LAPORAN PRAKTIKUM

BIOKIMIA

PEMISAHAN DAN IDENTIFIKASI

ASAM AMINO

NAMA : MUSRIFAH TAHAR

NIM : H311 13 035
KELOMPOK : I (SATU)
HARI / TGL. PERCOBAAN : KAMIS/ 09 APRIL 2015
ASISTEN : HIKMAWATI

LABORATORIUM BIOKIMIA
JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS HASANUDDIN
MAKASSAR
2015
 BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Asam amino merupakan asam yang mempunyai sebuah asam karboksilat

dan gugus amina dalam sebuah molekul. Akibatnya, suatu asam amino akan

mengalami reaksi asam-basa dalam molekulnya, untuk membentuk suatu ion

dipolar, yaitu suatu ion yang mempunyai muatan positif dan negatif. Asam amino

pada umumnya diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, dengan cara ini

diperoleh campuran bermacam-macam asam amino dan untuk menentukan jenis

asam amino maupun kuantitas masing-masing asam amino perlu diadakan

pemisahan antara asam-asam amino tersebut.

Analisis asam amino dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa

cara, salah satunya adalah dengan kromatografi partisi. Metode ini didasari

oleh kemampuan suatu jenis asam amino yang terlarut dalam suatu campuran

pelarut tertentu pada fase stasioner. Pada kromatografi lapis tipis, yang

digunakan sebagai fasa stasioner adalah suatu lembaran tipis siliki gel. Untuk

dapat memperoleh pemisahan asam amino yang baik, maka dapat digunakan dua

fase pelarut atau tiga fase pelarut. Namun pada percobaan ini digunakan tiga

fase, yaitu n-butanol, asam asetat, dan air. Selain itu kita akan menentukan nilai

Rf asam amino serta mengidentifikasi asam amino dalam suatu larutan sampel

berdasarkan nilai Rf menggunakan kromatografi lapis tipis, sehingga kita akan

lebih memahami pemisahan dan identifikasi asam amino. Untuk lebih

memperdalam tentang metode ini, maka didilakukanlah percobaan mengenai

pemisahan dan identifikasi asam amino ini.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan

1.2.1 Maksud Percobaan

Maksud dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memahami cara

pemisahan dan identifikasi asam amino dengan metode KLT.

1.2.2 Tujuan Percobaan

Tujuan dari percobaan ini adalah:

1. Menentukan nilai Rf larutan asam amino dan larutan sampel.

2. Mengidentifikasi asam amino dalam larutan sampel berdasarkan nilai Rf.

1.3 Prinsip Percobaan

Identifikasi asam amino berdasarkan perbedaan nilai Rf dengan

menggunakan metode kromatrografi lapis tipis yang fase geraknya terdiri dari

campuran n-butanol, asam asetat dan air dengan fase diamnya adalah lapis tipis

KLT. Karena setiap asam amino memiliki nilai Rf yang berbeda maka sampel

asam amino yang tidak diketahui dapat ditentukan jenisnya berdasarkan dengan

nilai Rf standar.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino yang diperoleh dari larutan hidrolisis protein adalah asam

amino α. Artinya, gugus amino berada pada atom karbon α, yaitu disebelah gugus

karboksil. Kecuali glisin, dengan R = H, asam amino α memiliki pusat stereogenik

pada karbon α. Dengan demikian, semua asam amino α kecuali glisin bersifat

aktif optis (Hart dkk., 2003).

H CH CO2H
NH2

Gambar 1. Struktur Glisin

Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan

gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai ion karboksilat. Struktur

dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki

titik leleh yang agak tinggi (bahkan yang paling sederhana, glisina, meleleh pada

suhu 233°C) dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah). Asam amino

bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton

pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton

dari asam kuat. Perilaku ini dinyatakan dalam kesetimbangan berikut untuk asam

amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil (Hart dkk., 2003).

Asam amino merupakan asam karboksilat yang mengandung fungsi

amina. Dalam kondisi cer-tain gugus amina dari satu molekul dan gugus

karboksil dapat bereaksi, menyatukan dua asam amino oleh ikatan amida.

Protein alami polipeptida yang mengandung lebih dari 50 asam amino.

Unit kebanyakan protein adalah polimer dari 100-300 asam amino.

Hal yang paling mencolok tentang protein adalah keragaman peran mereka dalam

hidup sistem-sistem sutra, rambut, kulit, otot, dan jaringan ikat adalah protein, dan

hampir semua enzim adalah protein (Carey, 2000).

Asam amino merupakan komponen utama penyusun protein, dan dibagi

dalam dua kelompok yaitu asam amino esensial dan non esensial. Asam amino

esensial tidak dapat di produksi oleh tubuh sehingga sering harus ditambahkan

dalam bentuk makanan, sedangkan asam amino non esensial dapat diproduksi

dalam tubuh. Asam amino umumnya berbentuk serbuk dan mudah larut dalam air,

namun tidak larut dalam pelarut organik non polar (Sitompul, 2004).

Kromatografi kertas, merupakan salah satu jenis kromatografi partisi, yaitu

pemisahan beberapa zat berdasarkan perbedaan kelarutan dalam dua pelarut yang

tidak dapat bercampur. Cara melakukan pemisahan dengan kromatografi ini

cukup sederhana. Campuran beberapa asam amino sebagai hasil hidrolisis

diteteskan sedikit demi sedikit pada kertas kromatografi pada pada titik tertentu

(A) dan kemudian ujung kertas dicelupkan ke dalam pelarut tertentu. Pelarut ini

akan naik berdasarkan proses kapilaritas dan akan membawa senyawa-senyawa

dalam campuran tersebut. Asam amino yang mudah larut dalam pelarut tertentu

itu, misalnya pelarut organik, akan terbawa naik lebih jauh daripada yang sukar

larut. Setelah pelarut mencapai bagian atas atau garis akhir, kertas diangkat dari

pelarut kemudian dibiarkan kering dengan sendirinya di udara. Dengan proses ini

asam-asam amino akan terpisah satu dengan yang lain, dengan penyemprotan

pereaksi ninhidrin pada kertas kromatografi tersebut kan tampak noda-noda biru

yang membuktikan adanya asam amino yang terpisah itu. Jarak yang telah

ditempuh oleh suatu asam amino tertentu (b), dibandingkan dengan jarak yang

ditempuh oleh suatu pelarut dari garis awal hingga garis akhir (a) diberi lambang
Rf. Harga Rf yaitu b/a merupakan ciri khas suatu asam amino pada pelarut

tertentu. Dengan menggunakan standar asam-asam amino yang telah diketahui

macamnya pada kromatografi kertas seperti yang telah dilakukan di atas, dapat

diketahui macam asam amino yang diperiksa (Poedjiadi dan Supriyanti, 2007).

Dalam tekhnik kromatografi, sampel yang merupakan campuran dari

bermacam-macam senyawa (komponen) dialirkan melewati suatu sistem

kromatografi. Sifat dari komponen- komponen penyusun campuran tersebut akan

menentukan apakah mereka bisa bergerak atau tidak dalam sistem itu. Karena itu

dalam kromatografi, perlu dilakukan pemilihan fase bergerak maupun fase diam

sedemikian rupa sehingga semua komponen bisa bergerak dengan kecepatan yang

berbeda-beda sehingga proses pemisahan dapat terjadi (Sudarmadji dkk., 2003).

Fase stasioner dapat berupa padatan maupun cairan, sedangkan fase

bergerak dapat berupa cairan maupun gas. Dalam semua teknik kromatografi,

zat-zat terlarut yang dipisahkan bermigrasi sepanjang kolom, dan tentu saja

laju pemisahan terlatak dalam laju perpindahan yang berbeda untuk larutan

yang berbeda (Day dan Underwood, 2002).

Sumber protein yang mengandung semua asam amino esensial dianggap

protein yang lengkap, sementara mereka yang tidak mengandung semua asam

amino esensial dianggap tidak lengkap. Perbaikan terbaru dalam pengolahan

protein dari makanan (misalnya, protein kedelai, protein telur, kasein) dalam

bentuk suplemen gizi telah mengakibatkan jumlah tinggi asam amino esensial dan

jumlah rendah lemak makanan. Protein adalah protein berkualitas tinggi, yang

mengandung jumlah yang lebih tinggi dari semua asam amino yang diperlukan

bila dibandingkan dengan sumber makanan umum lainnya (Misalnya, telur,

kedelai, susu, dan sebagainya) (Kerksick dkk., 2006).

 BAB III

METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Percobaan

Bahan yang digunakan pada percobaan ini adalah larutan sampel, larutan

asam amino 0,01 M (glisin, alanin, asparagin), eluen (n-butanol, asam asetat, dan

air), plat KLT, larutan ninhidrin 2 %, akuades, kertas label, dan tissue roll.

3.2 Alat Percobaan

Alat yang digunakan pada percobaan ini adalah plat KLT, chamber, oven,

pipa kapiler 0,5 µL, gelas ukur 10 mL, botol semprot, pipet tetes, gegep, pinset,

cawan petri, pensil, penggaris, dan gunting.

3.3 Prosedur Percobaan

3.3.1 Pembuatan Eluen

Chamber disiapkan dan dibersihkan. Eluen yang digunakan yaitu

n-butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 mL

dimasukkan ke dalam gelas ukur kemudian dipindahkan ke dalam chamber.

Setelah itu chamber ditutup rapat dengan menggunakan isolasi, hingga

eluen jenuh.

3.3.2 Penotolan Sampel

Plat KLT dikeringkan terlebih dahulu kemudian plat KLT digunting

dengan ukuran yang telah ditentukan dengan 1 cm dari tepi atas dan tepi bawah.

Kemudian larutan asam amino dan larutan sampel ditotolkan pada plat KLT pada

titik yang ditentukan dengan menggunakan pipa kapiler 0,5 µL. Plat KLT yang

telah ditotol kemudian dikeringkan pada suhu ruangan.

3.3.3 Proses Elusi

Setelah chamber dijenuhkan dari eluen, plat KLT yang telah ditotol oleh

larutan asam amino dan larutan sampel dimasukkan ke dalam chamber untuk

dielusi. Proses elusi dihentikan ketika eluen telah mencapai batas yang telah

ditentukan. Plat KLT dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan dalam suhu

kamar. Setelah itu plat disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %, kemudian

dikeringkan dalam inkubator. Setelah plat KLT kering, terbentuklah noda. Noda

yang dihasilkan diberi lingkaran dengan menggunakan pensil serta diukur jarak

totolan ke noda dan jarak tempuh eluen dengan menggunakan penggaris untuk

menentukan nilai Rf larutan dan dilakukan identifikasi larutan asam amino.

 BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

Berdasarkan hasil pengamatan terhadap larutan asam amino (glisin,

alanin, asparagin) dan larutan sampel dengan menggunakan kromatografi lapis

tipis (KLT) dengan proses elusi, diperoleh data sebagai berikut.

Tabel 1. Data Hasil Pengamatan

No. Larutan Jarak eluen (cm) Jarak noda (cm) Rf (cm)

1. Glisin 5,1 1,35 0,26

2. Alanin 5,1 1,3 0,25

3. Asparagin 5,1 1,8 0,35

4. Larutan sampel 5,1 1,35 0,26

4.2 Reaksi

4.2.1 Glisin + Ninhidrin

4.2.2 Alanin + Ninhidrin
O

C OH

C + H3C CH COOH

C OH
NH2

ninhidrin alanin

O
O

HO C
C OH
C
C + NH3 +
H C
C OH

O
O
hidridantin
ninhidrin
O

HO C

+ H3C CH + NH3 + CO2

C

H C O

hidridantin

O O

C C

C N C + 3H2O

C C

OH O

diketodihidrindilendiketodihidrindamin
warna biru ungu
4.3 Pembahasan

Percobaan ini dilakukan untuk mengidentifikasi larutan asam amino (glisin

dan tirosin) dan larutan sampel menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT)

dengan proses elusi dan menghitung nilai Rf yang diperoleh dari perbandingan

jarak noda dan eluen.

Pembuatan larutan eluen dilakukan dengan cara pencampuran antara

larutan n-butanol, asam asetat, dan air dengan perbandingan 2,5 : 0,6 : 2,6 v/v.

Pemilihan ketiga pelarut ini didasarkan pada perbedaan kepolaran dari ketiga

pelarut tersebut, dengan urutan kepolaran air > n-butanol > asam asetat. Hal ini

dilakukan agar pada saat pengidentifikasian asam aminonya, akan terlihat lebih

jelas perbedaan dari noda yang ditimbulkan. Setiap asam amino memiliki

koefisien partisi tertentu untuk pasangan pelarut tertentu. Asam amino yang

amemiliki afinitas terhadap fasa gerak (pelarut) yang lebih besar akan tertahan

lebih lama pada fasa gerak, sedangkan zat terlarut yang afinitasnya terhadap fasa

gerak lebih kecil akan tertahan lebih lama pada fasa diam. Dengan demikian asam

amino dapat dipisahkan akibat perbedaan migrasi di dalam fasa gerak dan fasa

diamnya. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam

amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas

kromatografi dan sifat kimianya berdasarkan pada warna yang timbul ketika

disemprot dengan larutan ninhidrin.

Pemotongan kertas KLT yang disesuaikan dengan ukuran chamber yang

digunakan. Sebelum dilakukan penotolan larutan asam amino, plat KLT terlebih

dahulu diaktifasi melalui pemanasan. Tujuan pengaktifan ini yaitu menghilangkan

uap air pada plat KLT, sehingga dalam proses elusi nantinya plat KLT dapat
menyerap eluen dengan baik. Setelah dilakukan aktifasi plat KLT, selanjutnya

larutan asam amino ditotolkan pada plat KLT di bagian base line tepi bawah

menggunakan pipa kapiler. Setiap penotolan asam amino dilakukan tegak lurus

dengan bidang tempat menotol, serta hanya dilakukan satu kali. Tujuannya adalah

untuk menghindari terjadinya komet (noda berekor) pada plat.

Sebelum plat KLT dimasukkan ke dalam chamber, chamber terlebih

dahulu dijenuhkan dengan eluen dengan cara menutup rapat chamber yang berisi

eluen dengan menggunakan isolasi. Tujuan penjenuhan ini adalah agar proses

elusi dapat berjalan dengan cepat serta untuk mencegah penguapan eluen. Setelah

eluen dijenuhkan dan plat KLT telah ditotolkan larutan asam amino dan sampel,

plat KLT dimasukkan dalam chamber dan dilakukan proses elusi sampai bayang-

bayang eluen mencapai end line (batas akhir elusi). Setelah plat KLT diangkat

dari eluen, kemudian dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin,

yang bertujuan untuk memberikan warna pada noda asam amino dan ninhidrin

berfungsi sebagai pereaksi spesifik terhadap asam amino dengan membentuk

warna ungu (lembayung) bagi asam amino glisin dan larutan sampel. Untuk

memperjelas noda asam amino, plat KLT dimasukkan dalam inkubator. Proses

elusi dibiarkan beberapa saat agar eluen mencapai jarak tertentu yang telah diberi

tanda dan setelah sampai pada garis tanda, plat KLT dikeringkan dengan

inkubator agar pelarut menguap sempurna sehingga noda yang terbentuk tidak

melebar. Selanjutnya dilakukan pengukuran jarak eluen dan jarak noda dari

tempat penotolan.

Berdasarkan hasil perhitungan nilai Rf, maka diperoleh nilai Rf yang

bervariasi antara satu asam amino dengan asam amino yang lainnya. Nilai Rf

glisin 0,26 cm, alanin 0,25 cm, asparagin 0,35 cm dan nilai Rf sampel 0,26 cm.
 BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil pengamatan, dapat disimpulkan bahwa:

1. Nilai Rf untuk asam amino glisin adalah 0,26 cm, alanin 0,25 cm, aspargain

0,35 dan larutan sampel adalah 0,26 cm.

2. Larutan sampel diidentifkasi berdasarkan nilai Rf, dimana nilai Rf sampel

berdasarkan percobaan sama dengan nilai Rf asam amino glisin berdasarkan

teori sehingga sampel mengandung asam amino glisin.

5.2 Saran

5.2.1 Saran untuk Laboratorium

Alat yang digunakan pada percobaan ini terutama pipet tetes diperbanyak,

agar praktikum berjalan dengan lancar.

5.2.2 Saran untuk Percobaan

Sebaiknya menggunakan asam amino yang lain agar lebih banyak yang

dapat dibandingkan dan diketahui nilai Rf berdasarkan praktikum.

5.2.3 Saran untuk Asisten

Cara penjelasan prosedur serta pengarahan dalam langkah-langkah

pengerjaaan sudah baik dan mudah dimengerti.

 DAFTAR PUSTAKA

Carey, F. A., 2000, Organic Chemistry, Fourth Edition, McGraw-Hill Higher

Education, United States of America.

Day, R. A., dan Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif edisi keenam,
diterjemahkan oleh : Iis Sopyan, Erlangga, Jakarta.

Hart, H., Craine, L.E., dan Hart, D.J., 2003, Kimia Organik: Edisi Sebelas,
diterjemahkan oleh : Suminar Setiati Achmadi, Erlangga, Jakarta.

Kerksick, C. M., Rasmussen, C. J., Lancaster, S. L., Magu, B., Smith, P., Melton,
C., Greenwood, M., Almada, A. L., Earnest, C. P., Kreider, R. B., 2006,
The Effect of Protein and Amino Acid Supplementation On Performance
and Training Adaptations During Ten Weeks of Resistance Training,
Journal of Strength and Conditioning Research, 20 (3); 643–653.

Poedjiadi, A., dan Supriyanti, T., 2007, Dasar-Dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.

Sitompul, S., 2004, Analisis Asam Amino Dalam Tepung Ikan dan Bungkil
Kedelai, Buletin Tekhnik Pertanian, 9 (1); 33-37.

Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi, 2003, Analisa Bahan Makanan dan
Pertanian, Liberty, Yogyakarta.
 LEMBAR PENGESAHAN

Makassar, 08 April 2014

ASISTEN PRAKTIKAN

SARTIKA MARETRIN
 LAMPIRAN

Lampiran 1. Bagan Prosedur Kerja

1.1 Pembuatan Eluen

n-butanol, asam asetat, dan air

2,5 : 0,6 : 2,6 mL

- Disiapkan dan dikeringkan chamber.

- Dimasukkan ke dalam gelas ukur menggunakan pipet tetes.

- Dimasukkan ke dalam chamber.

- Chamber ditutup dan didiamkan hingga chamber jenuh

terhadap eluen.

Hasil

1.2 Penotolan Sampel

Glisin, alanin, asparagin dan

larutan sampel

- Plat KLT dikeringkan sebelum digunakan.

- Plat KLT dibuat dengan ukuran yang telah ditentukan dan

1 cm dari tepi atas dan tepi bawah.

- Ditotolkan pada plat dengan menggunakan pipa kapiler.

- Dikeringkan pada suhu kamar.

Hasil
1.3 Proses Elusi

Plat KLT

- Dimasukkan ke dalam chamber untuk dilakukan proses

elusi.

- Dihentikan proses elusi setelah eluen telah mencapai tanda

batas yang ditentukan.

- Dikeluarkan dari chamber dan dikeringkan dalam suhu

kamar.

- Disemprot dengan larutan ninhidrin 2 %.

- Dikeringkan di dalam incubator.

- Noda yang terbentuk pada plat KLT diberi garis lingkaran

dengan menggunakan pensil.

- Diukur jarak eluen dan jarak totolan ke noda.

- Dihitung nilai Rf.

Hasil
Lampiran 2. Perhitungan nilai Rf

Rf glisin = Jarak noda = 1,35 = 0,26

Jarak tempuh eluen 5,1

Rf alanin = Jarak noda = 1,3 = 0,25

Jarak tempuh eluen 5,1

Rf asparagin = Jarak noda = 1,8 = 0,35

Jarak tempuh eluen 5,1

Rf sampel = Jarak noda = 1,35 = 0,26

Jarak tempuh eluen 5,1
Lampiran 3. Nilai Rf secara teori

Tabel nilai Rf 20 asam amino

No Asam Amino Nilai Rf

1 Histidin 0,11
2 Glutamin 0,13
3 Lisin 0,14
4 Arginin 0,20
5 Asam aspartat 0,24
6 Glisin 0,26
7 Serin 0,27
8 Asam glutamate 0,30
9 Treonin 0,35
10 Alanin 0,38
11 Sistein 0,40
12 Prolin 0,43
13 Tirosin 0,45
14 Asparagin 0,50
15 Metionin 0,55
16 Valin 0,61
17 Triptofan 0,66
18 Fenilalanin 0,68
19 Isoleusin 0,72
20 Leusin 0,73
Lampiran 4. Gambar Hasil Pengamatan

Gambar 4.1. Plat KLT dalam chamber pada proses elusi

Gambar 4.2 Plat KLT setelah proses elusi