Anda di halaman 1dari 46

TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Roga F. Kembaren, M.Si.


Tahap-tahap dalam pengembangan bioproses untuk menghasilkan
produk yang dibuat dengan teknologi DNA rekombinan

Pauline M.Doran, 1995, Bioprocess Engineering Principles


Rekombinasi DNA di Alam
Transformasi

Transduksi
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN

Teknologi DNA rekombinan = rekayasa genetika

 proses pembentukan kombinasi materi genetik yang baru,


biasanya dengan rekombinasi DNA dari organisme berbeda
melalui cara buatan dengan bantuan enzim yang dikenal
sebagai enzim restriksi, dan produksi salinan DNA rekombinan
dalam jumlah banyak di dalam suatu sel organisme lain yang
berperan sebagai sel inang melalui proses yang disebut
dengan kloning.
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Proses untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi
DNA rekombinan melibatkan beberapa tahap:

isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon


 pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai
ukuran
 pemotongan vector/plasmid
 penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul
DNA rekombinan
transformasi molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang,
 reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang dan
 analisis DNA rekombinan.
Kloning DNA:
Proses penyisipan DNA ke dalam
suatu vector (plasmid) dan kemudian
direplikasi dalam sel inang untuk
menghasilkan salinan DNA dalam
jumlah banyak
TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
Kloning DNA melibatkan lima komponen utama:
1. DNA donor (DNA sisipan atau DNA asing) : DNA sumber atau gen yang diklon
2. Enzim restriksi: enzim yang digunakan untuk memotong DNA donor dan vektor
pada lokasi spesifik, sehingga DNA donor dapat disisipkan ke dalam vektor
3. Vektor: plasmid atau bakteriofaga yang digunakan untuk mengintroduksi gen
yang diklon ke dalam sel inang yang sesuai.
4. DNA ligas: enzim yang digunakan untuk menggabungkan ujung vektor dan DNA
donor untuk menghasilkan DNA rekombinan
5. Sel inang: pada umumnya bakteri atau sel ragi.

Vektor/plasmid yang telah disisipi DNA donor /DNA asing disebut sebagai
vektor/plasmid rekombinan.
Vektor rekombinan dimasukkan ke dalam sel inang untuk menghasilkan jumlah
DNA rekombinan dalam jumlah lebih banyak.
ENZIM RESTRIKSI
 Enzim bakteri yang mengenali urutan nukleotida spesifik pada DNA untai ganda dan
memotong DNA pada lokasi tersebut.

 Enzim restriksi memotong DNA menjadi fragmen-fragmen dengan berbagai ukuran,


tergantung pada jumlah situs pengenalan enzim dalam molekul DNA tersebut.

 Enzim restriksi tipe II, yang digunakan dalam kloning DNA, mengenali urutan pasangan
basa 4 sampai 8 nukleotida dan memotong dalam urutan tersebut. Urutan ini disebut
sebagai urutan pengenalan enzim restriksi.

 Pada umumnya, enzim restriksi memiliki urutan pengenalan yang disebut dengan
palindrom. Palindrom adalah urutan 4 sampai 6 pasangan basa yang sama pada kedua
untai jika dibaca pada arah yang sama (5’  3’).

 Tergantung pada lokasi pemotongan pada urutan pengenalan, hasil pemotongan oleh
enzim restriksi dapat memberikan ujung runcing (sticky end) (baik ujung 5’ atau ujung 3’
menonjol) dan ujung tumpul (blunt end)
ENZIM RESTRIKSI
Ada 3 tipe enzim restriksi:
 Tipe I dan III memotong DNA tapi kurang
presisi, tidak digunakan untuk manipulasi
DNA.

 Tipe II
– Mengenali urutan spesifk pada DNA
– Memotong DNA pada urutan spesifik.
– Dapat meghasilkan DNA dengan “sticky
ends”
ENZIM RESTRIKSI
Pada umumnya urutan DNA yang dikenali oleh enzim
restriksi adalah urutan DNA palindrom, yaitu urutan DNA
yang sama bila dibaca arah 5’→ 3’ atau 3’→ 5’

Contoh enzim restriksi:



ENZIM RESTRIKSI
Pemotongan DNA dengan enzim restriksi dapat
menghasilkan fragmen DNA dengan:
Sticky end atau
Blunt end
Contoh sticky end
Sticky end:
fragmen DNA hasil pemotongan
enzim restriksi dengan
ujung menggantung (ada basa
yang tidak berpasangan)
ENZIM RESTRIKSI
Blunt end : fragmen DNA hasil pemotongan enzim
restriksi yang ujungnya tidak
menggantung (tidak ada basa yang
tidak berpasangan).

Contoh blunt end: SmaI

5’-CCCGGG-3’ 5’-CCC-3’ 5’-GGG-3’


3’-GGGCCC-5 3-’GGG-5’ 3’-CCC-5

blunt ends
RESTRICTION MAP
BamHI
VEKTOR (PLASMID)

 Plasmid Kloning (Cloning Plasmid)


Plasmid kloning berfungsi hanya sebagai pembawa gen
asing tapi tidak memiliki perangkat untuk
mengekspresikan gen sisipan tersebut menjadi protein.

 Plasmid Ekspresi (Expression Plasmid)


Plasmid ekspresi dapat berfungsi sebagai plasmid kloning
sekaligus dapat mengekspresikan gen sisipan, karena
memiliki perangkat untuk ekspresi gen.
PLASMID
Contoh plasmid kloning:
PLASMID
Plasmid/vektor ekspresi:
• Plasmid ekspresi juga adalah plasmid kloning.
• Selain alat-alat untuk kloning gen, juga memiliki alat-alat
untuk ekspresi gen.
(promotor, ribosom binding site(rbs) dan terminator).

• Gen (coding gene) yang disisipkan (diklon) pada plasmid


ekspresi dapat diekspresikan menjadi protein/enzim.
PLASMID
Contoh peta plasmid ekspresi
DNA LIGASE
DNA ligase
• Menggabungkan dua fragmen DNA.
• Mengkatalisa pembentukan ikatan fosfodiester
antara gugus fosfat dan gugus hidroksil.
• Enzim yang sama yang menggabungkan
fragmen Okazaki pada lagging strand pada
proses replikasi DNA.
LIGASI
Ligasi: proses penggabungan dua fragmen DNA
oleh enzim ligase.
TRANSFORMASI

Transformasi adalah proses transfer DNA


rekombinan ke dalam sel.
Ada dua metoda yang umum utuk transformasi:
1. Metoda kimia menggunakan CaCl2 dan heat
shock.
2. Elektroporasi berdasarkan kejutan pendek
arus listrik yang memfasilitasi masuknya DNA
ke dalam sel.
TRANSFORMASI
CaCl2 dan heat shock

• Penambahan CaCl2 (dalam keadaan dingin, hanya


menyebabkan DNA menempel (mengendap) pada
dinding sel, di luar sel.
• Dengan menaikkan suhu sampai 42C,
menstimulasi DNA masuk ke dalam sel.
Menumbuhkan sel pada media seleksi:
• Setelah ditransformasi, sel ditumbuhkan pada media
seleksi yang mengandung bahan yang merupakan marker.
• Gen pengkode marker dibawa oleh plasmid, misalnya gen
pengkode resisten antibiotik, yang menandakan bahwa sel
telah membawa plasmid.
• Media seleksi juga dapat ditambahkan bahan lain yang
dapat mengindikasikan bahwa plasmid rekombinan yang
ditransformasikan ke dalam sel telah berhasil disisipi oleh
DNA asing.

Contoh: blue white screening


Untuk konfirmasi apakah plasmid rekombinan yang
dibawa oleh transforman benar-benar telah mengandung
gen (DNA) target, dapat dilakukan karakterisasi plasmid
terhadap plasmid rekombinan tersebut.

• Isolasi plasmid rekombinan dari sel rekombinan.


• Elektroforesis bersamaan dengan plasmid asal atau
plasmid tanpa DNA sisipan. Bandingkan jarak migrasi:
plasmid yang telah membawa DNA sisipan akan
bermigrasi lebih lambat.
• Potong plasmid tanpa DNA sisipan dan plasmid
rekombinan masing-masing dengan enzim restriksi yang
sama digunakan saat kloning.
• Elektroforesis hasil pemotongan:
- pada plasmid asal akan ada hanya satu pita sedangkan -
- pada plasmid rekombinan akan ada dua pita DNA:
yang berukuran lebih besar merupakan plasmid asal dan
yang berukuran lebih kecil merupakan DNA sisipan.

Plasmid asal

DNA sisipan
Istilah-istilah dalam kloning:
• DNA rekombinan: fragmen DNA yang disisipkan
ke dalam vektor (plasmid).

• Plasmid rekombinan: plasmid yang telah disisipi


gen (DNA) asing.

• Sel kompeten: sel yang telah siap dimasuki oleh


DNA asing /plasmid rekombinan.

• Transformasi: proses masuknya DNA


rekombinan ke dalam sel.
Istilah-istilah dalam kloning (cont’d)
• Transforman: sel kompeten yang telah dimasuki
DNA rekombinan dan yang tumbuh pada media
seleksi.

• Media seleksi: media yang digunakan untuk


menumbuhkan sel yang telah ditransformasi, pada
umumnya mengandung bahan yang berfungsi
sebagai marker seleksi, contohnya: antibiotik.

• Sel rekombinan: sel yang telah megandung


plasmid rekombinan.
TEHNIK-TEHNIK YANG DIGUNAKAN
PADA KLONING DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Amplifikasi DNA secara in vitro.
Pertama kali dikembangkan oleh Dr. Kary Mullis pada tahun 1983
dan meraih Nobel pada tahun 1993.
PCR menggunakan enzim DNA polimerase yang stabil pada suhu
tinggi (thermostable enzyme) seperti Taq DNA polymerase yang
diisolasi dari bakteri Thermus aquaticus.
Pada PCR, DNA dipolimerisasi dalam siklus berulang dari
pemanasan dan pendinginan untuk mencapai akumulasi logaritmik
dari produk DNA.
Pada kloning PCR digunakan untuk isolasi dan memperbanyak
fragmen DNA atau gen yang akan diklon.
Syarat untuk dapat melakukan isolasi DNA dan memperbanyak gen
dengan PCR; harus tahu urutan DNA-nya, setidaknya pada daerah
ujung 5’ dan 3’.
PCR
Isolasi fragmen DNA spesifik dari
genomik DNA secara langsung →
menggunakan PCR
 Urutan fragmen DNA spesifik
tersebut telah diketahui
 Fragmen DNA yang teah
diisolasi dengan tehnik PCR
dapat diinsersi (diklon) ke
dalam plasmid dengan terlebih
dahulu memotong plasmid dan
fragmen DNA dengan enzim
restriksi yang sama.
ELEKTROFORESIS DNA
• Menggunakan gel gel agarosa atau gel
poliakrilamid.
• Memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran.
• Menggunakan buffer yang dapat mengalirkan arus.
• Membutuhkan aliran listrik.
• DNA yang bermuatan negatif bemigrasi ke arah
kutub positif.
• Fragmen DNA yang lebih besar bermigrasi lebih
lambat, fragmen DNA yang lebih kecil bermigrasi
lebih cepat.
• DNA divisualisasi dengan pewarna fluorescent.
HIBRIDISASI KOLONI (COLONY BLOT HIBRIDIZATION)
SKRINING DENGAN AKTIVITAS ANTIBODI
SOUTHERN BLOTTING
 Fragmen DNA yang diperoleh dari hasil
pemotongan oleh enzim restriksi dan dipisahkan
pada gel elektroforesis DNA.

 Untai ganda DNA didenaturasi menjadi untai


tunggal secara in situ (pada gel agarosa)

 Gel “blotted” dengan membran tertentu untuk


transfer DNA (DNA ditransfer ke membran).

 Membran diinkubsi dengan suatu labeled probe


yang mengandung untai tunggal DNA murni yang
mengkode gen spesifik.
SHOUTERN BLOTTING
• Hibridisasi DNA

Labeled Nucleic Acid


SHOUTERN BLOTTING

Hibridisasi DNA
Northern blotting (hibridisasi RNA)
(prinsip sama dengan hibridisasi DNA)

 target dan probe adalah RNA (mRNA)

 mRNA dipisahkan dengan elektroforesis


 blotted pada membran.
 dihibridisasi

39
SEKUENSING DNA
 Menentukan urutan basa DNA
 Metoda sekuensing DNA yang modern
menggunakan metoda Sanger
 Metode Sanger menggunakan 2’,3’-
dideoxynucleotide triphosphates (ddNTPs)
yang memiliki sebuah H pada karbon-3 dari gula
ribosa.
 Inkorporasi ddNTP pada rantai DNA
menghentikan elongasi (perpanjangan) rantai.
PROTEIN FUSION
• Fusi protein dilakukan pada tingkat DNA
• Gen pengkode fusi bisa ditambahkan pada urutan gen
target pada saat amplifikasi DNA dengan PCR
(ditambahkan pada urutan primer) atau
• Gen pengkode fusi sudah ada pada plasmid yang
digunakan untuk kloning.
• Tujuan membuat protein fusi adalah untuk memudahkan
dalam melakukan pemurnian protein → pemurnian satu
tahap (kromatografi affinitas)
PROTEIN FUSION
Contoh: His-tagged protein
His-tag terdiri dari 6 histidin yang berfusi dengan protein
(ditambahkan pada N-terminal atau C-terminal protein)

Interaksi protein-His-tag dan kolom Nikel


CONTOH APLIKASI TDR

45
ProduksiCONTOH
Fruktosa dan Alkohol TDR
APLIKASI dari Pati

Peningkatan Produksi Fruktosa dan Alkohol dengan rekayasa genetika

 Overproduksi enzim dalam rekombinan mikroorganisma yang mampu


menggunakan substrat yang murah.
 Menggunakan enzim -amilase yang dapat berfungsi pada suhu tinggi
(80 -90C)
- meningkatka kecepatan hidrolisis pati yang tergelatinasi dan dengan
cara bersamaan menurunkan jumlah energi yang dibutuhkan untuk
mendinginkan pati yang tergelatinasi.
 Merubah gen pengkode amilase dan glukomilase sehingga kedua enzim
memiliki suhu dan pH optimum yang sama. Sehingga tahap liquefaction
dan saccharification dapat berjalan pada kondisi yang sama.
 Enzim direkayasa sehingga dapat secara efisien mendegradasi bahan
mentah pati, mengurangi tahap gelatinasi dan menghemat jumlah energi
 Mengembangkan mikroorganisme yang dapat mensintesa glukoamilase
dan mensekresikannya, sehingga tidak perlu ditambahkan selama proses
fermentasi.
46