JURUSAN KIMIA

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS HALU OLEO
KENDARI
2015
Elektroforesis adalah teknik pemisahan
komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik

berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan

negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak
menuju kutub positif (anode), sedangkan partikel-partikel PRINSIP
bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub KERJA
negatif (anode).
Elektroforesis Kapiler
 Bagian sampel
Bagian sampel yang
yang bermuatan
bermuatan positif
negatif

sampel Media pendukung kertas,

- katoda agarosa, poliakrimide dll

+ anoda

buffer
 Sejarah

Tahun 1952

Markham dan Smith mempublikasikan bahwa

hidrolisis RNA terjadi melalui mekanisme
pembentukan zat antara (intermediate) posfat
siklik, yang kemudian menghasilkan
nukleosida 2′-monoposfat dan 3′-monoposfat.

dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah Elektroforesis

tangki kecil dan berbagai larutan penyangga
(buffer). Elektroforesis ini digunakan untuk
pemisahan DNA/RNA
 jenis elektroforesis yang
terdiri dari kertas sebagai
fase diam dan partikel yang
terlarut sebagai fase gerak,
terutama ion-ion kompleks

Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang

sistem pemisahan. Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada
muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan yang
digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan
adsorbsivitas zat terlarut.
Kertas saring dibasahi dengan Kertas saring direntangkan diantara
larutan buffer dua elektroda

Satu tetes campuran yang akan

kertas dipindahkan dikeringkan dan
dianalisis ditempatkan pada satu
diwarnai dengan pewarna yang
mewarnai substansinya untuk ujung kertas dan listrik dialirkan
dianalisa(diperiksa)

Dibandingkan dengan
suatu standar

Setiap jenis molekul bermuatan

pada campuran (mixtura) akan
berpindah pada jarak tertentu
baik ke anoda maupun ke
katoda tergantung pada
muatan dimensi dan akan
nampak sebagai titik pada
kertas dengan posisi yang baru
Campuran asam aspartat, setetes larutan dari campuran
histidin dan lisin asam amino, dikeringkan pada
kertas dan diberi pewarna

Ujung kertas dicelupkan ke

dalam kompartemen elektroda kertas dibasahi dengan buffer
pada PH tertentu dan
ditempatkan diantara
Asam amino yang bersifat sebagai lempengan pendingin
kation pada PH tersebut akan
bermigrasi menuju katoda atau kutub
negatif. Asam amino yang bersifat anion kertas dikeringkan, disemprot
akan bergerak menuju anoda atau dengan ninidrin dan panaskan
kutub positif yang memperlihatkan letak
asam amino

diidentifikasikan dengan posisi asam amino yang telah

diketahui, sebagai marker
 Smithies mendemonstrasikan bahwa gel yang
Tahun 1955 terbuat dari larutan kanji dapat digunakan
untuk memisahkan protein-protein serum
manusia.

Menuangkan larutan kanji panas ke dalam

cetakan plastik, setelah dibiarkan mendingin
kanji tersebut akan membentuk gel yang padat
namun rapuh.Ternyata elektroforesis gel yang
Gel kanji berperan sebagai fasa diam
(stationary phase) menggantikan kertas saring
Whatman pada teknik terdahuludiperkenalkan
Smithies memicu para ilmuwan untuk
menemukan bahan kimia lain yang dapat
digunakan sebagai bahan gel yang lebih baik,
seperti agarosa dan polimer akrilamida.
Teknik elektroforesis gel makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12
tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel
Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan
bis-akrilamida yang digunakan untuk DNA
Dalam elektroforesis gel molekul-molekul tersebut dipisahkan
berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam
kandungan gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran
molekul bersangkutan
 Agarose ditempatkan pada kotak Hubungkan tangki elektroforesis
elektroforesis yang berisi buffer dengan sumber arus. Kutub
TAE negatif pada sisi yang dekat
dengan sumuran

Mesin elektroforesis dimatikan Hidupkan sumber arus dengan voltase 100

dan agarose diangkat volt, dan dijaga agar tetap konstan.
Elektroforesis selama 30 menit.

Agarose direndam dalam larutan Angkat agarose dan dicuci

Ethidium Bromida (konsentrasi dengan akuades selama
5 mikro gr/mL) selama 10 menit beberapa menit (destaining, agar
sambil digoyangkan pelan. kelebihan EtBr tercuci).

Permukaan plat UV dicuci dengan air,

Pita kemudian dilihat di uv kemudian agarose ditempatkan pada plat
(trasliminator tersebut.
 Elektroforesis kapiler adalah
metode elektroforesis yang
digunakan untuk memisahkan
asam amino, protein,
lipid, karbohidrat dan
nukleotida, dengan resolusi
tinggi yang dilakukan pada
pipa kapiler berisi buffer.

Metode ini mulai digunakan secara luas pada akhir tahun 1940. Elektroforesis
kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkan semua
komponen ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapat dilakukan
dengan teknik pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.Teknik pemisahan
ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dan diameter
pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.
• Teori Dasar :
– Aliran digerakkan oleh EOF dlm kapiler
– Dipengaruhi oleh pH, medan listrik, suhu dan
– Senyawa lain (EOF) modifier
• Detektor (UV-Vis)
– langsung dan Tidak Langsung
• Sistim Injeksi
– Hidrodinamik
– Elektrokinetik
– Tekanan (Positif dan reduksi)
1. Dalam elektroforesis, sampel yang
mengandung protein biasanya
dicampur dengan SDS (sodium
dodecyl sulfat)
2. Muatan negatif SDS tersebut
mengganggu kestabilan protein,
sehingga protein mengalami
denaturasi.
3. Suatu protein multimer juga akan
terurai menjadi monomer
penyusunnya
4. Sampel dengan protein rantai
polipeptida lurus tersebut dimasukkan
dalam suatu membran poliakrilamid
yang dialiri arus listrik
5. Dalam gel poliakrilamid tersebut akan
terbentuk pita-pita yang merupakan
protein-protein yang telah terpisah
berdasarkan berat molekul
 Alat elektroforesis

DNA, RNA atau

protein

Gel

EtBr

Loading dye

Buffer TAE
RNA, DNA DAN PROTEIN
Gel agarose

Gel poliakrilamid
Ada tiga jenis gel yang dapat digunakan dalam
elektroforesis DNA, yaitu sebagai berikut :

1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi untuk memurnikan

penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil ekstensi
primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA
yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk
menyediakan sistem elektroforesis yang digunakan untuk fraksi
RNA pada ukuran standar.
 merupakan polisakarida
turunan yang didapat dari alga
merah. Gel agarose dapat
digunakan untuk memisahkan
DNA berukuran lebih dari 100
bp.

Agarosa Gel agarose merupakan fase diam dalam pemisahan fragmen

DNA, konsentrasi agarose yang digunakan dalam pemisahan fragmen
DNA sangat mempengaruhi mobilitas fragmen DNA, semakin besar
konsentrasi agarose yang digunakan maka semakin kecil pori-pori gel, dan
semakin kecil konsentrasi agarose maka semakin besar pori-pori gel.
 Resolusi dalam
memisahkan DNA lebih
tinggi jika dibandingkan
gel agarosa sehingga
panjang molekul DNA
yang berbeda hanya satu
nukleotida dapat
dideteksi.

Elektroforesis gel poliakrilamid dapat memisahkan protein

dengan ukuran 5—200 kDa, sedangkan untuk pemisahan
fragmen DNA hanya dalam rentang ukuran DNA yang sempit
yaitu antara 5—500 bp.
 Gel direndam dalam larutan
buffer TBE atau TAE yang mengandung
ethidium bromide, selanjutnya ethidium
bromide akan berdifusi ke dalam gel dan
berasosiasi dengan DNA (Switzer,
1999).
Ethidium bromide mampu
berinterkalasi diantara pasang basa
nukleotida pada struktur double heliks
(Gambar 3) dan saat gel hasil
elektroforesis disinari dengan ultraviolet
maka fragmen-fragmen DNA yang telah
terpisah tampak sebagai band-band
berwarna oranye (Campbell dan Shawn,
2009).
Dibuat dari
bromophenol blue;
xylene cyalol; ficoll tipe
dan EDTA

Sebagai pemberat agar

tidak keluar dari
sumuran
TAE (Tris-Asetat-EDTA) adalah buffer
memberikan resolusi yang lebih baik dari
fragmen> 4 kb, tegangan untuk buffer TAE
adalah 5-50 V / cm dibandingkan dengan 5-
10 V / cm.

Buffer TAE ini dibuat dari 20 mM Tris

asetat dengan 1 mM EDTA pH 8,0. b. Tris /
Borat / EDTA (TBE) Buffer TBE (Tris-
Borat-EDTA) memberikan resolusi yang
lebih baik 0,1-fragmen 3-kb (<300-bp pada
gel agarosa 2%).
Dalam kegiatan biologi molekuler,
elektroforesis merupakan salah satu cara
untuk memvisualisasikan keberadaan DNA,
plasmid, dan produk PCR.

Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk

pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari.

Memudahkan identifikasi protein yang

terdapat pada sebuah DNA.
 Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Kertas

Kelebihan Kekurangan

 Mudahnya mengamati reaksi • Rawan terjadi kesalahan

kimia selama proses pada proses pemindahan
berlangsung
campuran sampel ke dalam
• Sampel dapat ditangani
dengan baik dan baik slot gel,karena slot gel
• Gel dari hasil percobaan dapat ukurannya sangat kecil
disimpan dalamkantong plastik
dan didinginkan seteah
percobaan, sehigga dapat
dipakai untuk dokumentasi
penting yang dapat dipelajari
lebih lanjut dilain wakt.
Kelebihan Dan Kekurangan Elektroforesis Gel

kelebihan kekurangan
 Proses migrasi lebih cepat  Adanya gangguan yang
 Pemisahan spot menjadi disebabkan oleh adanya
lebih kecil dengan gugus OH yang terdapat
spektrofotometri pada selulosa yang dapat
 Mudah dilarutkan dalam berinteraksi dengan molekul
jumlah sedikit polar sehingga daya migrasi
molekul tersebut terganggu
dan menjadi lebih rendah