VITAMIN B2 :METODE MANUAL II

PRINSIP

Sama seperti metode Manual I, hanya fungsi ditionit diganti sodium hidrosulfit.

Pereaksi

1. Larutan riboflavin standar.

a. Larutan stok µg/ml. Larutan 50 mg ribofalvin (yang sudah dikeringkan dalam

desikator yang mengandung P2O5 disimpan dalam tempat gelap dalam asam
asetat 0,02 N, mengencerkan sampai volume 500 ml dengan asam asetat 0,02 N
(unttuk mempermudah pelarutan) tambahkan dulu 300 ml asam asetat (HOAC)
0,02 N, memanaskan dalam penangas air sambil di “stir”” (diaduk) sampai larut ,
mendinginkan dan menambahkan asam asetat 0,02 N sampai volumenya 500
ml). Simpan pada suhu 10 ᵒ C

b. Larutan intermediet 10 µg/ml. Megencerkan 100 ml larutan stok menjadi 1

liter dengan asam asetat 0,02 N. Simpan pada suhu 10 ᵒC

c. Larutan kerja 1 µg/ml. Mengencerkan 10 ml . encerkan 10 ml larutan

intermediet menjadi 100 ml dengan H 2). Siapkan segar, setiap hari akan
digunakan

2. Sodium hidrosulfit (Na2S2O4). Memurnikan tinggi disimpan dalam wadah dan tempat
yang aman, terhindar dari cahaya dan udara. Uji keaktifan sebagai berikut: memasukkan
masing-masing 10 ml H2O dan 1 ml larutan riboflavin standar(20µg/ml) kedalam 2 tabung
seperti pada tahap penetapan sampel. Sesudah menambahkan 8 mg Na 2S2O4, seharusnya
ribofalvin seluruhnya tereduksi dalam waktu <5 detik.

3. KmnO4 4 %

4. H2O2 3 %

5. Asam asetat glasial

6. HCL 0,2 N

7. NaOH 40 %

PERALATAN

1. Fluorometer

2. Tabung reaksi

3. Otoklaf

CARA KERJA

Persiapan sampel
a). Padatan atau semi pada yang tidak banyak mengandung senyawa basa.

1. mengambil sejumlah sampel, menambahkan HCl 0,1 N sebanyak, 10 berat kering sampel
sehingga larutan mengandung <0,1 mg riboflavin/ml. Jika sampel tidak segera larut, dispersikan
secara merata dengan pengadukan.

2. memanaskan campuran dlam otoklaf selama 30 menit pada suhu 121-123 ᵒC. Mendinginkan, jika
terbentuk gumpalan, aduk sehingga seluruh partikel terdispersi merata.

3. mengatur pH campuran dengan menambahakan larutan NaOH sampi pH 6,0-6,5. Kemudian

dengan segera menambahkan HCl encer sampai tidak ada lagi endapan yang terjadi (biasanya sampai
pH 4,5 diman pH 4,5 merupakan titik isoelektrik kebanyakan protein).

4. mencerkan sampai volume tertentu dimana campuran masih mengandung >0,1 µg riboflavin /ml
kemudian dengan kertas saring bebas abu

5. mengambil alikuot filtratyang jernih, kemudian memeriksa adanya protein yang terlarut dengan
cara menambahkan HCl encer setetes demi setetes, jika terbentuk endapan menamabahkan larutan
NaOH sambil diaduk , kemudian lanjutkan sebagai berikut:

5.1 jika tidak terbentuk endapan, maka menambahkan larutan NaOH sambil diaduk sampai pH
larutan 6,8, encerkan sampai volume tertentu sehingga mengandung kurang lebih 0,1 µg
riboflavin/ml. Jika keruh, maka disaring kembali

5.2 jika terbentuk endapan, maka pH larutan diatur sampai endapan yang terjadi maksimum.
Mengencerkan sampai volume tertentu di mana masih mengandung >0,1µg riboflavin/ml, kemudian
saring. Selanjutnya memperlakukan seperti 5.1

b). padatan atau semi padat yang megadung senyawa basa cukup besar.

1. mengatur pH sampel sampai pH 5,0-6,0 dengan menggunakan HCL encer. Menambahkan air
sebanyak 10 kali berat kering sampal sehingga larutan sampel mengandung <0,1 mg riboflavin/ml,
kemudian menambahkan 1,0 ml HCL 10 N untuk setiap 100 ml larutan sampel, memperlakukan
selanjutnya seperti a)

c). Cairan

1. mengatur pH sampel sampai pH 5,0-6,0 dengan menggunakan HCl encer atau larutan NaOH,
memperlakukan selanjutnya seperti b).

Penetapan Sampel

1. Memasukkan masing-masing 10 ml filtrat sampel kedalam 4 tabung reaksi. Kedalam

dua tabung pertama, menambahkan masing-masing 1 ml larutan kerja ribloflavin standar.
Kedalam dua tabung berikutnya tambahkan masing-masing 1 ml air.

2. Menambahkan 1 ml asam asetat pekat (glasial) kedalam masing-masing tabung

reaksi.
 3. Menambahkan 0,5 ml KmnO4 4 % samoil diaduk (untuk sampel susu segar tidak
diperlukan) kedalam masing-masing tabung reaksi , kemudian menambahkan masing-masing
0,5 ml H2O2 3 %. Warna permanganat harus hilang dalam waktu 10 detik, mengkocok dengan
cepat untuk menghilangkan oksigen yang tebentuk. Jika masih ada gelembung yang tertahan
dalam tabung reaksi, hilangkan dengan menggunakan gelas pengaduk.

4. Megukur flourensu standar ribovlafin , blanko standar, dan blangko sampel pada
flourometer dengan panjang gelombagng eksitasi 440 nm dan emisi 565 nm. Melakukan
pengukuran berdasarkan urutan berikut:

a. Sampel + 1 ml riboflavin standar (X)

b. Sampel +1 ml H2O (B)

c. Sampel +1 ml ribofalvin standar, 5 detik sebelum pengukuran menambahkan 20 mg

Na S2O4

d. Sampel +1 mml H2O, 5 detik sebelum pengukuran tambahkan 20 mg Na 2S2O4 (C)

PERHITUNGAN

Mgriboflavin/ ml larutan sampel akhir =B-C/X-B x 0,10 x 0,001 Nilai B-C/X-B harus ≥ 0,66 dan≤ 1,5.

CATATAN

Hindari seluruh pengerjaan dari cahaya dan usahan pH selalu < 7 (Riboflavin tidak stabil pada pH
diatas 7)

VITAMIN B2: METODE HPLC

PENDAHULUAN

Metode ini dapat diterapkan pada semua bahan makanan.

PRINSIP

Vitamin B2 diekstrak dari makanan dengan hidrolisa asam. Perlakuan dengan papain
dilakukan untuk menghilangkan senyawa pengganggu analiisi berupa protein , sedangkan perlakuan
dengan distase dilakuaka untuk membebaskan vitamin dari bentuk fosfatnya. Filtrat jernih yabg
didapat kemudian dielusi pada kolom HPLC dan vitamin B2 kemudian diukur langsung dengan
flourometer.

PEREAKSI

1. Asam sulfat 0,25 N, mengencerkan 7 ml asam sulfat (BJ 1,84) menjadi 1 liter dengan
akuades

2. Larutan buffeer, melarutkan 160 sodium hidroksida dalam akuades dan

mengencerkan sampai 500 ml. Melarutkan 272 g asam asetat galsial (BJ. 1,04) dalam
 akuades dan mengencerkan sampai 500 ml. Mencampur merata larutan tersebut dalam
jumlah yang sama.

3. Takadiastase, mnyipakan sa=uatu suspenu yang mengandung 100 ng diastase per ml

4. Papain 12. 000 E/g. Menyiapkan suatu suspensi yang mengandung 100 mg papapin
per ml

5. Asam trikloro asetat, melarutkan 45 g asam trikloro asetat dalam akuades dan
mengencerkan sampai 100 ml.

6. Merckosorb SI 60 . silika gel untuk HPLC, ukurab partikel 10 mikron.

7. Laruta pengelusi pH 4,6 Larutan 27,2 g sodium asetat triihidrat (CH 3COONa) dalam
akuades dan mengencerkan samapai 1 Liter. Melarutkan 12 g asam asetat dalam air dan
mengencerka menjadi 1 liter. Mencampurkan kedua larutab tersebut dalam jumlah yag sana
dan mengencaerkan lima kali.

8. Larutan stok riboflavin standar, 30 µg/ml. Timbang 15.0 mg riboflavin dan masukkan
ke dala labu takar 500 ml yang berisi 300 ml akuades hanyat. Menambahkan 40 ml asam
sulfat 0,25 N dan 4 ml asam trikliro asetat 45%. Mengkocok sapai semua ribovlafin larut dan
mengencerkan sampai 500 ml dengan akuades. Menyimpan dalam tempat gelap pada suhu
0-4ᵒ.

9. Larutan kerja riboflavin standar 1,5 µg/ml. Pipet dan masukkan kedalam labu takar
200 ml sebanyak 10 ml larutan stok ribovlafin standar. Mengencerkan sampai tanda tera
dengan akuades.

PERALATAN

1. Otoklaf , dapat menghasilkan uap air bertekanan 15 lb/in 2 atm (pada 121ᵒC)

2. Penangas air. Penangas air bergoyang lebih dianjurkan , suhu 40-45ᵒC dan 50-60ᵒC.

3. Sentrifus kecepatan tinggi. Maksimum 30.000 λ g

4. Tabung sentifus kapasitas 50 ml

5. Peralatan untuk HPLC. Bagian –bagian yang harus ada antara lain adalah :

1. Pompa bertekanan tinggi

2. ”sampler” dengan tabung sanpel berkapasitas 1,7 ml.

3. 3. Kolom logam 12,5 cm x 0,46 cm diamter dalam isi kolom (Packing) merckosorb SI
60 dengan ukuran partikel 10 mikron.

4. “sampel loop”” 60 µ

5. Fluorometer dengan sel yang dapat dialiri sampel, panjang gelombang eksitasu 435
nm, emisi 545 nm
 6. Pompa pengatur.

CARA KERJA

1. Menimbang tepat sejumlah sampel yang mengandung 0m5 g padatan (miasalnya

apabila kadar air sampai 80 % timbang 2,50 g) dan masukkan ke dalam tabung sentrifius.

2. Menambahkan akuades meggunakan pipet Mohr sampai jumlah air total menjasi 2
g (misalkan sampel mengandung air kurang dari 10 % maka akuades dibutuhkan adalah 2 ml)

3. Pipet dan memasukkan 2 ml larutan kerja riboflavin standar kedalam tabung

sentrifus lainnya (catatan: untuk setiap 5 tabung sampai diperlukan satu tabung standar)

4. Tambahkan kedalam tabung masing-masing 10 ml asam sulfat.

5. Tutup tabung –tabung tersebut dengan alumunium foil.

6. Panaskan dalam otoklaf pada 121ᵒC (15/in2) selama 30 menit

7. Mendinginkan, dan menambahkan 1,5 ml larutan buffer . mengkocok sampai pHnya

mencapai 4,6.

8. Menambahkan 1 ml takadiastase dan mengkocok sampai merata.

9. Meletakkna tabung dalam penangas air bergoyang pada 40-45ᵒ C selama 25 menit.

10. Menambahkan 1 ml papain, mengkocok merata dan melanjutkan pemanasan selama

2 jam pada 40-45 ᵒC

11. Menambahkan asam trikloroasetat mengkocok sampai merata

12. Memanaskan tabung selama 5 menit dalam penangas air 50-60ᵒ C.

13. Sentrifus tabung selam 5 menit pada kececpatan 30.000 x g

14. Menginjeksikan secara manual 60 µg supernatan atau secara otomatis ke dalam

kolom HPLC.

15. Mengukur tinggi puncak untuk sampel dan standar pada kromattografi

PERHITUNGAN

Misalkan : tinggi puncak sampel =h

Tinggi puncak standar =H

Barat sampel (g) =W

Maka : kadar riboflavin dalam sampel (mg /100 g)

= (3/W) x (h/H) x (100/1000)

= 0,3 H/W x H
Catatatn

1. Memerikasa stiap “batch “enzim yang digunakan dengan metode hidrolisa riblovlafin
mono-5-fosfat-Na. Apabila pereaksi ini memberikan nilai blanko, koreksi tinggi puncak
sampel maupun standar.

2. Hindarkan seluruh prosedur kerja dari cahaya ultraviolet langsung. Lakukan analisis
dalam ruang gelap.

NIASIN

Penetapan niasiin ini disasarkan atas reaksi antara niasin dengan sianogen bromida yang
membentuk senyawa piridinum. Senyawa yang terbentuk ini kemudian berubah menjadi senyawa
turunan yang berpasangan dengan amin aromatik membentuk senyawa berwana . pada kondisi
yaang terdapat kepekatan warna senyawa yang terbentuk tersebut sebanding dengan kadar
niasisndan dapat diukur dengan spektrofotometer.

PEREAKSI

1. Larutan stok H2SO4 10 N.

2. H2SO4 0,2 N. Dibuat dari larutan stok H2SO4 10 N

3. H2SO4 0,2 N dibuat dari larutan H2SO4 2 N

4. Larutan stok NaOH 10 N

5. NaOH 0,5 N dibuat dari larutan stok NaOH 10 N

6. Alumunium silikat hidrat

7. Pb-nitrat

8. Larutan fenolftalein 1 %. Melarutkan 1 g fenolftalein dalam 100 ml etanol 70 %

9. Potsium fosfat K3PO4

10. Larutan asam fosfat 20%

11. Larutan stok niasin standar , menempatkan 500 mg niasin yang sudah dikeringkan
dengan P2O5 dalam labu takar 500 ml. Menambahan 5 ml H 2SO4 10 N dan larutan kristal
niasin dalam asam ini, kemudian mengencerkan sampai tanda tera dengan air. Larutan
mengandung 1 mg niasin / ml atau 1000 µ g/ml. Jika disimpan pada suhu refrigasi dan
terhindar dari sinar matahari , larutan ini stabil selam 8-12 bulan

12. Larutan kerja niasin . mengencerkanstok niasin standar menjadi 200 ml dengan air.
Larutan ini mengandung 25 µg niasin/ml buat setiap hari akan digunakan.

13. Larutan potasium fosfat KH2PO4 10 %

14. Larutan sianogen bromida 0,5 M. Larutan 53 g CNBr dalam air dan encerkan menjadi
1 dengan air . memperhatikan , karena CNBr sangat beracun!!
 Pembuatan dan mengguanakan pereaksi ini harus dilakukan di ruangan asap denagan
menggunakan pompa penghijsap dan pipet yang sesuai jangan dipipet denga mulut!! Simpan
dalam botol gelas berwarna coklat.

15. Larutan sianogen bromida dalam buffer 5%. , melarutka 12,5 g KH 2PO4 dalam 250 ml
larutan stok CNBr 0,5 M. Simpan dalam botol berwarna coklat.

16. HCl 8 N

17. HCL 0,5 N

18. Larutan asam sulfaniat 10 % dalam HCl 0,5 N larutan ini harus ber pH 4,5
(menyesuikan jika perlu dengan NH4OH) dan hampir tidak berwarna.

PERALATAN

1. Otoklaf]spektrofotometer

2. Sentrifus

3. pH-meter

Cara Kerja

Ekstraksi

1. menimbang sejumlah sampel ya nh diperkirakan mengadung 10 µg niasin ,

masukkna kedalam tabung setrifus berskala. Mengemcerkan menjasi 15 ml dengan air

2. menambahkan 5 ml H2SO4 menempatkan pada penangas air mendidih selama 1 jam

aduk dengan pengduk gelas sekali-kali

3. mendinginkan tabung dengan air dingin dan mencuci gelas pengaduk , memasukkan
cucian kedalam tabung , mengencerka menjad 25 ml denga air

4. sentrifus pada 2000 rpm selam 20 menit.

Adsorpsi dan elusi niasin

1. pindahkan 10 ml alikuot supernatan dengan pipet ke dalam gelas piala 50 ml.

2. Tambahkan 2 ml NaOH 10 N, keudian atur pHnya, menjadi 0,5 -1,0 dengan

penambahan tetes demi teets Na OH 10 N atau H 2SO4 , gunakan pH meter

3. Memindahkan larutan secaraa kuantitatif ke dalam tabung sentrifus yang berisi 2 g

alumunium silikat bidrat . menggunkan sedikit H 2SO4 0,2 N untuk membilas gelas piala

4. Mengasuk selama 1 menit dengan menggunakan gels pengaduk. Bilas geas pegaduk
dan sisi tabung dengan H2SO4 0,2 N. Sentrifuse selama 5 menit pada 2000 rpm, dan
membuang supernatan
5. Mencuci endapan dengan 10 ml H2SO4 0,2 N sentrifuse kembali dekantasi sempurna
dan buang supernatan.

6. Menambahkan 15 ml NaOH 0,5 ke dalam tabung sentrifuse kembali, mengaduk

untuk menghomogenkan endapan , mencuci gelas pengaduk dan mengencerkan menjadi
21,2ml ai. Mengaduk merata dan entifuse selama 5 menit 2000 rpm, dan mengumpulkna
supernatan

7. Jika sampel terlau berwarna maka perlu dihilangkan warnanya dengan cara berikut:
menempatkan supernatan dalam tabung sentrifuse , menambahka 1 g Pd-nitrat dan 1 tetes
fenolftalein . mengaduk sampai warna merah jambu hilang. Sentrifuse selam 5 menit pada
2000 rpm, dekantasu supernatan , memasukkan ke dalam tabung reaksi lain yang berisi 1
teetss fenolftalein . menampbahkan K3PO4 secukupnya sampai larutan berwarna merah
jambu kembbali, kemudian menambahkan tetes demi tetes H 3PO4 20 % secukupnya sampai
pH larutan 4,5 (gunakan pH meter) sentrifuse selam 5 menit pda 2000 rpm

8. J9ka penghilangan warna tiddak diperlukan, mengatur pH supernatan dan tahap 6

menjadi 4,5 dengan H3PO4 20%.1