Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas

Departamento de Bioquímica

“Dr. Guillermo Carvajal Sandoval”

Laboratorio de Métodos de Análisis

Práctica: Determinación de la actividad de enzimas proteolíticas. Método de Kunitz.

Profesor(a): QFI. Francisco C. Fernández López

Grupo: 4IM2

Sección: 2

Alumno: Salinas Bailón Víctor Manuel

Fecha de entrega: 6 de Noviembre de 2017

Calificación:
Fundamento.
Las enzimas son estructuras proteicas capaces de catalizar reacciones biológicas
para generar así procesos metabólicos. Una clase de enzima que provoca la
degradación de otras proteínas por hidrólisis de sus enlaces peptídicos son las
proteasas, también denominadas peptidasas o enzimas proteolíticas.
El método de Kunitz, es una prueba en la cuantificación de la actividad de las
enzimas proteolíticas la cual tiene por el uso de una curva de calibración de una
proteasa patrón para así construir una curva de actividad enzimática medida en UT
(unidades trípticas), las cuales se definen como la cantidad de enzima proteolítica
necesaria para aumentar una unidad de absorbancia por minuto de digestión.

Objetivos.
El alumno:
a) Elaborará una curva estándar de actividad enzimática.
b) Determinará la actividad proteolítica de la bromelaína, la papaína y otras
proteasas.
Resultados.

𝐴280
Concentración de 𝐴280 corregida
Tubo
Tripsina (mg/ml)
Problema Testigo
T1 y 1 0.04 0.509 0.135 0.374
T2 y 2 0.08 0.696 0.223 0.473
T3 y 3 0.12 0.91 0.16 0.75
T4 y 4 0.16 0.879 0.136 0.743
T5 y 5 0.2 0.926 0.986 -0.06
Problemas
TI y I Bromelaína 1:10 0.987 0.167 0.82
TII y II Bromelaína 1:20 0.714 0.165 0.549
TIII y III Actidinina 1:2 1.463 0.713 0.75
TIV y IV Actidinina 1:4 0.906 0.397 0.509
Tabla I. Actividad enzimática de la tripsina.

Actividad enzimática de la tripsina

0.8
0.7 y = -1.495x + 0.6354
0.6 R² = 0.0809

0.5
Absorbancia

0.4 Curva de actividad de

0.3 tripsina
0.2 Linear (Curva de actividad
0.1 de tripsina)

0
-0.1 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25

-0.2
Concentración (mg/ml)

Gráfica I. AET sin eliminación de puntos.

 Actividad enzimática de la tripsina
0.9 y = 3.46x + 0.239
0.8 R² = 0.8766

0.7
0.6
Absorbancia

0.5
Curva de actividad de
0.4 tripsina
0.3 Linear (Curva de actividad
0.2 de tripsina)
0.1
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2
Concentración (mg/ml)

Gráfica II. AET con eliminación de puntos.

1.1 Ecuación de la curva de calibración (sin despreciar puntos):

𝑚𝑙
𝐴 = −1.495 𝐶 + 0.6354
𝑚𝑔
𝑟 = 0.2844
1.2 Ecuación de la curva de calibración (tras despreciar puntos):
𝑚𝑙
𝐴 = 3.46 𝐶 + 0.239
𝑚𝑔
𝑟 = 0.9362

2. Cálculo de unidades trípticas (𝑈𝑇) 𝑐𝑎𝑠

𝑚𝑔

𝑚𝑙
𝑐𝑎𝑠 𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑐𝑢𝑟𝑣𝑎 𝑑𝑒 𝑐𝑎𝑙𝑖𝑏𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 3.46
𝑚𝑔
(𝑈𝑇) = = = 0.173 𝑈𝑇
𝑚𝑔 20 𝑚𝑖𝑛 20 𝑚𝑖𝑛

3. Curva de actividad enzimática específica

0.173 𝑈𝑇 0. 04 𝑚𝑔
| | = 0.00692 𝑈𝑇
1 𝑚𝑔 1
 Tubo Unidades trípticas corregida

1 0.00692 0.374
2 0.01384 0.473
3 0.02076 0.75
4 0.02768 0.743
5 0.0346 -0.06
Tabla II. Curva de actividad enzimática específica para la digestión de caseína por
tripsina.

Curva de actividad enzimática específica

y = 20x + 0.239
0.9
R² = 0.8766
0.8
0.7
0.6
Absorbancia

0.5
Curva de actividad
0.4 específica
0.3 Linear (Curva de
0.2 actividad específica)
0.1
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03
Unidades trípticas

Gráfica II. Curva de actividad específica

Ecuación empírica
𝐴 = 20 𝑈𝑇 + 0.239
Despejando 𝑈𝑇:
𝐴 − 0.239
𝑈𝑇 =
20
Unidades trípticas de bromelaína:
25 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 1𝑚𝑙 1
𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 1: 10 = | | = 0.1388 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎
18 𝑚𝑙 1 10
25 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 1𝑚𝑙 1
𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 1: 20 = | | = 0.0694 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎
18 𝑚𝑙 1 20
𝐴280 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑎í𝑛𝑎 1: 10 = 0.82

0.82 − 0.239
𝑈𝑇 = = 0.02905 𝑈𝑇 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑎í𝑛𝑎
20
Por gramo de piña:
0.02905 𝑈𝑇 1 𝑔
| | = 0.2092 𝑈𝑇 𝑝𝑖ñ𝑎
0.1388 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 1

𝐴280 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑎í𝑛𝑎 1: 20 = 0.549

0.549 − 0.239
𝑈𝑇 = = 0.0155 𝑈𝑇 𝑏𝑟𝑜𝑚𝑒𝑙𝑎í𝑛𝑎
20
Por gramo de piña:
0.0155 𝑈𝑇 1 𝑔
| | = 0.22233 𝑈𝑇 𝑝𝑖ñ𝑎
0.0694 𝑔 𝑝𝑖ñ𝑎 1
̅̅̅̅ 𝑝𝑖ñ𝑎 = 0.2126
𝑈𝑇
Unidades trípticas de actinidina:
25 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 1𝑚𝑙 1
𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 1: 2 = | | = 0.6944 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖
18 𝑚𝑙 1 2
25 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 1𝑚𝑙 1
𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 𝑒𝑛 𝑑𝑖𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 1: 4 = | | = 0.3472 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖
18 𝑚𝑙 1 4

𝐴280 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 1: 2 = 0.82

0.75 − 0.239
𝑈𝑇 = = 0.02555 𝑈𝑇 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎
20
Por gramo de kiwi:
0.02555 𝑈𝑇 1 𝑔
| | = 0.03679 𝑈𝑇 𝑘𝑖𝑤𝑖
0.6944 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 1

𝐴280 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑒𝑔𝑖𝑑𝑎 𝑑𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎 1: 4 = 0.549

0.509 − 0.239
𝑈𝑇 = = 0.0135 𝑈𝑇 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑛𝑖𝑑𝑖𝑛𝑎
20

Por gramo de kiwi:

0.0135 𝑈𝑇 1 𝑔
| | = 0.03888 𝑈𝑇 𝑘𝑖𝑤𝑖
0.3472 𝑔 𝑘𝑖𝑤𝑖 1
̅̅̅̅ 𝑘𝑖𝑤𝑖 = 0.03783
𝑈𝑇
Discusión.
Las principales consideraciones tomadas en cuenta para el análisis del método son
las siguientes. El uso de los tubos testigo se debe a las correcciones de absorbancia
que deban hacerse por efecto de la presencia de sustancias no deseables y que
puedan absorber a la misma longitud de onda de 280 nm, estas pueden interferir
antes y después de llevada a cabo la hidrólisis por efecto de la caseína.
Otra consideración que debió realizarse para la cuantificación de la actividad de la
caseína es que a los tubos problema tras adicionarse la caseína se debe parar la
reacción enzimática con ayuda del TCA. A los tubos testigo se les adicionó primero
TCA, y para hacer las consideraciones de corrección por interferencias se le
adicionó después la caseína.
A partir de los resultados obtenidos en el desarrollo de la práctica, específicamente
en la gráfica I. se muestra que el último punto correspondiente al problema- testigo
5 y su correspondiente ajuste de absorbancia, se aprecia que este mantiene una
gran dispersión frente a la tendencia lineal, por lo que no fue considerado para
𝑚𝑙
obtener la ecuación de calibración, y por tanto un valor de pendiente de 3.46 𝑚𝑔.

Por definición, las unidades trípticas son la cantidad de enzima proteolítica

necesaria para aumentar una unidad de absorbancia por minuto de digestión. Tras
realizar los cálculos correspondientes y tras haber hecho un promedio de las
unidades trípticas específicas de la piña y del kiwi, se obtuvieron los valores de
0.2126 y 0.03783 respectivamente y 0.173 para la caseína, lo que quiere decir que
de todas las proteasas el orden en cuanto al requerimiento de enzima para hidrolizar
1g de proteína es como sigue: caseína, actinidina, bromelaína.

Conclusiones.
La actidinina que se encuentra en el kiwi es más activa que la bromelaína que se
encuentra en la piña.

Bibliografía.
Anexo.
a) Defina actividad enzimática y actividad específica:
Actividad enzimática: Capacidad de la enzima para inducir una reacción química
determinada.
Actividad específica: Es la relación entre la actividad enzimática y la cantidad de
proteína.
b) Escriba la clasificación de las proteasas, en función de su mecanismo de
acción y diga e qué grupo se ubican las determinadas e la práctica:
Serina Tienen la característica común Tripsina
proteasas de ser inhibidas por el
diisopropilfosforofluoridato
(DFP) el cual reacciona con el
grupo hidroxilo de un residuo
serilo específico en el sitio
activo de la enzima.

Sulfhidrilo Hidroliza los enlaces peptídicos Bromelaína

proteasas de proteínas y su inhibición se Papaína
da por reactivos con grupo Actinidina
sulfhidrilo.
Metal Son inhibidas por un agente
proteasas metal-quelante.
Acido Son aquellas con un pH óptimo
proteasas muy acido, en un rango de 2 a 4,
causando que los grupos ácidos
no participen en el sitio activo.

c) ¿Para qué se adiciona cisteína en las muestras de piña, y kiwi?

El mecanismo de reacción que realiza la enzima para hidrolizar el enlace peptídico
requiere de un residuo de cisteína. El mecanismo de reacción consiste en realizar
un ataque nucleofílico al grupo carbonilo del péptido correspondiente, el nucleófilo
en cuestión lo establece el residuo de cisteína con ayuda de un residuo de histidina
del sitio activo, el cual facilita la recepción del protón que cede la cisteína, tal como
se observa a continuación.

¿Cuál es la especificidad de enlace de la tripsina?

Tripsina: lisina y arginina; bromelaína y papaína: serina, cisteína y treonina.