UNIVERSIDAD REGIONAL AMAZÓNICA IKIAM

CARRERA: BIOTECNOLOGÍA
CÁTEDRA DE GENÉTICA
LABORATORIO DE GENÉTICA

Dra. Caroline Bacquet (Docente-Investigadora)

PRÁCTICA N° 1

OBTENCIÓN DE CROMOSOMAS
METAFÁSICOS Y OBSERVACIÓN AL
MICROSCOPIO

Victoria Cárdenas

Tatiana Guaraca

Pablo Guerra

Daniel Quiroz

Michael Zuárez

Jueves 29 de junio de 2017

Tena- Ecuador
ÍNDICE

OBJETIVOS ................................................................................................................................. 2

 Objetivo General: .............................................................................................................. 2

 Objetivos Específicos: ....................................................................................................... 2

MATERIALES Y MÉTODOS ..................................................................................................... 3

RESULTADOS ............................................................................................................................. 5

DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 6

CONCLUSIONES ........................................................................................................................ 8

REFERENCIAS ............................................................................................................................ 9
INTRODUCCIÓN

La citogenética a lo largo de los años ha permitido estudiar diversos factores genéticos

que han conllevado al desarrollo de mal formaciones o enfermedades. De acuerdo a

Mikhail et al., (2016), la citogenética puede facilitar el estudio de las anormalidades

cromosómicas, proporcionando información precisa e importante sobre diagnósticos,

pronósticos e implicaciones terapéuticas. Además, según Howe et al. (2014), la

citogenética se centra en el estudio de la estructura, función y comportamiento de los

cromosomas cuando se encuentran en metafase, ya que durante esta fase estarán más

condesados y por consiguiente más visibles al lente microscópico. La mayoría de estudios

de citogenética (O’Dwyer et al., 2013; Mikhail et al., 2016), se han centrado en el análisis

de cromosomas extraídos de diferentes tejidos celulares, tal como linfocitos, fibroblastos

de la piel, amnióticos, placenta, medula ósea y diferentes clases de tumores.

La medula ósea, ha sido uno de los focos importantes dentro del campo de la citogenética,

permitiendo analizar anomalías cromosómicas que, en la mayoría de las personas, han

producido trastornos hematológicos como leucemia aguda, trastornos

mieloproliferativos, linfoma entre otros (Howe et al. 2014; Mikhail et al., 2016).

Por otra parte, los análisis de las anormalidades cromosómicas han sido llevados a cabo

mediante diferentes procedimientos y técnicas citogenéticas, tal como tinción de Giemsan

o mejor conocida como G-banding, la cual dependiendo de los análisis a realizar ha sido

combinada con Fluorescencia en hibridación en situ (FISH) y Microarray cromosómico

(CMA) (Henegariu et al., 2001; Deng et al., 2003; Kario, 2013; Howe et al., 2014;

Mikhail et al., 2016).

La tinción de Giemsa consiste en usar una solución tamponada de tiazina y eosina,

diseñada para teñir películas de sangre o médula ósea (Sigma-Aldrich, 2014). La técnica

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requiere del envejecimiento cromosómico que elimine los restos citoplasmáticos y

permita el paso del tinte al ADN (Bayani & Squire, 2004). Además, es necesario un

pretratamiento, generalmente mediante digestión de cromosomas con una proteasa (e.g.

tripsina) o por incubación de cromosomas en citrato salino caliente (Estandarte, 2012).

G-banding es el método más utilizado en análisis citogenéticos, ya que permite teñir los

cromosomas y visualizar el patrón de bandas mediante el microscopio de luz estándar

(Bayani & Squire, 2004). La tinción de los cromosomas involucra la formación de un

precipitado tiazina-eosina, causando que los cromosomas se tornen púrpura. Las bandas

oscuras corresponden a regiones hidrofóbicas del cromosoma, las cuales favorecen la

precipitación tiazina-eosina. Estas regiones se identifican como heterocromatina de

replicación tardía y se caracterizan por ser ricas en enlaces disulfuro y tener una estructura

condensada. En contraste, las bandas claras son regiones menos hidrofóbicas, que no

favorecen la precipitación tiazina-eosina. Éstas se identifican como eucromatina de

replicación temprana y presentan una estructura suelta (Estandarte, 2012).

OBJETIVOS

 Objetivo General:

Conocer las prácticas citogenéticas de preparación de muestras para el aislamiento y

observación de cromosomas metafásicos, así como el protocolo de laboratorio a seguir y

las diferentes variantes del mismo.

 Objetivos Específicos:

o Comprender el protocolo básico de preparación de muestras citogenéticas.

o Llevar a cabo la extracción, y separación de cromosomas metafásicos

provenientes de médula de ratón.

o Ubicar e identificar los diferentes cromosomas presentes en los ratones.

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 o Proponer mejoras al método usado en el laboratorio con el fin de obtener

resultados más precisos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Materiales

Materiales Equipos

Caja Petri Centrifugadora

Pinzas Microscopio óptico

Tubos de ensayo Fuente de vapor (Baño de Agua María)

Tubos Eppendorf

Portaobjetos

Placa de metal

Jeringa

Tijeras

Pipeta Pasteur

Reactivos Material biológico

Suero fisiologico Dos huesos de ratón

Giemsa

Etanol

Metanol

Ácido Acético

La metodología empleada para la siguiente practica fue adaptada de la metodología

descrita por Henegariu et al., (2000).

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Extracción de la medula ósea

Para la extracción de la medula ósea, se utilizó como material de partida huesos de pierna

de ratón. Entonces, los dos huesos proporcionados fueron puestos en una caja Petri con

un volumen determinado de suero fisiológico. Posteriormente, se cortó los dos extremos

de cada hueso, dejando abierta la cavidad para la posterior extracción de la medula.

Seguidamente, insertando la punta de la ajuga de la jeringa en un extremo del hueso;

misma que fue llenada con suero fisiológico, se removió la medula, la cual fue recolectada

en un tubo de ensayo.

Preparación del cultivo celular y fijación

La muestra obtenida, se resuspendió varias veces hasta obtener una solución homogénea.

Seguidamente, con una solución amortiguadora hipotónica de KCl a 0.075 M, se incubo

la muestra por 15 min a 37º. Después del tratamiento hipotónico, el cultivo celular se

sedimento por centrifugación durante 5 min a 800 rpm y el sobrenadante se eliminó. A

continuación, la muestra sedimentada se resuspendió en una solución fijadora de 1-1.5 ml

de (3:1 metanol a una concentración de ácido acético). Después, el proceso de

centrifugación y resuspensión se repitió por 3 veces.

Las muestras obtenidas se pusieron en un tubo eppendor y almacenadas en una incubadora

hasta usos posteriores.

Difusión de cromosomas y bandas-G.

Con la finalidad de obtener una cantidad suficiente de cromosomas en metafase, el cultivo

celular se diluyo por varias veces hasta obtener una solución homogénea de color gris.

Utilizando una pipeta pasteur, una suspensión de cultivo celular se distribuyó sobre un

portaobjetos y posteriormente para que la muestra se fije al portaobjetos, sobre una placa

metálica a una temperatura adecuada se la puso a secar. Secado la muestra, se procedió a

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colocar una gota de Giemsa dejando actuar durante 10 min. El reactivo fue removido y

lavado con etanol, seguidamente sobre la placa metálica con un gradiente de temperatura

optimo se secó la muestra, para finalmente mediante el microscopio observar los

cromosomas en metafase.

RESULTADOS

Mediante el uso de microscopía a diferentes aumentos, se pudo encontrar varios arreglos

cromosómicos (Figura 1). En este trabajo se pudo encontrar varios cromosomas

somáticos, sin embargo, en la siguiente imagen (Figura 2) no fue posible la correcta

diferenciación de más de un cromosoma somático.

Figura 1: Cromosomas de células somáticas provenientes de ratón, a

un objetivo de 75x. Imagen obtenida del grupo de Martín Hinojosa,
estudiante de Ikiam.

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 Figura 2: Placa citogenética donde no pudieron ser
identificados cromosomas.

DISCUSIÓN

A pesar de que el protocolo de obtención de cromosomas metafásicos era el mismo, se

observó que los resultados tanto de la placa 1 como de la 2 contaban con varias

diferencias, siendo la principal de que no se hayan podido observar cromosomas

metafásicos en una de las placas (Figura 2).

Sin embargo, esto pudo suceder debido a que no se tomaron en cuenta varias

consideraciones. Una de ellas es que se debe establecer y determinar la hora mitótica, esto

en base a la hora en la que se obtuvo las muestras, para luego establecer intervalos de

tiempo con el objetivo de obtener una mejor precisión en los resultados (Rondón, Rache

& Pacheco, 2013) Debido a que no se tuvo un mayor control sobre lo descrito

anteriormente en el laboratorio, se hipotetiza que estas diferencias pudieron surgir puesto

que el grupo de la placa 1 comenzó el proceso de obtención de cromosomas más rápido

y se tuvo que seguir casi al mismo ritmo que dicho grupo.

Otra suposición sobre la diferencia entre las placas tiene su fundamento en lo que

manifiestan Rodríguez, & Bueno (2006). “La tinción de la cromatina debe realizarse con

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la sustancia específica durante 10 minutos para colorear el ADN y también un flameo de

la muestra que permita eliminar el exceso de colorante en el citoplasma y así, aumentar

el contraste con los cromosomas, se debe saber que un calentamiento excesivo de la

muestra produce decoloración del preparado”. Con respecto a lo anterior, se conoce que

el grupo de la placa 1 contaba con un cronómetro para no dejar que la muestra se calentara

demasiado mientras que la placa 2 fue puesta sobre la cubierta del equipo de Baño María

por más de los 10 minutos establecidos, lo que pudo provocar algún daño en la muestra

con el material a visualizar en el microscopio.

De igual forma, según (Bueno, 2001) es necesaria la disgregación de la muestra para una

mejor observación en el microscopio. Esto es importante puesto que para la placa 2, la

muestra no fue disgregada de forma correcta y por lo tanto, esto pudo tener consecuencias

al momento de analizar los cromosomas metafásicos en el microscopio.

Finalmente, con el objetivo de llevar a cabo de mejor manera el proceso de citogenética,

es necesario analizar el método empleado y la optimización del mismo. Es por eso que,

además de los procedimientos descritos por Henegariu (2000), el autor presenta los pasos

para llevar a cabo la tinción por fluorescencia de hibridación in situ (FISH, por sus siglas

en inglés). Esta técnica se basa en la adición de marcadores fluorescentes a partes de los

cromosomas con un alto grado de secuencias complementarias. Esta técnica consta de

tres pasos principales: (a) envejecimiento químico, (b) desnaturalización, y (c) prueba de

etiquetado-detección.

El envejecimiento químico consta en la adición de etanol 150-200 μL a la muestra.

Posteriormente, necesario un pretratamiento con pepsina al 0.005% en 0.01 N HCl. Esta

metodología permite remover el agua y fijador, de la misma manera la desnaturalización

de proteínas presentes en la muestra. Cuando es llevado a cabo la desnaturalización por

calor de las muestras, antes de haber realizado el envejecimiento químico, entonces el

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material cromosómico se vuelve muy desordenado. El autor también propone la fijación

de la muestra con etanol a 94 °C durante 2-20 segundos presentan mejores resultados.

El principal objetivo de la desnaturalización es provocar el engrosamiento de los

cromosomas. Esto es llevado a cabo por la adición de aproximadamente tres veces más

competidores de ADN, que bloquean las secuencias repetitivas. Adicionalmente, una

concentración entre el 5 y 8% de sulfato de dextrano previendo la distorsión de los

cromosomas. Adicionalmente, la forma de los cromosomas es dependiente de la calidad

de la formamida utilizada, siendo para el autor la mejor formamida utilizada la

proveniente de Fluka (Milwaukee, WI). En este punto, también ha sido vista la mejora de

resultados en términos de la conservación de la arquitectura cromosómica, el gradual

calentamiento y enfriamiento de la muestra.

Por último, la tinción DAPI (4',6-diamidinofenyl-indol) consta de la adición de un

marcador fluorescente. Este marcador tiene afinidad por las secuencias ricas en adenina

y timina. Esta tinción, acompañada la microscopía de fluorescencia facilita la ubicación

de cromosomas en la muestra. Una mejora para la tinción de bandas por DAPI es incubar

la placa por pocos segundos en 1% de formaldehido, inmediatamente después del

pretratamiento con pepsina.

CONCLUSIONES

La preparación de muestras citogenéticas que permiten observar cromosomas metafásicos

pueden realizarse utilizando una metodología estándar que consta de algunos parámetros

variables como el tiempo de calentamiento, el origen de la muestra a examinar etc. Sin

embargo, gran parte de las observaciones realizadas utilizando el protocolo básico no

obtuvieron los resultados deseados, por lo que se plantea ciertas variaciones a la

metodología para incrementar el número de observaciones favorables. Una de estas

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variaciones es el uso de colchicina como agente antimitótico e inhibidor de división

celular en metafase con el fin de incrementar la cantidad de cromosomas obtenidos en la

práctica. Este proceso se encuentra explicado en Henegariu (2000) sin embargo no fue

realizado en esta práctica. Finalmente, a pesar de que el método no haya generado una

gran formación de cromosomas, se pudieron hacer observaciones, lo que determinaría

que el método funciona a pesar de ser bastante perfectible.

REFERENCIAS

Bayani, J., & Squire, J. A. (2004). Traditional banding of chromosomes for cytogenetic

analysis. Current protocols in cell biology, 22-3.

Bueno, M. (2001). Mitosis y meiosis en células vegetales. Guías de laboratorio de

genética II. Departamento de Biología. Universidad Nacional de Colombia.

Bogotá.

Deng, W., Tsao, S., Lucas, J., Leung, C., & Cheung, A. (2003). A New Method for

Improving Methaphase Chromosome Spreading. Cytomettry, 51, 46-51.

Estandarte, A. (2012). A Review of the Different Staining Techniques for Human

Metaphase Chromosomes. Recuperado de

http://www.ucl.ac.uk/~ucapikr/projects/Ana_staining_LitRev.pdf

Henegariu, O., Heerema , N., Wright, L., Bray-Ward, P., Ward, D., & Vance, G. (2001).

Improvements in cytogenetic slide preparation: Controlled Chromosomes

Spreading, Chemical Aging and Gradual Denaturing. Cytometry, 101-109.

Howe, B., Umrigar, A., & Tsien, F. (2014). Chromosome preparation from culture cells.

NCBI. Obtenido de https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4091199/

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Kario. (2013). Molecular diagnostic laboratory. Karyotype (G-banding). Recuperado de

http://www.karyo.gr/en/test/karyotype-g-banding

Mikhail, F., Heerema, N., Rao, K., Burnside, R., Cherri, A., & Cooley , L. (2016). Section

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neoplastic blood and bone marrow-acquire chromosomal abanormalities.

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O'Dwyer, M., Gatter, K., Loriaux, M., Druker, B., Olson, S., Magenis, R., . . . Braziel, R.

(2013). Demostration of Philadelphia chromosome negative abnormal clones in

patients with chronic myelogenous leukemia during major cytogenetic responses

induced by imatinib mesytale. Leukemia, 17, 481-487.

Rodríguez, N. C., & Bueno, M. L. (2006). Estudio de la diversidad citogenética de

Physalis peruviana L.(Solanaceae). Acta Biológica Colombiana, 11(2).

Rondón, H., Rache, L., & Pacheco, J. (2013). Karyotype of Espeletiopsis muiska. Revista

MVZ Córdoba, 18(3), 3868-3876.

Sigma-Aldrich. (2014). Giemsa stain (Procedure No. GS-10). Recuperado de

https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/General_Information/1/gs10.pdf

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