain
substrates, and only facilitate the course of certain reactions. An enzyme which can be found
in all living beings is catalase, necessary to decompose the hydrogen peroxide, a toxic
compound, which occurs during cell metabolism. This practice was carried out with the aim
of quantifying the total enzyme activity (FPA) activity test paper and quantify the enzymatic
productivity in two cropping systems.

Resumen

Las reacciones químicas que se dan en los seres vivos no podrían tener lugar sin la presencia
de los enzimas. Estas macromoléculas, que generalmente son proteínas, catalizan las
reacciones bioquímicas, permitiendo que los sustratos se conviertan en los productos que
necesita la célula. Como todo catalizador, los enzimas no se consumen en las reacciones que
catalizan, pero a diferencia de otros catalizadores de naturaleza inorgánica, las reacciones
que catalizan son muy específicas: sólo interaccionan con determinados sustratos, y sólo
facilitan el curso de determinadas reacciones. Un enzima que podemos encontrar en todos
los seres vivos es la catalasa, necesaria para descomponer el peróxido de hidrógeno, un
compuesto tóxico, que se produce durante el metabolismo celular. Esta práctica se realizó
con el objetivo de cuantificar la actividad enzimática total (FPA) prueba de actividad de
papel y cuantificar la productividad enzimática de dos sistemas de cultivo.
Introducción
La biotecnología permite disponer de
muchas enzimas que se utilizan en
solución y que tienen la ventaja de su bajo
costo, de no necesitar coenzimas y de
servir aun en preparaciones relativamente
burdas. Al parecer, las más utilizadas son
las hidrolasas (amilasas, celulasas,
proteasas, glucanasas, lipasas y pectinas).
La fermentación en medio sólido se
distingue de los cultivos sumergidos por el
hecho de que el crecimiento ocurre cerca
de superficies de materiales sólidos con
bajos contenidos de humedad, entre 30 y
80% (Laukevics et al, 1984). Los
sustratos tradicionales, usados para la
producción de alimentos fermentados
orientales en estado sólido, incluyen una
variedad de productos agrícolas, tales
como arroz, cebada, trigo, mijo, maíz, etc.
También sustratos no tradicionales pueden
ser usados para el desarrollo de procesos
de interés industrial, por ejemplo, residuos
agrícolas, como el bagazo de caña
(Carrizales, 1993; Solís-Pereira et al,
1996).
Los hongos filamentosos, han
evolucionado con una gran diversidad
bioquímica y un sistema enzimático que
los hace capaces de sobrevivir en hábitats
excepcionalmente variados. Debido a su
enorme versatilidad metabólica y a la
facilidad para cultivarlos son ampliamente
usados para la producción de sustancias de
interés comercial con gran variedad de
aplicaciones industriales, tales como,
productos alimenticios, enzimas (amilasa,
glucosa oxidasa, glucoamilasa, celulasa,
hemicelulasa, pectinasa, proteinasa,
catalasa y poligalacturonasa), metabolitos
primarios y secundarios, tales como ácido
orgánicos (ácido cítrico, ácido gálico y
ácido glucónico) y también antibióticos.
Además de su importancia económica, los
hongos filamentosos tienen propiedades
biológicas interesantes, tales como, su
complejo ciclo de vida, su diferenciación
celular, sus rutas metabólicas altamente
reguladas y su eficiencia en secreción de
proteínas, las cuales los hacen atractivos
como modelos para la investigación
biológica básica de organismos
eucarióticos (Van den Hondel y Punt,
1990).
A. niger está presente en todas partes del
mundo y se encuentra en casi todo tipo de
sustratos (alimentos, textiles, pieles,
plantas, etc.). También puede crecer en
20% de ácido tánico (Rippel, 1939), un
sustrato en el que muchos
microorganismos no son capaces de
crecer. Tal particularidad hace de A. niger
un microorganismo fácil de aislar entre
otros microorganismos sean bacterias,
hongos o levaduras (Van den Berg, 1992).
En consecuencia, varios trabajos se han
llevado a cabo para estudiar el efecto del
uso de diferentes fuentes de carbono
(almidón, harina de papas, afrechillo de
trigo, carboximetilcelulosa) y de diversos
microorganismos (Aspergillus fumigatus,
Bacillus sp., Aspergillus niger) en la
producción de amilasas (Bertolin et al.,
2003)
Los aditivos enzimáticos obtenidos en
procesos biotecnológicos empleando
desechos agrícolas a agroindustriales, son
incorporados directamente en el alimento
de pollos y cerdos en la etapa de iniciación
(Morillo et al., 2003). Estos aditivos
aportan enzimas tales como las amilasas,
las cuales complementan la actividad
desarrollada por las enzimas endógenas
del tracto intestinal de los animales,
permitiendo así, el uso de materias primas
alternativas de bajo precio sin desmejorar
la calidad de las dietas. Contribuye además
a disminuir los costos atribuibles a los
ingredientes usados en la alimentación
animal y a mejorar la ganancia de peso y
la conversión alimenticia (Palomo, 2008;
Bertsch et al., 2010). En consecuencia,
varios trabajos se han llevado a cabo para
estudiar el efecto del uso de diferentes
fuentes de carbono (almidón, harina de
papas, afrechillo de trigo,
carboximetilcelulosa) y de diversos
microorganismos (Aspergillus fumigatus,
Bacillus sp., Aspergillus niger) en la
producción de amilasas (Bertolin et al.,
2003; Lagunas et al., 2006; Oliveira et
al., 2007; Grata et al., 2008; Gupta et al.,
2008; Díaz, 2010; Asad et al., 2011;
Domínguez et al., 2011.
Una enzima en un catalizador biológico
que lleva a cabo reacciones bioquímicas a
muy altas velocidades y con un elevado
grado de especificidad; en su ausencia la
mayoría de las transformaciones químicas
requeridas para mantener activas las
células tardarían mucho tiempo en
efectuarse o simplemente no procederían.
(Baduí S., 1996).
Los enzimas amilololíticos pueden
clasificarse de diversas formas, por
ejemplo, según el tipo de substrato y el
producto que originan se dividen en α-
amilasas, β-amilasas, glucoamilasas,
pululanasas, isoamilasas, α-glucosidasas y
ciclodextringlicosiltransferasas
Los organismos productores de enzimas
más útiles y mejor conocidos son los
Aspergillus niger, A oryzae y Bacillus
subtilis. En general las enzimas fúngicas
tienen un pH óptimo ácido o neutro y no
son termoestables, en tanto que las
enzimas bacterianas tienden a tener un pH
óptimo alcalino o neutro y con frecuencia,
son termoestables.
Es bien conocida la habilidad de muchas
especies diferentes de Aspergillus para
producir proteasas. Algunos estudios
recientes han revelado la habilidad de
Aspergillus tamari, un hongo filamentoso
xilanolítico, que se aisló del suelo para
producir proteasa alcalina en fermentación
en estado sólido. (Ferreira y col. 1999).
Las proteasas y amilasa no son exclusivas
de cepas fúngicas, también euabacterias
como Streptomycetes tienen la capacidad
para producir enzimas proteolíticas
Las α-amilasa son producidas por varias
bacterias, levaduras y hongos. Las
bacterias del género Bacillus se consideran
la fuente más importante de α-amilasas.
Entre los hongos, los microorganismos del
género Aspergillus son los principales
productores de α-amilasas con aplicación
industrial. (Pandey et al., 2000).
En general, los microorganismos son los
principales productores de enzimas
amilolíticos con aplicación industrial. En
concreto las bacterias del género Bacillus
producen las α-amilasas de interés
comercial mientras que el hongo
Aspergillus niger es el productor de las
glucoamilasas que se utilizan en la
degradación del almidón. En la actualidad,
la demanda de amilasas termoestables está
aumentando debido a que la realización de
los procesos de hidrólisis a elevadas
temperaturas minimiza el riesgo de
contaminación microbiológica y reduce el
tiempo de reacción (Pandey et al., 2000;
Bertoldo y Antranikian, 2002).
Aspergillus niger, se cultivó en un medio
rico que contenía almidón soluble 1%
(p/v) como fuente de carbono, peptona
0.2% (p/v), extracto de levadura 0.1%
(p/v), Casaminoácidos 0.15% (p/v) y una
solución compleja de sales y vitaminas
descritas por Cove (1966)
TABLA N° 1: PROPIEDADES DE

ALGUNAS α- AMILASA FUNGICAS

Fuente: Fogarty, (1973) Microbial
amylases
I. Materiales y métodos
3.1. Materiales
Biomasa (cepa Aspergillus niger) Matraces
Sustrato tiras de papel de 1*6cm Rotuladores
Búfer pH 5.5 Ligas
Agua destilada Papel reciclado
Solución madre de 1gr glucosa/ml Incubadora
DNS Balanza analítica
Tubos de ensayo Espectrómetro
3.2. Procedimiento
1) Evaluación de la actividad enzimática
a. Curva patrón:
1. Preparar diluciones de enzima cruda, en búfer fosfato pH 5.5)

Enzima cruda

Diluciones 1/10, 1/25, 1/40

10ml de cada una de las diluciones
Preparar sustrato cortar tiras de papel filtro wat man Nº 1 1cm*6cm
Preparar la curva patrón de glucosa de 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 y 1 mg/ml, preparar
una solución madre de 1mg/ml, preparar las diluciones:

Blanco reactivo 0.1

0.2 0.2
0.6 0.3
0.3 0.4
0.8 0.5
1ml
0.1
1.4 0.2
1.3 1.2
0.3 0.4
1.1 0.5
1+
Solución madre +
+
+ +
+ +
+
Búfer 1.2
+
1.1 1+ml
1.4
0.1 1.3
0.1 0.1 0.1 0.1

2. Adicionar 3 ml de DNS (a cada tuvo)

3. Llevar a temperatura de ebullición durante 5 minutos
4. Adicionar 5 ml de agua destilada fría a cada tubo (es por duplicado)
 5. Leer absorbancia a 490nm
6. Hallar la ecuación de la curva Y=a + bx

b. Muestra:

M BM BPF BR
Búfer 1 1 1.5 1.5
Enzima 0.5 0.5 …. …
papel si no si …..

1. A cada uno adicionar 3 ml de 3. Enfriar la reacción

DNS 4. Adicionar 5 ml de agua
2. Encubar 5 minutos a
temperatura de ebullición

[𝐺𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎] = [𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑀𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 + 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑐𝑟𝑢𝑑𝑎]

− [𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑎 𝑝𝑎𝑝𝑒𝑙 𝑓𝑖𝑙𝑡𝑟𝑜]

2.- cuantificación de la biomasa de cada sistema de cultivo

-Filtrar el cultivo y secar durante 24 horas a 80ºC
-Peso de papel y calcular
-Hallar la productividad:
𝐴𝐸
𝑃𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑖𝑏𝑖𝑑𝑎𝑑 =
𝐵𝑖𝑜𝑚𝑎𝑠𝑎
II. Resultados

4.2. Resultados de actividad enzimática.

Tabla n°01: Datos obtenidos por lectura de absorbancia a 540nm

Absorbancia Promedio Glucosa

1 2
0.088 0.087 0.0875 0.2
0.257 0.248 0.2525 0.4
0.435 0.441 0.438 0.6
0.66 0.638 0.649 0.8
0.821 0.857 0.839 1

Figura n°01: Curva de Absorvancia vs Glucosa

Curva glucosa
1
0.8
ABSORVANCIA

0.6 y = 0.9498x - 0.1167

R² = 0.9983
0.4
0.2
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2
GLUCOSA

Interpretación: En esta grafica se observa una línea exponencial es decir según va

aumentando la glucosa la Absorvancia va aumentando en cada muestra que observamos.

Tabla n°02: Datos obtenidos como es actividad enzimática, glucosa para dilución 1/20

DILUCION 1/20
M BM BPF glucosa AE
0.176 0.093 0.026 0.057 0.4332
0.155 0.091 0.03 0.034 0.2584
0.178 0.095 0.036 0.047 0.3572
PROMEDIO 0.16966667 0.093 0.046 0.3496
0.03066667
DESVIACION 0.01274101 0.002 0.00503322
Interpretación: glucosa=M-BM-BPF M: muestra; BM: blanco
muestra; BPF: blanco papel filtro F: factor de conversión
0.38; D: dilución 1/20.Actividad enzimática (AE)=glucosa*F*D
 Tabla n°03: Datos obtenidos como es actividad enzimática, glucosa para dilución 1/15

DILUCION 1/15
M BM BPF AE
glucosa
0.322 0.177 0.122 0.023 0.1311
0.301 0.16 0.101 0.04 0.228
0.351 0.155 0.107 0.089 0.5073
promedio 0.32466667 0.164 0.11 0.05066667 0.2888
desviación 0.02510644 0.01153256 0.01081665
Interpretación: glucosa=M-BM-BPF M: muestra; BM: blanco
muestra; BPF: blanco papel filtro F: factor de conversión
0.38; D: dilución 1/15.
Actividad enzimática (AE)=glucosa*F*D

Tabla n°04: Datos obtenidos como es actividad enzimática, glucosa para dilución 1/10

DILUCION 1/10
M AE
BM BPF glucosa
0.325 0.102 0.085 0.138 0.5244
0.311 0.092 0.083 0.136 0.5168
0.302 0.107 0.072 0.123 0.4674
0.305 0.109 0.078 0.118 0.4484
promedio 0.31075 0.1025 0.0795 0.12875 0.48925
desviación 0.01021029 0.00759386 0.0058023
Interpretación: glucosa=M-BM-BPF M: muestra; BM: blanco
muestra; BPF: blanco papel filtro F: factor de
conversión 0.38; D: dilución 1/10.

Actividad enzimática (AE)=glucosa*F*D

Tabla n°05: Datos obtenidos como es actividad enzimática, glucosa para dilución 1/20

DILUCION
1/20
M BM AE
BPF Glucosa
0.24 0 0.055 0.185 1.406
0.231 0 0.051 0.18 1.368
0.222 0 0.053 0.169 1.2844
promedio 0.231 0 0.053 0.178 1.3528
desviación 0.009 0 0.002

INTERPRETACION: glucosa=M-BM-BPF M: muestra; BM: blanco

muestra; BPF: blanco papel filtro F: factor de conversión
0.38; D: dilución 1/20.
 Actividad enzimática (AE)=glucosa*F*D

Tabla n°06: Datos de actividad enzimática en sistema biopelicula y sumergido

AE1 AE2 PROMEDIO SD

biopelicula 0.48925 1.3528 1.84205 0.61062206
sumergido 0.3496 0.2888 0.3192 0.04299209

Figura n°02: Actividad enzimática en sistemas de biopelicula y sumergido

Actividad enzimatica

1 Series1

0
biopelicula sumergido

Interpretación: En esta grafica observamos que la producción de actividad enzimática

el sistema de biopeliculas en comparación del sistema de sumergido , el sistema de
biopeliculas es más productivo para la producción de enzimas .

Tabla n°07: hallando concentración de glucosa para el sistema sumergido, dilución 1/15

SUMERGIDO(DILUCION 1/15)
M BM X1 X2 X3
BPF
0.322 0.177 0.122 0.46188671 0.30922299 0.25131607
0.301 0.16 0.101 0.4397768 0.29132449 0.22920615
0.351 0.155 0.107 0.49241946 0.28606022 0.23552327
Interpretación: Reemplazando en la ecuación y = 0.9498x - 0.1167 para hallar la
concentración en el sistema sumergido, dilución 1/15para M, BM, BPF.

Tabla n°08: hallando concentración de glucosa para el sistema sumergido, dilución 1/20

SUMERGIDO(DILUCION 1/20)
M BM X1 X2 X3
BPF
0.176 0.093 0.026 0.30817014 0.22078332 0.15024216
0.155 0.091 0.03 0.28606022 0.21867762 0.15286797
0.178 0.095 0.036 0.31027585 0.22288903 0.15886797
Interpretación: reemplazando en la ecuación y = 0.9498x - 0.1167 para hallar la
concentración en el sistema sumergido, dilución 1/20 para M, BM, BPF.
 Tabla n°09: hallando concentración de glucosa para el sistema biopeliculas, dilución
1/10

BIOPELICULA(DILUCION 1/10)
M BM BPF X1 X2 X3
0.325 0.102 0.085 0.46504527 0.230259 0.2123605
0.311 0.092 0.083 0.45030533 0.21973047 0.21025479
0.302 0.107 0.072 0.44082965 0.23552327 0.1986734
0.305 0.109 0.078 0.44398821 0.23762897 0.20499052

Interpretación: reemplazando en la ecuación y = 0.9498x - 0.1167 para hallar la

concentración en el sistema de biopeliculas, dilución 1/10 para M, BM, BPF.

Tabla n°10: hallando concentración de glucosa para el sistema biopeliculas, dilución

1/20

BIOPELICULA(DILUCION 1/20)
M BM BPF X1 X2 X3
0.24 0 0.055 0.37555275 0 0.1807749
0.231 0 0.051 0.36607707 0 0.17656349
0.222 0 0.053 0.35660139 0 0.17866919
Interpretación: reemplazando en la ecuación y = 0.9498x - 0.1167 para hallar la
concentración en el sistema de biopeliculas, dilución 1/20 para M, BM, BPF.

III. Discusiones
Según Doran (1998), la curva de referencia construida con cantidades conocidas de una
sustancia que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia presente en una muestra
incógnita. En muchas determinaciones se cumple una relación proporcional entre la
magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del reactivo que la provoca.
Por ejemplo, si la presencia de 10ug de proteínas en una solución genera la aparición de un
color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20ug de proteína
dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente.
Según VanDer (1975), la curva de calibración esta dado con datos reales, los gráficos que se
obtienen no son tan ideales, pero esta situación no es un obstáculo ya que dentro de ciertos
valores es posible trazar la recta más probable que une una serie de puntos con el uso de los
programas de cálculo de las computadoras. Hay que advertir que una respuesta lineal no se
obtiene en todo el rango de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores
que dependen de numerosos factores dependientes del método de medición. Por otra parte
este tipo de curvas no se imita solamente a la determinación de un elemento o compuesto
químico sino que tiene múltiples aplicaciones.
Según Van Weel (1959); la espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en
las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar
la radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida
de soluto y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia “Espectro de
Absorción”.

En cuanto a la actividad enzimática en el cultivo sumergido resulto 1.120 UI/ml, lo que no

concuerda con los resultados obtenidos por Vilches (2002) que es de 0.014 a 0.073 UI/ml,
siendo este el mejor cultivo para la evaluación de actividad enzimática, en el cultivo
Biopelicula lo obtenido en la práctica fue de 1.246 UI/ml, sobre la información de cultivo
biopelicula no se ha encontrado referencia bibliográfica que permita ampliar la discusión
correspondiente.