Centro de Ciencias Básicas.

Departamento de Química.
Academia de Química.
Lic. Químico Fármaco Biólogo.

Reporte 2
“Medición de la actividad de la ureasa.”

Materia: Bioquímica II
Profesora: María Cristina Serna Gutiérrez.
Alumnas
Flores Hernández Mayela
Flores Ibarra Joselyn Georgina.
Palos Dueñas Dulce María.
Ramos Hernández Alejandra.

Fecha: 02/Marzo/2018
RESULTADOS 2A

Matraz Vol. HCL

gastado
(ml)

1 31

2 4.4

3 4.2

Cálculos:

 Matraz 1:
VCT=31ml – 4.4 ml = 26.6 mL

 Matraz 2:
(250 µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(7.5 𝑚𝐿) 𝝁𝒎𝒐𝒍
[S]= 12.5 𝑚𝐿
= 150 𝒎𝑳

 Matraz 3:
(26.6 𝑚𝐿)(10 µ𝑚𝑜𝑙) 𝒎𝑳 𝝁𝒎𝒐𝒍
Vo= = 8.866
30 𝑚𝑖𝑛 𝒎𝒊𝒏

RESULTADOS 2B

Matraz mL de HCl gastados

1 8.2

2 9.5

3 10.3
4 11.7

5 17.3

6 22.3

7 24.5

8 27.3

9 2.4
Cálculos:

 Matraz 1:
VCT=8.2ml – 2.4 ml = 5.8 mL
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(0.0625𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 1.30µmol/mL
(5.8 𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 1.9333𝒎𝒍µmol/min

 Matraz 2:
VCT=9.5 ml – 2.4 ml = 7.1 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(0.0125𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 0.260µmol/mL
(7.1 𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= =2.3666 m𝒍µmol/min
30𝑚𝑖𝑛

 Matraz 3:
VCT=10.3 ml – 2.4 ml = 7.9 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(.0250𝑚𝐿)
[S]= = 0.520µmol/mL
12𝑚𝐿

(7.9 𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= = 2.63333 m𝒍µmol/min
30𝑚𝑖𝑛

 Matraz 4:
VCT= 11.7 ml – 2.4 ml = 9.3 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(.5𝑚𝐿)
[S]= = 150µmol/mL
12𝑚𝐿

(9.3𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 3.1 m𝒍µmol/min

 Matraz 5:
VCT=17.3 ml – 2.4 ml = 14.9 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(1𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 20.83µmol/mL
(14.9𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 4.96 m𝒍µmol/min

 Matraz 6:
VCT=22.3ml – 2.4 ml = 19.9 mL
 (250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(2𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 41.66µmol/mL
(19.9𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 6.633 m𝒍µmol/min

 Matraz 7:
VCT=24.5ml – 2.4 ml = 22.1 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(4𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 83.33 µmol/mL
(22.1𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 7.3666 m𝒍µmol/min

 Matraz 8:
VCT=25.2ml – 2.4 ml = 22.8 ml
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(8𝑚𝐿)
[S]= 12𝑚𝐿
= 166 µmol/mL
(22.8𝑚𝐿)(10µ𝑚𝑜𝑙)
Vo= 30𝑚𝑖𝑛
= 7.6 µmol/min

 Matraz 9:
(250µ𝑚𝑜𝑙/𝑚𝐿)(8𝑚𝐿)
[S]= = 166.66µmol/mL
12𝑚𝐿

Matraz VCT [S] Vo

1 5.8 1.30 1.933

2 7.1 0.260 2.366

3 7.9 0.520 2.633

4 9.3 150 3.1

5 14.9 20.83 4.96

6 19.9 41.66 6.633

7 22.1 83.33 7.366

8 22.8 166 7.6

 9
8 y = 0.9349x + 0.367
7
6
5
Vo

4
3
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Matraz

DISCUSIONES

FLORES HERNÁNDEZ MAYELA

FLORES IBARRA JOSELYN GEORGINA

La ureasa es una exoenzima que cataliza la reacción de hidrólisis de la urea, el principal
producto celular nitrogenado de la degradación de las proteínas y los ácidos nucleicos, el
cual es más fácil de eliminar que otras formas de nitrógeno (como el amoniaco) porque es
soluble en agua y menos tóxico. En dicha reacción, la urea se rompe para formar dióxido
de carbono y amonio, como se describe en la siguiente reacción (Lorenc, 2010)

CO(NH2)2 + H2O  2NH3 + CO2

La ureasa también es considerada una Amido hidrolasa que actúa sobre los enlaces no
peptídicos de amidas lineales tales como la Urea y sus derivados. Las técnicas para
obtener una determinación cuantitativa de ureasa en muestras se basan en que la tasa
inicial de la reacción catalítica es proporcional al número de moles presentes, el cual se
podría calcular a partir del número de moles de sustrato que reaccionan por minuto y mol
de enzima bajo condiciones estándares. (Casanova & Benavides, 1995). En nuestro caso
se utilizó una titulación con ácido clorhídrico.
La velocidad de reacción por enzimas proporciona información directa del mecanismo de
reacción catalítica y la especificad de la enzima. La velocidad de reacción catalizada por
una enzima se debe tener en cuenta las condiciones que esta se debe mantener, puesto si
no se logra obtener las situaciones ideales está no sufrirá ningún cambio. En todas
reacciones enzimáticas, si se incrementa la concentración de enzima, se forma mayor
cantidad de productos por unidad de tiempo. EL incremento en la velocidad de reacción es
directamente proporcional al incremento en la concentración de enzima, siempre y cuando
la cantidad de sustrato no sea limitante, es decir, que el sustrato no llegue a agotarse.
Como se puede apreciar en la tabla de resultados de la segunda práctica, los valores de la
concentración y de la velocidad de reacción, van aumentando gradualmente conforme
mayor era el volumen de HCl gastado en la práctica. El tubo número 9 que era el blanco,
se usó como inhibidor el cloruro de mercurio para usarlo como referencia para realizar los
cálculos de los demás tubos y así obtener un crecimiento exponencial de la concentración
del sustrato en estos.
PALOS DUEÑAS DULCE MARÍA
En esta investigación, la enzima ureasa de la soya descompone la urea en amoníaco y el
dióxido de carbono. La disolución de amoníaco (NH3) tiene un pH alto que puede ser
detectado mediante un simple indicador de pH, como el que se obtiene de lombarda. El
amoníaco producido por la reacción también puede ser detectado por el olor (Vasey, 2003).
Con esos factores cualitativos podemos determinar si la enzima ureasa reaccionó con el
sustrato urea, sin embargo, ese no es el objetivo de la práctica, por experiencia y obviedad
es seguro de que reacciona, lo que se quiere ver es la cinética de la reacción.
La reacción de descomposición enzimática mediante ureasas puede servir como ejemplo
para una reacción de orden cero. Este orden de reacción es mostrado en el aumento lineal
de la concentración del producto. En ella se puede observar la cinética de la catálisis: En
primer lugar, el sustrato y la enzima se encuentran en equilibrio con un complejo de enzima-
sustrato. Este equilibrio ya puede ser comparado con la acumulación de un sustrato
determinado por la difusión, en una superficie catalíticamente activa. En un segundo paso,
el complejo enzima-sustrato es transformado rápidamente en los productos. (Teijón Rivera,
et al., 2009) Una vez dicho esto, y, de acurdo a la gráfica 2 de los resultados obtenidos
podemos decir que en los primeros 3 tubos no ocurren cambios, ya que el sustrato y la
enzima se encuentran en equilibrio, o sea que la cantidad de sustrato está acumulado, y no
hay suficientes enzimas para que se lleve a cabo la reacción, mientras que en el tubo 4 al
8 se observa que la enzima y el sustrato reaccionan rápidamente, aquí si existen
condiciones para la activación de la ureasa, y se ve reflejada en la ascendencia de la
gráfica, se observa que conforme aumenta la cantidad de sustrato, aumenta la velocidad
de reacción, siendo esto lógico y correcto con la bibliografía, sin embargo, el tubo 1 presenta
mayor concentración que el tubo 2 y3, pero sigue siendo parte de la primera etapa, esto
puede suceder por varios factores, los cuales se piensa que los principales factores que
pudieron ocurrir para obtener ese valor son el realizar los cálculos de manera incorrecta,
las cantidades de reactivas no fueron bien medidas como debió ser alterando así los
resultados, alguna contaminación en la mezcla que permite la activación en el tubo 1 o la
inactivación de los otros dos tubos, malas condiciones de pH, temperaturas, entre otros
factores. Para su activación, la ureasa necesita unir dos iones de níquel por subunidad.(
Teijón Rivera, et al., 2009) Los granos de soja contienen una ureasa termolábil, cuyo grado
de inactivación es fácil de medir (pH).( Vasey, 2003)
En la formación de los productos de la reacción se traduce en la constancia de la velocidad
de reacción y por ello, la curva de la concentración de urea tiene un curso lineal. De esta
manera la descomposición de la urea mediante ureasas sigue la ley de velocidad de orden
cero. Es por eso que la curva no es lineal ni sigue un patrón normal de acuerdo a la
bibliografía, y se obtienen altas y bajas en diferentes puntos de la curva. Por lo que podemos
decir que obtuvimos una reacción de seudo-orden cero, ya que según (Laguna J. 1972),
debido a que la velocidad de la reacción depende realmente de la concentración del sustrato
y esta dependencia no sale a la luz por la constancia del sustrato, se habla de una reacción
de seudo-orden cero.
En cuanto al tubo 9, comparando con los resultados de titulación de las demás mesas se
gastó lo mismo de ácido clorhídrico, lo cual fue muy poco comparado con los otros tubos,
esto es debido a que el cloruro de mercurio funciona como un inhibidor para la ureasa,
impidiendo llevar a cabo la reacción, formando un complejo. Inhibidores de la ureasa son
sustancias que impiden o inhiben durante un cierto tiempo la transformación del nitrógeno
ureico en amoniacal. Los inhibidores de la ureasa disminuyen la velocidad con la que la
urea se hidroliza enzimáticamente (Teijón Rivera, et al., 2009)
RAMOS HERNANDEZ ALEJANDRA
El objetivo de esta práctica fue medir y calcular la actividad enzimática de la ureasa, la cual
se extrajo del frijol de soya. Así también como calcular la concentración del sustrato en la
reacción enzimática de la ureasa. La ureasa es la encargada de catalizar la hidrólisis de la
urea, pues mediante la titulación del hidróxido de amonio que se forma se puede obtener la
cantidad de urea que se encuentra presente en la muestra. La ureasa se encuentra
principalmente en semillas, microorganismos e invertebrados, contiene seis subunidades
iguales, (Herrera, 2003).
El papel de la ureasa en semillas de soya no es del todo claro, aunque es posible especular
sobre ello. Las hojas de soya también contienen ureasa, pero en este caso, la enzima es
mil veces menos activa que en las semillas. Se sabe que la enzima de la hoja ayuda a
reciclar el nitrógeno de las proteínas. En las semillas, la ureasa hace lo mismo cuando los
granos germinan. El amoníaco resultante de la reacción también puede proteger las células
de la planta de patógenos parece ser que la enzima de la planta es en sí misma es un
insecticida, (Quezada, 2007).
Durante esta práctica se cuantificó la concentración de sustrato y se obtuvo la velocidad de
la reacción enzimática de la urea, esto fue posible mediante una muestra que se extrajo de
una semilla de frijol de soya fresca considerado como no purificado al estar crudo, pero eso
no importa ya que en él se encuentra la enzima, por eso previamente había sido triturado
para obtener el componente esencial para nosotros que es la ureasa.
Para que se dé una reacción de forma adecuada existen diversos factores entre los que
encontramos principalmente el pH en el cual el buffer de fosfatos será el encargado de
mantenerlo estable para que la reacción de la enzima se pueda dar, también es importante
porque en este caso que se realizó la determinación mediante una titulación donde el
cambio de viraje se verá afectado por el pH indicándonos que la reacción se dio completa,
otro factor muy importantes es la temperatura la cual ayuda a que la interacción entre la
enzima y el sustrato se dé rápidamente y en forma satisfactoria si la temperatura es alta, la
reacción se llevara a cabo en poco tiempo y de forma completa, (Taiz, 2006).
La ureasa de acuerdo a la clasificación de enzimas, pertenecen al grupo de las hidrolasas
esto nos indica que rompen enlaces de la hidrolisis. En esta se utiliza una solución
indicadora para poder observar un viraje de color, en este caso es el rojo de metilo, el cual
nos ayuda a identificar el cambio de color amarillo a un rosa, este viraje se muestra cuando
el hidróxido de amonio es neutralizado, donde el pH esta en 5 o por debajo.
Para inhibir la acción de la ureasa, se utiliza cloruro de mercurio (II), ya que en el sitio
catalítico la ureasa presenta grupos sulfhidrilo, los cuales provienen del aminoácido cisteína
que forma parte de una cadena peptídica. El HgCl2 se une irreversiblemente a los grupos
sulfhidrilo, de forma que los inactiva, deteniendo la actividad enzimática de la ureasa. Estos
inhibidores irreversibles se caracterizan por reaccionar con la enzima de forma covalente y
modifican su estructura química a nivel de residuos esenciales de los aminoácidos
necesarios para la actividad enzimática, (Taiz, 2006).
Para llegar a cuantificar la velocidad de la reacción producida por la ureasa, se utilizó una
solución de buffer de fosfatos a pH 7.2, del cual se le agregaron 4.5 mL a dos matraces
Erlenmeyer, #1 en el cual se daría la reacción enzimática de forma normal y el en matraz
#2, el cual se consideraría blanco sin reacción y en el matraz #3 blanco sin enzima se
añadieron 5 mL. Después se le añadieron a los tres matraces 7.5 mL de Urea 0.25 M y fin
finalmente al matraz #2 se la agregaron 4 gotas de HgCl2. Se dejaron ambos matraces 5
minutos en un baño de agua a 50°C, y posteriormente se agregaron 0.5 mL del extracto
crudo de ureasa los matraces marcados como #1 y #2. Después, se incubaron los tres
matraces por 30 min a 50° C, finalmente se la añadieron 4 gotas del inhibidor (HgCl2) al
matraz #1 y #3 para detener enzimática que se estaba dando. Para posteriormente poderlos
titular.
Para la titulación del matraz #1 en el cual se dio la reacción enzimática de forma normal se
requirieron de 31 mL dándonos como resultado 8.3 μmol ureasa hidrolizada/min, lo cual
nos indica que el inhibidor detuvo la reacción de forma adecuada una vez que se hidrolizo
la enzima, en comparación de los otros equipos, nosotros tuvimos el valor más pequeño lo
que nos puede indicar que se utilizó un exceso de agente valorante, pues sus valores
obtenidos fueron de; 11.3 μmol ureasa hidrolizada/min, 10.83 μmol ureasa hidrolizada/min
y 12.73 μmol ureasa hidrolizada/min.
Por otra parte en los matraces blancos, se gastó un muy pequeño volumen del HCl, en el
#2 se utilizaron 4.4 mL esto nos indica que no se dio una reacción previa, pues desde el
inicio se le añadió el inhibidor para evitar la reacción enzimática, lo mismo ocurrió con el
matraz #3 pues al no contener enzima no se presentan cambios.
La determinación de la concentración de sustrato nos puede indicar, que el proceso se
realizó de forma pertinente, de la misma forma que las titulaciones pues todos los equipos
obtuvimos 150mM, todo esto a pesar de que tuvimos que realizar cada una de la muestras
nuevamente, pues la primer titulación nos marcó un excedente sin darnos cuenta que solo
era una pequeña alícuota.
CONCLUSIONES

FLORES HERNANDEZ MAYELA

FLORES IBARRA JOSELYN GEORGINA
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteínica producidas por los seres vivos,
desempeñan un papel esencial en el metabolismo de todos los organismos, se encargan
de acelerar reacciones químicas. Lo que significa que a mayor velocidad de reacción menor
es la concentración de la enzima. El objetivo se cumplió de manera satisfactoria, ya que se
observó la actividad enzimática de la ureasa, además se pudo comprender mejor el uso de
los inhibidores y el efecto que estos tienen en las enzimas. Como QFB en formación
nosotros debemos aprender estos y más conocimientos básicos que muchas veces
olvidamos de manera rápida o no les damos la importancia necesaria.
PALOS DUEÑAS DULCE MARÍA
En esta práctica se logró medir y calcular la actividad de la enzima ureasa, extraída del frijol
de soya, mediante la titulación del hidróxido de amonio producido por la hidrolisis de la urea.
A su vez se conoció el efecto que produce la adición de un inhibidor sobre la reacción
catalizada por la ureasa. Se constató el efecto que produce la modificación de la
concentración de sustrato sobre la actividad enzimática de la ureasa, así como calcular y
graficar las variables involucradas a fin de visualizar el comportamiento enzimático.
Se aprendió sus usos y aplicaciones, así como la importancia que tiene en un análisis y su
uso para un estudiante de AQB, ya que en el área laboral y estudiantil le servirá y utilizará
con frecuencia en los análisis de muestras, he ahí la importancia de saber dominar y
conocer esta técnica.
RAMOS HERNANDEZ ALEJANDRA
Tras realizar los nombrados experimentos, observando los resultados podemos concluir
que al añadir un inhibidor irreversible como es el cloruro de mercurio (II), este modifica la
actividad de la enzima produciendo un descenso brusco de su velocidad inicial.
Esto lo observamos comparando el matraz #1 y el matraz #2, tras realizar la titulación de
ambos y haciendo los cálculos pertinentes respecto a las concentraciones de urea en la
reacción enzimática de la ureasa.
Por lo que concluimos que se acepta nuestra hipótesis inicial, y este inhibidor que estamos
estudiando es un inhibidor irreversible que modifica el centro catalítico de la enzima ureasa
y provoca que no tenga actividad ninguna, por lo que el sustrato no se metaboliza.
De este experimento hemos aprendido que los inhibidores irreversibles modifican la
proteína y frena su velocidad de reacción a 0.
BIBLIOGRAFÍAS
Casanova, M.P., & Benavides, C.Z. (1995). Actividad de la Ureasa en suelos de la zona
central de chile. Agricultura Tecnica (Chile). Vol 55:2. Pag 155-158.
Herrera, C.-Bolaños, N. (2003). Química de alimentos. Editorial de la Universidad de Costa
Rica. Costa Rica. 49 pp.
Laguna J. BIOQUÍMICA. (2a Edc.) 1972 Editorial LA PRENSA MÉDICA MEXICANA.
México Df.
Lorenc, A. (2010). La investigación de la acción de la ureasa. Science in School. Vol 9.
Recuperado de: http://www.scienceinschool.org/es/2008/issue9/urease.
Quezada, S. (2007). Manual de laboratorio para experimentos de Bioquímica. Editorial,
UNED. Costa Rica. 35-37 pp.
Taiz, L.-Zeiger, E. (2006). Fisiología vegetal. Volumen 1. Editorial, Universidad Jaume.
Estados Unidos. 133 pp.
Teijón Rivera, José María, Garrido Pertierra, Amando, and Blanco Gaitán, María Dolores.
Bioquímica estructural: conceptos y tests (2ª. Ed.). Madrid, ES: Editorial Tébar Flores, 2009.
ProQuest ebrary. Web. 31 August 2017.
Vasey Cristhofer. La Importancia del equilibrio àcido-base una visión practica y completa.
(3ª. Ed.). Madrid, ES: Editorial EDAF. 2003.