ABSTRAK:

Jumlah antibodi monoklonal terapeutik telah meningkat pesat dalam

beberapa tahun terakhir dan terus berlanjut. Saat ini ada lebih dari 23 antibodi
yang disetujui di pasar AS dan diperkirakan 200 atau lebih sedang dalam
pengembangan. Meskipun antibodi memiliki kesamaan struktural tertentu,
pengembangan obat antibodi yang dapat diperdagangkan secara komersial belum
berlangsung karena kebiasaan mereka yang tidak dapat diprediksi dari perilaku
buruk. Artikel ini mengulas struktur dan fungsi antibodi dan mekanisme
ketidakstabilan fisik dan kimia. Berbagai aspek pengembangan formulasi telah
diperiksa untuk mengidentifikasi atribut kritis untuk stabilisasi antibodi. 2006
Wiley-Liss, Inc. dan Asosiasi Apoteker Amerika J Pharm Sci 96: 1-26, 2007 Kata
kunci: bioteknologi; stabilisasi; Formulasi protein; Agregasi protein;
Pengeringan / liofilisasi beku.

Introduction :
Terapi protein memasuki era baru dengan banyaknya obat antibodi yang
penting. Umumnya, protein obat efektif pada konsentrasi rendah dengan efek
samping yang kurang dibandingkan dengan obat molekul kecil, walaupun jarang
terjadi pembentukan antibodi yang disebabkan protein bisa menjadi serius. Oleh
karena itu, kategori terapi ini didapatkan ‘momentum’ yang luar biasa dan
pengakuan yang meluas di perusahaan obat kecil dan besar. Oleh karena itu,
kategori terapi ini momentum yang luar biasa dan pengakuan yang meluas di
perusahaan obat kecil dan besar. Di antara terapi obat protein, antibodi berperan
besar dalam mengendalikan berbagai jenis penyakit seperti kanker, penyakit
menular, alergi, penyakit autoimun, dan peradangan. Sejak persetujuan produk
antibodi monoklonal pertama (MAb) -OKT-3 pada tahun 1986, lebih dari 23
produk obat MAb telah memasuki pasar (Tabel 1). Perkiraan jumlah antibodi dan
turunan antibodi merupakan 20% produk biofarmasi yang saat ini mulai
bermunculan (sekitar 200). Pasar global antibodi terapeutik diprediksi mencapai $
16,7 miliar di tahun 2008. Ada beberapa alasan meningkatnya popularitas antibodi
untuk pengembangan ‘komersial’. Pertama, tindakan mereka spesifik umumnya
menyebabkan lebih sedikit efek samping. Kedua, antibodi dapat dikonjugasikan
ke entitas terapeutik lainnya untuk pengiriman yang efisien dari entitas ini ke
lokasi target, sehingga mengurangi efek samping potensial. Sebagai contoh,
Mylotarg adalah agen kemoterapi yang disetujui terdiri dari calicheamicin
terkonjugasi dengan IgG4 manusia yang mengikat secara khusus CD33 untuk
pengobatan leukemia myeloid akut positif CD33. Contoh lain adalah konjugasi
imunotoxic barnase dengan rantai cahaya antibodi monoklonal manusia anti
feritin F11 sebagai agen penargetan potensial untuk imunoterapi kanker. Ketiga,
antibodi dapat dikonjugasikan ke radioisotop untuk tujuan diagnostik tertentu.
Contohnya termasuk Scan CEA untuk mendeteksi kanker kolorektal dan
ProstaScint untuk mendeteksi kanker prostat. Terakhir, kemajuan teknologi telah
menyebabkan manusia yang kurang imunogenik. Namun, pengembangan obat-
obatan antibodi yang diperdagangkan secara bebas tidak akan terus berlangsung.
Hal ini karena jalan antibodi nampak bervariasi walaupun memiliki struktur yang
serupa. Dalam upaya mengatasi beberapa tantangan dalam mengembangkan terapi
antibodi, Harris et al.5 meninjau rumusan skala dan karakterisasi antibodi
rekombinan terapeutik. Dalam tinjauan yang berbeda, produksi antibodi dan
pengrusakan telah dibahas. Namun, ketidakstabilan dan stabilisasi kandidat obat
antibodi secara keseluruhan belum diperiksa secara seksama dalam literatur.
Artikel ini tidak dimaksudkan untuk menjadi lengkap hanya bermaksud untuk
meninjau struktur dan fungsi antibodi, mendiskusikan ketidakstabilannya, dan
merangkum metode untuk menstabilkan / merumuskan antibodi.

Antibody stucture :
Antibodi (imunoglobulin) kira-kira berbentuk molekul Y atau kombinasi
molekul tersebut (Gambar 1). Struktur mereka terbagi menjadi dua wilayah -
wilayah variabel (V) (bagian atas dari Y) yang mendefinisikan sifat pengikatan
antigen dan daerah konstan (C) (batang Y) yang berinteraksi dengan sel efektor
dan molekul -. Imunoglobulin dapat dibagi menjadi lima kelas yang berbeda: IgA,
IgD, IgE, IgM, dan IgG berdasarkan daerah C mereka, masing-masing ditunjuk
sebagai a, d, e, m, dan g (lima kelas berat utama). Sebagian besar IgG adalah
monomer, tapi IgA dan IgM masing-masing dimmer dan pentamers yang
dihubungkan oleh rantai J. IgGs yang paling banyak digunakan untuk tujuan
terapeutik, dan strukturnya akan dibahas sebagai contoh antibodi secara rinci.
Struktur Dasar
Struktur IgG telah ditinjau secara menyeluruh. Gambaran struktur utama antibodi
meliputi rantai berat dan ringan, glikosilasi, ikatan disulfida, dan heterogenitas.
Rantai Berat dan Ringan
IgG mengandung dua rantai berat yang identik (H, 50 kDa) dan dua rantai
ringan identik (L, 25 kDa) (Gambar 1). Oleh karena itu, berat molekul total kira-
kira 150 kDa. Ada beberapa ikatan disulfida yang menghubungkan dua rantai
berat, menghubungkan rantai berat dan ringan, dan berada di dalam rantai (lihat
juga bagian selanjutnya). IgG dibagi lagi menjadi beberapa kelas tambahan seperti
IgG1, IgG2, IgG3, dan IgG4 (dengan kelimpahan relatif pada plasma manusia),
dengan rantai berat yang berbeda masing-masing diberi nama g1, g2, g3, dan g4.
Perbedaan struktural di antara subtipe ini adalah jumlah dan lokasi ikatan
disulfida yang saling terkait dan panjang wilayah engsel. Rantai ringan terdiri dari
dua jenis yaitu lambda (l) dan kappa (k). Pada tikus rata-rata ‘rasio total’ adalah
20: 1, sedangkan pada manusia 2: 1 . Daerah variabel (V) dari kedua rantai
mencakup sekitar 110 asam amino pertama yang membentuk daerah pengikatan
antigen (Fab), sedangkan Urutan yang tersisa adalah daerah konstan (C)
membentuk daerah Fc (fragmen yang dapat dikristalisasi) untuk pengenalan dan
pengikatan efektor. Urutan N-terminal dari kedua rantai berat dan ringan sangat
bervariasi antara berbagai antibodi. Disarankan agar urutan yang 'dilestarikan'
pada antibodi IgG1 manusia kira-kira 95% dan 5% sisanya bervariasi membentuk
pengikat antigen spesifik.
Daerah V dibagi lagi menjadi tiga urutan 'hypervariable' (HV1, HV2, dan
HV3) pada kedua rantai H dan L. Dalam rantai ringan ‘kira-kira’ dari residu 28
sampai 35, dari 49 sampai 59, dan dari 92 sampai 103 berturut-turut. Daerah lain
memiliki kerangka area kerja (FR1, FR2, FR3, dan FR4). Daerah HV disebut
saling melengkapi daerah (CDR1, CDR2, dan CDR3). Sementara kerangka area
kerja membentuk lembaran b, rangkaian HV membentuk tiga loop di tepi luar b
barel (lihat juga Bagian 2.2).
Ikatan disulfida
Sebagian besar IgG memiliki empat ikatan disulfida yang saling terkait
(dua menghubungkan dua rantai H di daerah engsel dan dua lainnya
menghubungkan dua rantai L ke rantai H). Pengecualian dua ikatan disulfida yang
ditemukan pada IgG1 dan IgG4 untuk menghubungkan dua rantai berat di daerah
engsel namun empat berada di IgG2. Pada IgG1 MAb, HC dihubungkan dengan
LC antara Cys ke 5 (C217) dari HC dan C213 pada LC. Pada IgG2 dan IgG4
MAbs adalah Cys ketiga HC (C123) yang terhubung ke LC. Sebuah ikatan
disulfida antara HC C128 dan LC C214 ditemukan untuk antibodi monoklonal
katalitik tikus (IgG2a).
IgG memiliki empat ikatan rantai disulfida yang berada di setiap domain
rantai H dan L untuk menstabilkan domain ini. Ikatan rantai disulfida pada VH
dan VL diperlukan dalam pengikatan antigen fungsional. IgG MAbs asli tidak
boleh memiliki kelompok sulfhidril bebas. Namun uji mendetail dari kelompok
sulfhidril bebas dalam MAbs rekombinan (1 IgG1, 2 IgG2, dan 1 IgG4)
menunjukkan adanya sebagian kecil kelompok sulfhidril bebas (sekitar 0,02
mol/mol IgG2 atau IgG4 MAb dan 0,03 untuk IgG1). Kasus yang jarang terjadi
adalah ditemukan sistein bebas. Ikatan cys nondisulfida pada residu 105
ditemukan pada rantai berat Antibodi monoklonal tikus OKT3 (IgG2a).
Oligosakarida
Ada satu rantai oligosakarida dalam IgGs. Rantai gula 'biantennari N-
linked' ini sebagian besar terletak pada Asn 297 yang terpendam di antara domain
CH2. Oligosakarida seringkali disebut mikroheterogen biasanya difosilasi secara
khas dalam antibodi yang diproduksi di CHO atau garis sel myeloma dan
mungkin berbeda pada sel lainnya. IgG manusia yang dihasilkan oleh
heterohybridoma manusia-manusia-tikus mengandung oligosakarida tambahan
pada Asn 75 di daerah variabel rantai beratnya. Selain itu, rantai O pada
karbohidrat juga bisa ada pada antibodi ini.
Glikosilasi yang tepat sangat penting untuk memfungsikan antibodi yang
benar. Hal ini menunjukkan bahwa pengangkatan oligosakarida pada IgGs (IgG1
dan IgG3) membuat mereka tidak efektif dalam mengikat C1q, mengikat FcgRI
manusia dan mengaktifkan C; Dan umumnya lebih sensitif terhadap banyak
protease dibandingkan IgGs 'tipe liarnya' (satu pengecualian). Ini karena situs
pengikat pada IgG untuk C1q, komponen pertamanya dari 'kaskade komplemen'
ditempatkan domain CH2. Selanjutnya, Glikosilasi dapat mempengaruhi
konformasi antibodi. Komposisi gula oligosakarida juga penting dalam fungsi
antibodi
Heterogenitas
Antibodi yang dimurnikan bersifat heterogen dalam struktur. Hal ini
berlaku untuk semua antibodi monoklonal MAbs karena perbedaan pola
glikosilasi, ketidakstabilan selama produksi, dan pemrosesan akhir. Antibodi
monoklonal dewasa OKT3 (IgG2a) mengandung 'N-terminus siklik' (asam
pyroglutamic, 17 D) pada rantai H dan L, yang diproses dengan C-terminus (tidak
ada Lys, 128 D) dari rantai H dan sejumlah kecil bentuk 'deamidated'.
Sebagai contoh, antibodi monoklonal anti-IgE murni mengandung
sejumlah kecil rantai H varian, yang memiliki 16 residu asam amino lebih sedikit
daripada rantai H normal (berada di antara Arg108 rantai L dan Ala124 dari rantai
H).
Struktur Sekunder
Struktur sekunder antibodi terbentuk sebagai rantai polipeptida berbentuk
anti paralel lembar b. Rantai ringan terdiri dari dua dan Rantai berat berisi empat
domain yang masing-masing mengandun sekitar 110 asam amino lama. Bentuk
IgG yang kurang bulat dijaga baik oleh ikatan disulfida dan oleh interaksi
nonkovalen yang kuat antara dua rantai berat dan di antara masing-masing
pasangan rantai berat / rantai ringan. Melalui interaksi nonkovalen, domain yang
kurang stabil menjadi lebih stabil, dan dengan demikian, seluruh molekul dapat
distabilkan. Ada sedikit perbedaan dalam pertukaran komposisi dan bentuk antara
dua jenis rantai ringan. Namun, tidak ada perbedaan fungsional yang ditemukan
pada antibodi yang memiliki rantai l atau k.
Fungsi Dasar Antibodi
Ada dua area fungsional di daerah IgGs-V dan daerah C. Daerah V terdiri
dari dua rantai berat dan rantai ringan yang menawarkan dua tempat pengikat
antigen identik. Pengikatan kedua lokasi (bivalen) dapat saling bergantung satu
sama lain dan tampaknya tidak bergantung pada daerah C. Daerah C dari antibodi
memiliki tiga fungsi efektor utama yaitu (1) yang dikenali oleh reseptor pada sel
efektor imun, memulai sitotoksisitas sel antibodi yang 'dependen' (ADCC), (2)
mengikat komplemen, membantu merekrut fagosit yang teraktivasi, dan (3)
diangkut ke berbagai tempat seperti air mata dan susu. Selain itu, domain C juga
memodulasi stabilitas in vivo. Fungsi Fc dipengaruhi oleh struktur Fab. Variabel
pertukaran domain (pertukaran VH dan VL;IgG dalam IoIgG keluar)
mempengaruhi fungsi terkait Fc seperti waktu paruh serum dan mengikat protein
G dan FcγRI.
Bentuk Alternatif Antibodi
Bentuk lain dari antibodi juga telah dihasilkan dan berbagai bentuk ini
telah ditinjau. Pengobatan dengan papain akan memotong sisi N terminal dari
ikatan disulfida dan menghasilkan dua fragmen Fab yang identik dan satu
fragmen Fc. Fab adalah heterodimer 50 kDa (VH + CH1) / (VL + CL) yang
dihubungkan oleh satu ikatan disulfida. Pengobatan dengan memotong sisi C-
terminal pepsin dari ikatan disulfida dan menghasilkan pecahan F(ab)2.
Pengurangan F(ab')2 akan menghasilkan dua Fab'. Fragmen Fv adalah
heterodimer nonkovalen VH dan VL. Stabilisasi fragmen oleh rantai peptida
fleksibel hidrofilik menghasilkan rantai tunggal Fv (scFvs). Fragmen tanpa
domain konstan juga dapat dibuat menjadi antibodi domain (dAbs). Fragmen
antibodi terkecil adalah unit pengenalan minimal (MRU) yang dapat diturunkan
dari urutan peptida CDR tunggal.

Summary :
Antibodi memiliki struktur tersier yang serupa. Adanya sejumlah besar
ikatan disulfida dan interaksi domain-domain inti dalam antibodi membuat
mereka relatif stabil dan lebih tahan terhadap tekanan panas sedang dibandingkan
dengan protein lainnya. Meski begitu, antibodi mengalami berbagai
ketidakstabilan yang mirip dengan kebanyakan protein. Ketidakstabilan fisik dan
kimia ini meliputi denaturasi, agregasi, adsorpsi permukaan, deamidasi, oksidasi,
isomerisasi, fragmentasi, dan lain-lain. Karena perbedaan yang signifikan dalam
urutan primer di antara berbagai antibodi, kekerasan relatif dari jalur degradasi ini
dapat sangat berbeda. Rata-rata, agregasi, deamidasi, dan isomerisasi nampak
lebih umum terjadi pada antibodi.
Sebagian perbedaan kestabilan beberapa produk antibodi dibuat menjadi
bentuk cair sementara yang lainnya diberi liofilisasi (Tabel 1). pH larutan dari
produk ini bersifat netral atau asam lemah yang menunjukkan bahwa kisaran pH
tersebut mungkin optimal untuk kebanyakan antibodi. Surfaktan telah digunakan
pada sebagian besar produk antibodi ini, mungkin untuk menghambat agregasi
antibodi, dan kemungkinan akan digunakan pada kandidat obat antibodi lainnya.
Dua eksipien formulasi yang paling umum digunakan dalam formulasi antibodi
ini adalah sukrosa dan NaCl. Untuk formulasi cairan, salah satu dapat digunakan
jika ‘mereka menawarkan’ tingkat perlindungan stabilitas yang sama. Untuk
formulasi lyophilized sukrosa lebih disukai karena NaCl tidak membentuk ikatan
inti H dengan antibodi dan juga mengurangi suhu transisi gelas dari formulasi
sehingga liofilisasi kurang efisien. Semua formulasi eksipien dan bahan
penyangga yang digunakan dalam produk antibodi komersial atau yang dibahas
dalam artikel harus dievaluasi secara terpisah untuk setiap calon obat antibodi
melalui studi stabilitas sebelum dipilih menjadi bagian dari produk, 'karena'
antibodi berbeda secara struktural. Data stabilitas yang tersedia dalam literatur dan
informasi mengenai produk antibodi komersial menunjukkan bahwa formulasi
antibodi tampak menantang namun relatif mudah ditangani dibandingkan dengan
obat protein lainnya. Tiga masalah utama dalam formulasi antibodi yang tampak
menantang dan sangat penting untuk dilakukan pada tahun-tahun mendatang: (1)
pengembangan formulasi konsentrasi tinggi yang stabil, (2) pengelolaan
viskositas terkait konsentrasi tinggi dari formulasi ini, dan (3) melemahkan
tanggapan kekebalan antibodi yang diinduksi.