REPORTE DE PRÁCTICA “CINÉTICA DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO DE

MICROALGA CHLORELLA VULGARIS”

Equipo: 3

División de Ingeniería Bioquímica, Tecnológico de Estudios Superiores de Ecatepec, Av.

Tecnológica S/N C.P. 55210 Col. Valle de Anáhuac, Ecatepec de Morelos, Estado de México

10 de Enero del 2018

Resumen. En esta práctica experimental se llevó acabo un medio de cultivo mineral en novecientos
mililitros enriquecido con macro y micronutrientes esenciales, con un inoculo de la microalga
Chlorella Vulgaris, con distintas técnicas para realizar un estudio a la cinética química y biológica
del crecimiento de la biomasa de la micro alga. Las técnicas que se realizaron donde se observó el
crecimiento de la micro alga fueron densidad óptica, clorofila y conteo celular. Se analizaron siete
muestras de distintos días y una muestra de control (blanco). Las técnicas de clorofila y conteo
celular se realizaron por duplicado. Los resultados fueron estadísticamente positivos durante el
crecimiento de la microalga, con los métodos desarrollados en cada una de las técnicas.
Palabras clave: micro algas, Chlorella Vulgaris, crecimiento celular, cinética química, cinética
biológica, biomasa

Abstract.In this experimental practice a mineral culture medium was carried out in nine hundred
milliliters enriched with essential macro and micronutrients, with an inoculum of the Chlorella
Vulgaris microalgae, with different techniques to carry out a study of the biological and biological
chemistry of the biomass growth of the microalga. The techniques that were presented where the
growth of the microalga was recorded were optical density, chlorophyll and cell count. Seven
samples from different days and one control sample (blank) were analyzed. The chlorophyll and
cell count techniques were performed in duplicate. The results were statistically positive during the
growth of the microalgae, in the components and in all the techniques.
Key words: microalgae, Chlorella Vulgaris, cell growth, chemical kinetics, biological kinetics,
biomass

Introducción alternativa de energía renovable sustentable.

Desde hace 3500 millones de años se conoce
la existencia de las Microalgas o Micrófitos,
cuando evolucionaron de las Arqueobacterias
(los primeros organismos de la tierra),
volviéndose capaces de capturar la energía del
Sol a través de la fotosíntesis. (Ayala Islas &
Pérez Vázquez, 2017)
Las algas han sido utilizadas ampliamente en
procesos de biorremediación con el fin de
remover metales pesados y materia orgánica;
sin embargo, en la actualidad han alcanzado un
gran interés como fuente biológica para la
producción de biocombustible
(principalmente biodiesel), como una
(Fernández, 2012)
Dichas microalgas han sido aprovechadas a lo
largo de la historia de la humanidad, aunque su
biotecnología contemporánea inició en los
años 50, cuando científicos alemanes
comenzaron a cultivarlas en forma masiva
para obtener lípidos y polisacáridos,
reemplazando así a las proteínas animales y
vegetales para el consumo del ganado y del
hombre (Ayala Islas & Pérez Vázquez, 2017)
La ventaja del uso de microalgas para la
producción de biodiesel, es que presenta
mayor eficiencia fotosintética, son más
eficaces en la asimilación de CO2 y otros
nutrientes con respecto a las plantas, acumulan
1
entre 20 y 80% de triglicéridos, no requieren
tierras cultivables, demandan menor consumo
de agua renovable y pueden cultivarse en agua
salobre. La composición del medio de cultivo
y las condiciones de crecimiento de
microalgas tienen un efecto importante en el
rendimiento de biomasa y en el contenido de
lípidos. Se ha demostrado que la limitación de
nitrógeno y fósforo, incrementan el contenido
lipídico en microalgas. (Fernández, 2012)
Marco Teórico
El termino alga proviene del latín que significa
“planta acuática”, las algas con organismos
acuáticos autótrofos y contienen clorofilas,
unos pigmentos fotosintéticos que se asemejan
a los que contienen las plantas superiores; su
pared celular está compuesta de polisacáridos
o proteínas. A pesar de su simplicidad y la alta
distribución que estas tienen, son necesarios
algunos factores ecológicos limitantes, como
la radiación luminosa, la temperatura, la
disponibilidad de oxígeno y la concentración
de determinados nutrientes, para la
colonización y su desarrollo. (Ayala Islas &
Pérez Vázquez, 2017)
Las microalgas son organismos unicelulares
microscópicos (2-200 μm), polifiléticos, su
metabolismo puede ser autótrofo o heterótrofo
y suelen ser eucariontes, aunque las
cianobacterias procariontes son
frecuentemente incluidas como microalgas.
Chlorella Vulgaris, es un alga verde de forma
elipsoidal, la cual crece en forma de células
simples. Pertenece a la división Chlorophyta y
a la clase de las Chlorophyceae. (Fernández,
2012)
Cultivo de microalgas.
El cultivo de biomasa algal aparte de proveer
materia prima de biocombustibles, tiene un
impacto ambiental favorable al reducir la
concentración de gases de efecto invernadero,
debido a que utiliza grandes cantidades de CO2
durante su cultivo. Los cultivos de microalgas
más usualmente utilizados, se realizan en
medios sumergidos en agua, donde se
incorporan todos los macro y micronutrientes
necesarios (factores nutricionales) según sea el
medio conveniente a trabajar. Así mismo, en
los sistemas de producción de
microorganismos fotosintéticos cerrados
(fotobiorreactores) debe considerarse el diseño
completo del sistema, que puede incluir un
control sobre todas las variables que aceleran
o disminuyen la velocidad de reacción, como
lo son la temperatura y pH, tipo y duración de
iluminación, intervalos de agitación y la carga
inicial al sistema (factores ambientales).
La cuantificación de biomasa obtenida puede
medirse con técnicas de laboratorio
específicas, entre las más comunes se
encuentran: conteo celular utilizando una
cámara de neubauer, densidad óptica, clorofila
Conteo celular
Clorofila
La clorofila es el pigmento verde de las plantas
y desempeña un papel esencial en el proceso
de la fotosíntesis; se trata en realidad de una
mezcla de compuestos muy relacionados. La
estructura de la clorofila a, el pigmento más
abundante, es la siguiente:
Ilustración 1 Molécula de clorofila tipo a
Esta estructura presenta varias características
interesantes. Es un complejo de magnesio de
una dihidroporfirina. Contiene una cadena de
ácido propionico modificada en forma de B-
cetoester cíclico. Contiene también una cadena
de ácido propionico esterificada con un
alcohol diterpenico, el fitol, característica que
2
confiere liposolubilidad a la molécula. El
hemos más sorprendente, sin embargo, es la
íntima similitud estructural de la molécula de
clorofila con la de hemo, lo que sugiere que la
importancia de las porfirinas con esta
estructura general se remota a antes de la
separación evolutiva de los reinos animal y
vegetal. (granados & Melendez, 1984)
La presencia de clorofila en las hojas de las
plantas está estrechamente relacionada con las
condiciones nutrimentales de la planta, el
contenido de clorofila se incrementa
proporcionalmente a la cantidad de nitrógeno,
un importante nutriente presente en la hoja.
La determinación de clorofila es un método
indirecto para conocer el estado nutrimental de
las plantas, principalmente de N y Mg. Existen
diversos métodos que se usan
tradicionalmente para obtener estos valores.
Sin embargo, estos métodos implican la
colecta destructiva de material vegetal, así
como el uso de reactivos químicos y equipos
especializados, lo que los hace imprácticos y
costosos. ( Mora Aguilera Gustavo, 2016)
Densidad Óptica
Métodos turbidimétricos (ópticos).
Son métodos indirectos de medición de masa
celular. La base común de estos métodos
consiste en la medición de la cantidad de luz
dispersada o transmitida a través de un cultivo
de microorganismos. (Vasquez, 2011)
Las suspensiones celulares dispersan la luz, al
igual que cualquier partícula pequeña
suspendida en agua (efecto Tyndall). La
dispersión de la luz es, dentro de ciertos
límites, proporcional a la masa del cultivo.
(Vasquez, 2011)
Las fases de crecimiento de una población de
microorganismos se pueden determinarse
midiendo la turbidez del cultivo. Aunque
dicha turbidez no es una medida directa del
número de células, su incremento es una
indicación del crecimiento microbiano.
(Vasquez, 2011)
El cambio de luz se registra en el
espectrofotómetro como porcentaje de
transmisión (cantidad de luz transmitida) y
absorbancia o densidad óptica (D.O.), valor
derivado del porcentaje de transmisión,
correspondiente al log del cociente entre la
intensidad de luz incidente sobre la suspensión
(Io) y la de la luz transmitida por la suspensión
(Vasquez, 2011)
Los métodos de dispersión de la luz son las
técnicas más utilizadas para monitorear el
crecimiento de los cultivosmicrobianos. Son
muy útiles y poderosos pero pueden llevar a
resultados erróneos. (Vasquez, 2011)
 Ventajas
- Son métodos rápidos.
- La turbidimetría puede realizarse en
espectrofotómetros de radiación
visible o UV.
- La fuente de radiación más
frecuentemente usada es la lámpara de
wolframio, pero pueden utilizarse otras
fuentes de radiación visible.
 Desventajas
- Cuantificar microorganismos vivos y
muertos.
- Útil para densidades microbianas bajas
de microorganismos unicelulares y
tamaños de unos cuantos micrómetros.
- Para microorganismos más grandes y
productores de polisacáridos esta
metodología no es adecuada.
La turbidimetría es una técnica que se sustenta
básicamente en los fenómenos ópticos que
ocurren durante el paso de un haz de luz a
través de un medio. La implementación de
técnicas de medición cada vez más novedosas
ha permitido realizar mediciones de turbidez
que incluyen una buena linealidad y
estabilidad, un amplio intervalo de medición y
la posibilidad de medir la turbidez de la
muestra, incluso en presencia de
colorantes. (Acebo González & Hernández
García, 2013)
3
Las mediciones de la densidad óptica Del medio de cultivo se tomó la primera
proporcionan información útil para el control muestra de referencia (t0), “blanco”, que se
del cultivo alimentado en el fermentador, por utilizó posteriormente para las técnicas
lo que resulta ideal realizar estas mediciones
realizadas.
directamente (on-line) en el proceso y así,
obtener valores en tiempo real. (Acebo
González & Hernández García, 2013)

El sistema optoelectrónico para determinar la

densidad óptica consta de un diodo láser y un
fotodiodo. (Acebo González & Hernández
García, 2013)

Material y métodos

Equipo utilizado. Espectrofotómetro UV-

VIS, Centrifuga, Microscopio óptico,
Cámara neubauer, Placa de calentamiento, Ilustración 5. Medio de cultivo sin inoculo
Balanza analítica

Material. Tubos de centrifuga, Baño maría,

Termómetro de mercurio, Espátula, Matraz
Erlenmeyer

Tabla 1. Medio de cultivo (Zarrouk)

cantidades de macronutrientes y
micronutrientes en 900 ml.

Reactivos Reactivos Reactivos

(g) para 1 L (g) para 900
ml
NaHCO3 4 3.6
Ilustración 6. Toma de inoculo de 85 ml al
K2HPO4 0.5 0.45 medio de cultivo.
NaNO3 2.5 2.25
K2SO4 1 0.9
NaCl 1.2 1.08
NgSO4 0.2 0.18
CaCl2 0.04 0.036
FSO4 0.04 0.036
DTA 0.08 0.072
Sol. A.5 1 ml 0.9 ml

4

Ilustración 7. Medio de cultivo con inoculo.
Factores ambientales.
Una vez realizado el medio mineral, se
introdujo el inóculo (microalgas Chlorella
Vulgaris), donde las condiciones ambientales
fueron:
 Temperatura ambiente (21°C)
 Luz: fuente de iluminación constante.
 Agitación: 1 vez al día
 Sin bomba de aire al medio
Teniendo lo anterior, se tomaron muestras del
sistema de manera continua (cada 7 días),
obteniendo un total de siete muestras t1, t2, t3,
t4, t5, t6 y t7.
Conteo celular
Se tomó aproximadamente 0.1 ml de muestra
con la pipeta pasteur, que se difundió sobre los
puentes externos de la cámara de neubauer y
se colocó el portaobjetos deslizándolo
horizontalmente sobre la cámara.
Posteriormente se colocó la cámara de manera
correcta sobre la bandeja del microscopio y se
enfocó hasta conseguir una visión nítida, una
vez obtenida se realizó el conteo celular de
cada cuadrante de la cámara, anotando cada
dato para obtener un recuento total por cada
muestra.
Se repitió el mismo procedimiento con cada
una de las muestras y finalmente se realizaron
los cálculos para obtener un valor equivalente
de números de células totales por ml de
suspensión.
Clorofila
Se tomó 5 ml de cada una de las muestras.
Después de que se tomó cada muestra por
duplicado se llevó a la centrifugadora por 30
min a 3500 rpm.
Pasando los 30 min se decanta cada muestra
asegurándonos de que se quede el paquete
celular. Ya obtenido el paquete celular, se le
agregaran 5 ml de metanol al 90% a cada tubo.
Calentando durante 10 min en baño maría a
una temperatura próxima de 70°C.
Se dejó reposar y posteriormente se vuelve a
centrifugar. Se tomó la lectura en el
espectrofotómetro a 665nm.
Densidad Óptica
A partir de muestras obtenidas de nuestro
medio de crecimiento, se obtuvo la densidad
óptica de las muestras leyendo a 550 nm. Las
lecturas no deben ser mayores a 1 de
absorbancia
El blanco es el medio de cultivo fresco
utilizado, sin la microalga. Donde se registró
la primera lectura para la densidad óptica. Se
tomaron distintas muestras por 7 días para
observar el crecimiento de la microalga.
Resultados y discusión
Conteo celular
Realizando el recuento celular, se obtienen los
siguientes resultados para cada una de las
muestras:
Tabla 2. Resultados obtenidos mediante
recuento celular al microscopio.
Muestra R
T1 18
T2 61
5
 T3 159
T4 205
T5 335
T6 473
T7 625

Ilustración 9. Observaciones obtenidas de la

cámara de neubauer para conteo celular.

Clorofila

Realizando la metodología ya mencionada, se

muestra a continuación las lecturas en el
espectrofotómetro a 665nm.
Ilustración 2. Conteo celular al microscopio.
Tabla 3. Lecturas de clorofila en el
De la tabla 1 se obtiene el número de células espectrofotómetro
totales por ml de suspensión de cada muestra: Muestra Tiempo (dias) ABS (nm)

nº=R x 10000 T1 2 0.026

T2 6 0.036
nº t1 = 18 x 10000 = 180000 células/ml
T3 8 0.045
nº t2= 61 x 10000 = 610000 células/ml
nº t3=159 x 10000 = 1590000 células/ml T4 11 0.046
nº t4=205 x 10000 = 2050000 células/ml T5 19 0.062
nº t5=335 x 10000 = 3350000 células/ml
nº t6=473 x 10000 = 4730000 células/ml T6 28 0.066
nº t7=625 x 10000 = 6250000 células/ml T7 34 0.074

De lo anterior, se puede apreciar de manera

evidente el incremento de células que hubo en
el sistema, de modo que resulta clara la
existencia de una cinética de crecimiento y de Clorofila
metabolito, por lo que se puede suponer un 0.08
consumo de sustrato.
0.06
ABS(nm)

Evidencias de observación. 0.04

0.02
0
0 10 20 30 40
Tiempo (dias)

Grafico 1. Este grafico nos muestra el aumento

del pigmento clorofila tipo A en micro algas.

6
 Tabla 5. Por ciento de Transmitancia.
Clorofila(Duplicado) Tiempo Absorbancia %T
0.12 (días) (nm)
0.1 0 0 100
(Blanco)
ABS8nm)

0.08
0.06 2 0.012 97
0.04 6 0.012 97
0.02
0
8 0.032 92
0 10 20 30 40 11 0.087 81
Tiempo(dias) 19 0.103 78
28 0.116 76
Grafico 2.Pigmento clorofila tipo A en micro 34 0.135 73
algas, Duplicado.

Tabla 3.Lecturas de clorofila, duplicado. Recordando que cuando se usa la

transmitancia (T = % de la luz incidente
Muestra recibida por el fotodetector), es necesario
(duplicado) Tiempo(dias) ABS (nm) utilizar la transformación: DO = 100 – T
T1 2 0.029
T2 6 0.036 Tabla 6. Cálculo de Densidad Óptica.
T3 8 0.044 Tiempo Absorbancia %T D.O
T4 11 0.061 (días) (nm)
T5 19 0.072 0 (Blanco) 0 100 0
T6 28 0.094
T7 34 0.102 2 0.012 97 3

6 0.012 97 3

Densidad Óptica 8 0.032 92 8

Longitud de onda: 550 nm
11 0.087 81 19
Tabla 4. Lecturas de absorbancia para
densidad óptica. 19 0.103 78 22
Tiempo (días) Absorbancia (nm)
0 (Blanco) 0 28 0.116 76 24
2 0.012
6 0.012 34 0.135 73 27
8 0.032
11 0.087
19 0.103
28 0.116
34 0.135

%T= 10ˆ (2-A)

7
 crecimiento de la microalga en forma
Curva de crecimiento ascendente se comprobó de forma cinética
el crecimiento de la microalga.
0.16
0.14
Conclusiones
Absorbancia (nm)

0.12
Se logró amplificar el número de células de
0.1
microalgas presentes en el sistema, se
0.08 realizaron técnicas de conteo celular y con ello
0.06 se comprobó dicho aumento, de modo que se
0.04 puede observar de manera subjetiva la
0.02 existencia de una cinética en crecimiento de
0 metabolito, y con ello, un consumo de sustrato.
0 2 6 8 11 19 28 34
En la técnica de clorofila, se extrajeron de
Tiempo (dias)
forma correcta los pigmentos siguiendo
correspondientemente la metodología de
referencia y al finalizar el análisis de los
Grafica 3. Con los datos de densidad óptica se
resultados, observamos que nuestras muestras
obtiene la curva de crecimiento de la micro
fueron más claras que las de otros equipos
alga graficando los valores de absorbancia en
debía a que no se le colocó una bomba a
el eje de las “Y, con el tiempo en el eje de las
nuestro medio, el cual ayudo a este a que la
“X”,
micro alga creciera correctamente, nuestras
lecturas son muy bajas y no se nota mucho el
aumento del pigmento.

Curva de crecimiento Con la técnica de densidad óptica en la gráfica

se observó que el crecimiento de la microalga,
30 del día 0 al día 6, se obtuvo la fase de
25 adaptación, del día 6 al día 34, la fase
20 exponencial de la microalga. Debido a que no
D.O

15 se mantuvo en agitación constante se observó

10 un crecimiento lento del día 9 al 34 sin la
5 obtención de la fase estacionaria.
0 Se realizaron todas las técnicas propuestas
0 2 6 8 11 19 28 34 obteniendo los resultados de forma positiva,
Tiempo (dias) observando así el crecimiento de la microalga.

Grafica 4. Con los datos de densidad óptica se Referencias

obtiene la curva de crecimiento de la micro
alga graficando los valores de densidad óptica
en el eje de las “Y, con el tiempo en el eje de
las “X”,
Se comparó la relación que se tiene al
graficar la absorbancia contra el tiempo
(días) y la densidad óptica contra el tiempo
(días), se observó que se tiene el mismo
comportamiento de paso de luz del
1.Acebo González , D., & Hernández García,
A. T. (2013). Los métodos
Turbidimétricos y sus aplicaciones en
las ciencias de la vida. Revista CENIC
Ciencias Biológicas, 1-18.
2.Ayala Islas, A., & Pérez Vázquez, C. G.
(2017). Aislamiento, identificación y
curva de crecimiento de la microalga

8
 scenedesmus obliquus con fines
biotecnológicos. Jovenes en la
ciencia, 144-148.

3.Granados, R., & Melendez, E. y. (1984).

Quimica Organica. Barcelona:
Editorial Reverte.

4.Mora Aguilera,D.(2016). Protocolo para la

determinacion de unidades clorofila
en plantas de agave tequilana weber

5. Vasquez, I. (2011). Densidad optica

(Absorbancia) y Turbidimetria para
cuantificaciòn de biomasa. Ecuador:
Universidad Central de Ecuador.
Las siguientes ilustraciones evidencian la
metodología llevada a cabo de densidad óptica
por 550 nm

Anexos

Crecimiento de la microalga

Las siguientes ilustraciones evidencian la

metodología llevada a cabo para conteo celular
por la cámara de neubauer

Observación directa del microscopio con el

objetivo 10X de la microalga

9
Las siguientes ilustraciones evidencian la
metodología llevada a cabo para clorofila.

10