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Laboratorios de Biología Celular y Microbiología

LABORATORIO 1.
BIOMOLÉCULAS-CARBOHIDRATOS

Una célula viva está constituida básicamente por cuatro elementos (C, H, O y N) los cuales
combinados entre sí, dan origen a un gran número de compuestos. La sustancia más
abundante en la célula viva es el agua y llega a representar más del 70% de su peso. La
química de la célula está basada en los compuestos de carbono, los cuales están divididos
en cuatro grandes grupos de macromoléculas: carbohidratos, lípidos, proteínas y ácidos
nucleicos, los cuales están formados por el encadenamiento de moléculas pequeñas tales
como aminoácidos, azúcares, ácidos grasos y nucleótidos. Las macromoléculas son
distintas en sus propiedades físicas y químicas, pero los tres primeros son similares
metabólicamente, al menos, en el hecho de que son fuentes de energía para los
organismos. El rompimiento de estas moléculas orgánicas complejas da como resultado la
liberación de energía. Por ejemplo, una cadena de seis átomos de carbono puede originar
residuos de tres átomos de carbono, los cuales a su vez se pueden utilizar en la síntesis de
nuevas moléculas de seis átomos de carbono o aún en moléculas más largas. De esta
manera los componentes de las moléculas orgánicas se pueden usar en una gran variedad
de combinaciones en los organismos vivos.

Las interacciones de macromoléculas a través de diferentes tipos de fuerzas


intermoleculares y mecanismos complejos de empaquetamiento, permiten la
conformación de las diferentes organelos (membranas plasmáticas) y estructuras
supramoleculares, como los cromosomas. Finalmente la interacción conjunta de las
biomoléculas en sus diferentes niveles de organización permite la conservación de la
estructura y funcionamiento de las células.

1. Fundamentación

 Carbohidratos
Son compuestos orgánicos que contienen carbono, hidrógeno y oxígeno, y muchos
de ellos contienen elementos en la relación de Cn(H2O)n. Estos compuestos se
pueden clasificar de acuerdo al grupo funcional que posee (aldosas y cetosas), al
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número de átomos de carbono (3C: triosas, 4C: tretrosas, 5C: pentosas, 6C:
hexosas, etc), y de acuerdo al número de monosacáridos que lo conforme
(azúcares simples o monosacáridos, si se unen dos monosacáridos forman un
disacárido; si se unen de 3-20 monosacáridos resulta un oligosacárido y cuando se
unen numerosas unidades de monosacáridos, constituyen un polisacárido como
por ejemplo los almidones, celulosas, pectinas, quitinas, etc).

Monosacáridos
Es la molécula más simple de azúcar que se puede encontrar en la naturaleza. Está
conformada por una sola unidad monomérica. Se pueden clasificar de acuerdo al número
de carbonos que lo conforman. Entre sus funciones principales está servir de fuente de
energía de las células y participar en la síntesis de ácidos nucleicos.

Tabla No 1. Algunos Monosacáridos: Conformación estructural y función.

Monosacáridos Fórmula Función


Ribosa Síntesis del ARN
(Pentosa)

Desoxirribosa Sintesis del ADN


(Pentosa)

Glucosa Fuente de energía para


(Hexosa) procesos metabólicos.

Galactosa Fuente de energía para


(Hexosa) procesos metabólicos.
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Fructosa Fuente de energía para


(Hexosa) procesos metabólicos.

Disacáridos
Son azúcares que están conformados por la unión de dos unidades monosacáridos iguales
o distintos. Los disacáridos más comunes son la sacarosa, lactosa y la maltosa. En la Tabla
Nº2 se pueden observar algunos de los disacáridos más comunes y los monosacáridos que
los conforman.

Tabla No 2. Algunos Disacáridos.


Disacárido Fórmula Unidades monoméricas
Lactosa Glucosa
Galactosa

Sacarosa Glucosa
Fructosa

Maltosa 2 unidades de Glucosa

Polisacáridos
Son compuestos que tienen más de 3 monosacáridos iguales o diferentes en su unidad
estructural. Entre sus funciones principales es servir de reserva energética y ser parte
estructural.

Almidón: Polímero de la glucosa el cual es la reserva energética en vegetales.


Presenta dos formas estructurales: amilosa (forma helicoidal no ramificada, Figura
Nº1a) y amilopectina (forma helicoidal ramificada, Figura Nº1b).
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Figura Nº1. Componentes del almidón

a) Amilosa
b) Amilopectina

Glucógeno: Es la reserva energética de los animales, está formado por cadenas


ramificadas de glucosa (Figura Nº2); es insoluble en agua. Se encuentra abundante
proporción en el hígado y en los músculos.

Figura Nº2. Estructura del glucógeno

Como se mencionó anteriormente, los carbohidratos como los azúcares y los


almidones generalmente se utilizan por los organismos como fuentes de energía;
mientras que los otros como las celulosas, pectinas y quitinas tienen función
estructural en células individuales y aún en organismos complejos como hongos,
plantas, bacterias artrópodos, etc. En el hombre más del 60% de los
requerimientos totales de energía provienen de la oxidación de los carbohidratos.
En la Tabla N°3 se exponen algunas de las funciones de los carbohidratos.
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Tabla N°3. Funciones de los carbohidratos


Tipo de Función Explicación Ejemplos
BIOLÓGICA Fuente de energía para las Glucosa, fructosa
células
Intervienen en la formación de Ribosa y desoxiribosa
ácidos nucleicos
Es un componente estructural Celulosa, hemicelulosa
de algunas células y tejidos (plantas),
Reserva de fuentes de Almidón, glucógeno
carbono
Participan en procesos de Glucolípidos (membranas
inmunidad específica y celulares)
protección.
INDUSTRIAL Materias primas para la Papel (celulosa),
industria alimenticia (sacarosa,
almidón, amilopectina),
madera
(lignocelulósicos),
farmacéutica

2. Objetivos:
 General
Aplicar métodos cualitativos y cuantitativos para la identificación de carbohidratos.
Específicos
o Determinar mediante el método de Benedict la presencia de azúcares
reductores.
o Determinar mediante el método de Lugol la presencia de almidón.
o Desarrollar destrezas en la preparación de muestras y curvas de calibración
en la aplicación del método DNS para la cuantificación de azúcares
reductores.
3. Materiales y Reactivos
Materiales
 15 Tubos de ensayo sin tapa
 Estufa
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 1 Beaker de 250 ml
 Placa de calentamiento con agitación
 Gradilla
 Recipiente con hielo
 Cubeta espectrofotométrica
 Espectofotométro
 Pipetas 1,2 y 5ml.
 Pipeteador

Reactivos
 Reactivo de Benedict
 Glucosa 4g/L
 Almidón 10%
 Lugol 1%
 Reactivo DNS

Muestra problema: Los estudiantes deben traer un banano verde y un banano maduro
para analizar en el laboratorio.

4. Procedimiento
4.1. Identificación cualitativa de azúcares reductores
 Patrón teórico negativo: Tome un tubo de ensayo (Tubo 1) y agregue 2 mL de H 2O
destilada más 1 mL de reactivo de Benedict.
 Patrón teórico positivo: Tome otro tubo de ensayo (Tubo 2) y agregue 2 mL de
glucosa 0.4% (más 1 mL de reactivo de Benedict.
 Muestra: Tome un tercer tubo de ensayo (Tubo 3) y agregue 2 mL de la muestra
problema y 1 mL de reactivo de Benedict.
Caliente los tres tubos al baño maría durante 5 minutos, observe los cambios de color
y compárelos, analice lo sucedido.

4.2. Procedimiento cualitativo para la identificación de almidón.


 Patrón teórico negativo: Al Tubo 1, agregue 2 mL de H 2O destilada más 5 gotas de
reactivo de Lugol.
 Patrón teórico positivo: Al Tubo 2 y agregue 2 mL de solución de almidón al 10%
más 5 gotas del reactivo de Lugol.
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 Muestra: A un tercer tubo de ensayo (Tubo 3) y agregue 2 mL de la muestra


problema y 5 gotas del reactivo Lugol.
Observe los cambios de color y compárelos, analice lo sucedido.

4.3. Procedimiento para la cuantificación de azúcares reductores. (Método DNS )

a. Inicialmente debe prepararse el patrón de glucosa: Disolver 1 g de glucosa y aforar con


agua destilada a 250 mL, obteniéndose una solución madre a una concentración de 4
mg/L. Recordar que el rango es de 0 hasta 4 mg/L, de tal manera que el volumen final sea
2 mL. Para ello, mezcle el volumen adecuado de la solución madre de glucosa de 4 mg/L y
el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente figura:

Figura Nº3. Preparación de patrones para la curva de calibración del método DNS
2ml 2ml 2ml

2 ml de H2O

4g/l 2g/l 1g/l 0,5g/l

Procedimiento del método DNS


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Tanto para los patrones de la curva, como para la muestra problema y el blanco
(agua) se procede de la siguiente forma:
 A 0.5 mL de cada muestra a analizar adicionar 0.5 mL de reactivo DNS. Agitar todas
las muestras.
 Colocar a ebullir las muestras en baño maría por 5 minutos y enfriar rápidamente
con hielo.
 Adicionar 5 mL de H2O destilada y agitar y dejar en reposo durante 15 min.

Finalmente se lee la absorbancia a 540 nm. Realizar la curva Absorbancia versus


concentración. Debe tener un coeficiente de correlación de 0.991 a 0.999.

Cuantificación de una muestra específica:

a) Si “a priori” no se dispone de una estimación del contenido de azúcar de la muestra,


habrá de preparar distintas diluciones del extracto directo.
b) Siguiendo el esquema anterior, tomar en un tubo limpio 0.5 mL de la muestra y realizar
los mismos pasos para cada dilución del extracto hasta encontrar una dilución acorde al
rango de trabajo del método.
c) Calcular el contenido de azúcar en la muestra a partir de la ecuación de la recta patrón

Tabla Nº4. Formato de recolección de datos del método del DNS

Concentración Absorbancia
Tubo
(g/L) a 540 nm
1 0 (blanco)
2 0.25
3 0.5
4 1
5 2
6 4
7 Muestra 1
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Preguntas de consulta
1. ¿Qué es un azúcar reductor? Cite ejemplos de azucares reductores y no reductores.
2. Consulte las diferentes reacciones químicas o interacciones moleculares que ocurren
en los métodos de Benedict, Lugol y DNS, que provocan un cambio de color cuando
hay presencia de carbohidratos.

ANEXO

Curvas de calibración

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las investigaciones


químicas y bioquímicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la
radiación absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia;
midiendo de esta manera la absorbancia de la sustancia problema.
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Las medidas de absorbancia son frecuentemente usadas en química analítica, ya que es


proporcional al grosor de una muestra y la concentración de la sustancia en ésta.

La absorbancia tiene una dependencia lineal con respecto a la concentración, lo que hace
que se puedan obtener relaciones de manera experimental, utilizando muestras de
concentraciones conocidas y obteniendo con ayuda del espectrofotómetro la absorbancia.
Luego mediante un ajuste a una línea recta se puede obtener una curva de calibración

Imagen 1 - Cambio de Índice de refracción con la concentración.

Pasos para hacer una curva de calibración.

1. Preparar muestras con la sustancia problema a diferentes concentraciones, las


cuales deben ser previamente conocidas, y adicional a esta un “blanco” donde el
valor de la concentración vale cero.
2. Se debe tener también la muestra donde la concentración es desconocida (muestra
problema), la que se hallara más adelante cuando se construya la curva.
3. Luego de tener estas muestras identificadas se deben introducir dentro de las
celdas del espectrofotómetro, y solicitarle al equipo el análisis a una longitud de
onda fijada con antelación.
4. Finalizado el análisis el equipo arroja tantas absorbancia como numero de
muestras
5. Estos datos se deben tabular y luego graficar (La absorbancia de la muestra
problema no debe incluirse en la grafica). La concentración por ser la variable
independiente debe ir en las abscisas, y la absorbancia en las ordenadas. Una
buena opción es utilizar el software Microsoft Excel ®, que ofrece hacer diagramas
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de dispersión, luego el mismo software traza una línea de tendencia y arroja la


respectiva regresión lineal.
6. Al obtener la ecuación y=ax+b, donde “y” representa la absorbancia y “x” la
concentración, puede hacerse el debido despeje de concentración, teniendo la
absorbancia de la muestra problema.

BIBLIOGRAFÍA

Universidad de Cartagena. Laboratorio No. 5. Determinación cualitativa de algunos


componentes del protoplasma celular.

Corporación Universitaria Iberoamericana. Práctica N. 3 BIOMOLECULAS ORGÁNICAS.

Roca, Pilar; Oliver, Jordi; Rodríguez, Ana. BIOQUÍMICA. Técnicas y Métodos. Universidad
Islas Baleares, 2003

Karp, Gerald. Biología celular y molecular. 4ª Edición. 2006

Proyecto ARCANO; Osorio, H.J.; Cardona, C.A., Montes, L.M.; Gobernación de Caldas,
Programa de las Naciones Unidad para el Desarrollo PNUD, Universidad Nacional de
Colombia; SENA; Cartilla 16: Manual de prácticas de laboratorio en ciencias biológicas.
2007.