Metode Uji (Robustness) Kekuatan dan SST

I. (Robustness) Kekuatan

Metode robustness mrupakan kemampuan metode analisis untuk memvalidasi

kekuatan suatu metode yang kecil dan terus menerus mengevaluasi respon analitik dan efek
presisi dan akurasi. Serta dapat memeberikan indikasi dalam penggunaan secara normal.
Stabilitas dari nilai yang diamati dapat diuji dengan mengubah beberapa kondisi analisis
seperti pH pelarut, suhu raksi, waktu reaksi atau penambahan reagen. Ketika nilai yang
diamati tidak stabil, prosedur analisis harus diperbaiki. Untuk mevalidasi kekuatan suatu
metode perlu dibuat perubahan metodologi yang kecil dan terus menerus seta mengevaluasi
respon nalitik dan efek pada presisi dan akurasi. Aspek metode yang mungkin mempengaruhi
hasil harus diidentifikasi, dan mempengaruhi kinerja metode dievaluasi dengan menggunakan
tes robustness. Metode uji ini dengan sengaja memperkenalkan perubahan kecil prosedur dan
memriksa efek pada hasil. Sejumlah aspek dari metode ini mungkin perlu dipertimbangkan,
tetapi karena sebagian besar akan memiliki efek yang dapat diabaikan biasanya mungkin
untuk beberapa variasi. Sebagai contoh, perubahan yang dibutuhkan untuk menunjukkan
kekukatan prosedur HPLC dapat mencakup (tapi tidak dibatasi) perubahan komposisi organik
fase gerak (1%), pH fase gerak (±0,2 unit) dan perubahan temperatur kolom (± 2-3°C).
Contoh faktor-faktor yang tes kekasaran dapat mengatasi adalah: perubahan dalam instrumen,
operator, atau merek reagen; konsentrasi reagen; pH suatu larutan; suhu reaksi; waktu
diizinkan untuk menyelesaikan proses, dan lain-lain.
Perubahan lainnya dapat dilakukan bila sesuai dengan laboratorium. Identifikasi
sekurang-kurangnya 3 faktor analisis yang dapat mempengaruhi hasil bila diganti atau
diubah. Faktor ini dapat diidentifikasi sebgaia A, B, dan C. Perubahan nilai faktor-faktor ini
dapat diidentifikasi dengan a,b dan c. Lakukan analisis pada kondisi yang telah disebutkan
pada pemerikasaan ruggedness. Berikut ini, merupan petunjuk pelaksaan validasi metode dan
cara perhitungannya :
Nilai Faktor Penetapan Faktor Eksperimen

A atau a #1 #2 #3 #4
B atau b A A a a
C atau c B b B b
D atau d C c c C
Untuk menentukan efek perubahan A, bandingkan rata-rata hasil (#1 + #2)/2 dengan (#3 +
#4)/2, untuk efek perubahan B, bandingkan (#1 + #3)/2 dengan (#2 + #4)/2 dan seterusnya.
Sebagai contoh seorang peneliti menguji metode penentuan azithromycin dengan
HPLC dengan prosedur sama oleh analis yang berbeda. Robustness dilakukan dengan
melakukan variasi terhadap komposisi fase gerak yaitu ±2.0% (22:78-18:82), variasi laju alir
±10% (1,1 mL sampai 1,3mL/min) dan variasi suhu Column ±5.0°C (40°C -50°C). Hasil
penentuan robustness dapat dilihat pada tabel berikut :

Ketahanan suatu metode analisis adalah ukuran dari kemampuannya untuk tetap tidak
terpengaruh oleh variasi kecil, tetapi disengaja dalam parameter metode, dan memberikan
indikasi kehandalan selama penggunaan normal. Ketangguhan metode kromatografi,
misalnya, dapat dievaluasi oleh variasi dalam parameter seperti komposisi fase gerak, pH dan
kekuatan ion, suhu dan banyak yang berbeda atau pemasok kolom. Evaluasi ketahanan harus
dipertimbangkan dalam tahap pengembangan metode. Bahkan, proses validasi metode tidak
dapat dipisahkan dari perkembangan aktual kondisi metode, karena tidak mungkin untuk
mengetahui apakah kondisi metode dapat diterima sampai studi validasi dilakukan. Evaluasi
kekerasan kromatografi metode sering kompleks, dengan mempertimbangkan jumlah besar
parameter analisis yang harus dianggap melakukan tes. Beberapa penulis memilih parameter
analisis analisis yang spesifik untuk dievaluasi, interpretasi data dilakukan dengan t-test atau
uji ANOVA.
Tabel di atas merupakan hasil dari uji robustness dengan menggunakan HPLC, Pengujian ini
dilakukan untuk mengetahui kestabilan metode analisis (tidak terpengaruh oleh variasi yang
diberikan). Salah satu contoh yaitu ketegaran metode uji penentuan ketoprofen dengan HPLC
dilakukan dengan kondisi variasi dan variasi standar deviasi relatif yang diperoleh pada uji
ketegaran adalah 1,42%, yang berarti metode ini memiliki kestabilan yang baik terhadap
variasi waktu yang diberikan karena memenuhi kriteria penerimaan yaitu <2%.

II. System Suitability Test

Uji kesesuaian sisitem dilakukan untuk memastikan suatu sistem berjalan dengan baik
dan benar serta memastikan bahawa sistem dan prosedur yang digunakan harus mampu
memberikan data yang dapat diterima. Tujuan dilakukan uji kesesuaian sistem untuk
menhetahui apakah metode analisis masih mmeberikan hasil yang sama atau masih bisa
digunakan. Uji kesesuaian sisitem didasarkan pada konsep bahwa elektronik, peralatan, zat
uji, dan kondisi operasional analit merupaka suatu sistem analit tunggal yang dapat diuji
fungsinya secara keselurhan. Data dapat dikumpulkan dari penyuntingan berulang larutan
standar dan uji sebanyak 6 kali, diefaluasi kromatografinya dengan melihat faktor kapasitas,
presisi, retensi relatif, resolusi, tailing factor (faktor ikutan), jumlah lempeng teoritis.
a. Faktor kepastian (k’)
Faktor kepastian memastikan bahwa peak yang diharapkan tidak mengganggu
volume kosong, setiap peak harus terpisan dari kromatogram yang lain dan volume
kosong. Nilai faktor kepastian sebaikknya >2
b. Presisi
Nilai RSD ≤ 1 untuk n ≥ 5
c. Retensi relatif
Untuk mempandingkan letak kromatogram dengan standart, nilai retensi relatif yang
baik 95%-101%
d. Resolusi
Mengukur keterpisahan dua puncak , nilai Rs >2
e. Tailing factor (faktor ikutan)
Untuk menguji kesimetrisan kromatogram, nilai faktor ikutan yang baik ≤ 2
f. Jumlah lempeng teoritis
Nilai jumlah lempeng teoritis sebaikknya > 2000
Misalnya, dilakukan enam kali penyuntikan terhadap sampel dengan konsentrasi 10
µg/ml, yang mengandung standar internal 5 µg/ml, kemudian diamati waktu retensi, rasio
luas area, dan rasio tinggi puncak kromatogram. Konsentrasi tersebut dipilih untuk mewakili
konsentrasi rendah, diasumsikan jika hasil konsentrasi rendah sudah dapat memberikan nilai
yang baik, maka diharapkan konsentrasi tinggi memberikan nilai yang baik pula. hasilnya
dapat diketahui KV dari waktu retensi, rasio luas area kromatogram, dan rasio tinggi puncak
kromatogram < 4%, nilai ini menunjukkan bahwa metode analisis yang digunakan telah
memenuhi kriteria kesesuaian sistem yaitu KV < 10%.
Kesesuaian sistem juga digunakan untuk mengetahui faktor asimetri dan faktor ikutan
(tailing factor) dari puncak. Asimetri dan faktor ikutan digunakan untuk mengetahui kondisi
kolom dan kondisi percobaan. Asimetri puncak dengan konsentrasi10 µg/ml dan adalah 0
(terdapat pada hasil kromatogram), dapat dilihat pada kromatogram kesesuaian sistem bahwa
kedua puncak terlihat cukup simetris. Nilai tersebut telah memenuhi kriteria nilai asimetri
yakni < 2. Nilai faktor ikutan untuk puncak dari kedua sampel adalah 0 (terdapat pada hasil
kromatogram),. Faktor ikutan yang diperoleh telah memenuhi nilai persyaratan, yaitu < 2.