Resume Biotek

Surface Adsortion atau Adsorpsi pada permukaan

Permukaan antibodi dapat dengan mudah menyerab berbagai
permukaan.Adsorpsi permukaan dpat menurunkan secara significat konsentarsi
antibodi dalam larutan . sebagai contohnya monoklonal IgG1 tikus telah teabsorbsi
pada permukaan gelas goyang,yang menyebabkan hilang nya protein pada media
kultur tanaman. Untuk meminimalisirnya dengan cra melapisis permukaan gelas
goyang dengan atau alat alain dengan penambahan Pluronic F127

Ketidakstabilan kimiawi
Berbagai jalur degradai kimika telah teramati. Degradai ini dapat menurunkan
atau tidak menurunkan aktivitas dari protein tergantung dari lokasinya. Sebagai
contoh, deamidasi antibodi monoklonal, OKT3 (IgG2a) yang diukur dengan
perubahan pola IEF tidak berkorelasi dengan hilangnya potensi pengikatan antigen
(90% deamidasi aktivitas Asn386 vs 80% dalam uji potensi). Jalur degradai kimia
yang paling utama meliputi cross-linking, damidasi,isomerasi,oksidasi dan
fragmentasi.

Pembentukan atau perubahan ikatan Disulfida

Jalur paling umum yang menyebabkan pembentukaan atau perubahan ikatan
disulfida adalah melalui cross-linking pathways yang mengarah pada agregrasi kimia.
Jalur degradasi ini mudah terajdi selama proses pengolahan. Sebagai contoh,
liofilisasi antibodi monoklonal murine (IgG2a) tanpa aditif mengurangi jumlah rata-
rata gugus SH per molekul dari 6,65 menjadi 6,28, menunjukkan pembentukan
disulfida. Karena ion tiolat sering menjadi spesies yang memprakarsai degradasi
kimia ini, meningkatkan pH formulasi biasanya menyebabkan peningkatan
pembentukan disulfida. Ini adalah kasus untuk antifebrin T2G1s Fab0 (IgG1 (k)),
yang mengandung kelompok SH bebas, dimana persentase dimer meningkat dengan
meningkatkan pH dari 5,8 menjadi 9,5,61. Ion tiolat adalah spesies yang
memprakarsai pembentukan disulfida, meningkatkan pH formulasi biasanya
menyebabkan peningkatan pembentukan disulfida.
Penyimpanan dapat menyebabkan agregasi disulfida. Penyimpanan formulasi
eksipien lipofisasai bebas antibodi (IgG1,terdiri dari 12 intra dan 4 intercahain
disulfida) selama 1 tahun pada suhu 30 derajat menyebabkan terbentuknya dimer dan
trimer. Demikian pula, agregat yang tidak bisa diubah dari antibodi monoklonal (tipe
tidak ditentukan) dapat dideteksi dengan SDS-PAGE setelah penyimpanan formulasi
terliofiliasasi pada suhu 50 derajat celsius salam 6 bulan. Ikatan kovalen disulfida
dimer maupun trimer juga teramati pada antibodi IgE yang dikeringkan dengan spray.
Cross-Linking yang tidak bisa diubah
 Keterkaitan silang (cross-linking) yang tidak bisa diperbarui telah teramati
dalam beberapa penelitian. Inkubasi antibodi monoklonal manusia C23 dalam larutan
pada pH basa di suhu 37 derajat celsius selama 14 hari mengahsilkan pita ynga tidak
dapat direduksi di atas light chain pada pH 4 dan 10. Meskipun sifat kimia pastinya
belum dapat ditentukan,langkah oksidatif dilibatkan sebagai upaya penghambatan
oksidasi yang tertunda dari pembentukan spesies ini. Sebuah studi baru-baru ini
menunjukkan bahwa ikatan thioether yang tidak dapat diperbarui dapat terbentuk
antara C223 dari weightchain dan residu C-terminal sistein dari light chain pada
antibodi IgG1 humanized. Produk cross-linked ini memiliki berat molekul 75 kDa
pada pengujian dengan MS namun menunjukkan berat molekul 92 kDa dengan SDS-
PAGE.
Cross linked yang tidak dapat dirubah juga ditemukan pada bentuk sediaan
padat,sebagai contohnya Inkubasi antibodi monoklonal tikus [IgG2a (k)] tanpa
lyoprotectant atau dengan adanya 5% sukrosa, dekstran, atau hidroksipropil-beta-
siklodekstrin (HP-b-CD) pada suhu penyimpanan 56 derajat C selama 18 hari
menyebabkan pembentukan pta berukuran 100kDa yang teramati pada SDS-PAGE.
Deamidasi : Deamidasi meerupakan salah satu jalur degradai protein.Protein yang
dimurnikan mungkin mengandung bentuk bentuk deamida. Sebagai
contohnya,beberapa bentuk deamida pada Mab humanized HER2 (rhuMAb HER2,
Herceptin, trastuzuMAb) ditemukan melalui kromatogarfi pertukaran ion, termasuk
deamidasi Asn30 (menjadi aspartate) pada salah satu light chain, 2.deamidasi Asn30
(menjadi aspartat) pada kedua light chain dan deamida Asn55 oada heavy
chain(menjadi aspartate). Satu-satunya konversi Asn30 menjadi aspartate (tidak
isoaspartate) menunjukkan bahwa mekanisme deamidasi dalam kultur sel mungkin
berbeda dari itu selama penyimpanan. mekanisme deamidasi pada kultur sel
mungkin berbeda dari hal tersebut selama penyimpanan.
Penyimpanan dapat menghasilkan produk deamidasi. Deamidasi juga dapat
terjadi dalam keadaan padat. Deamidasi pada protein banyak terjadi melalui
suksinimida intermediet pada Asn dan Gln.tingkat deamidasi melalui succinimidasi
dalam protein dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor seperti pH,sekuens dan efek
sterik. Dengan menggunakan peptida berukuran kecil sebagai model, Tyler-Cross dan
Schirch79 menemukan bahwa deaminasiasi residu Asn bergantung pada residu asam
amino pada sisi karboksil Asndalam larutan basa atau netral. Menaikkan ukuran dan
percabangan dari asam amino dapat menurunkan tingkat deaminasi namun dalam
suasan asam asam amino ini akan kehilangana efek perlindungannya.
Isomerisasi
Isomerisasi antibodi yang umum adalah pembentukan asam iso-aspartat yang
dihasilkan melalui isomerisasi secara langsung maupun dari hidrolisis melalui
intermediate suksinimida. Pembentukan intermediate suksinimida yang bergantung
pada pH dapt terjadi baik dari deamidasi Asn mauapun dehidrasi Asp. Pada kondisi
netral dan basa terbentuk prosuk Asp dan isoAsp dalam peptida dengan
perbandingan yang sama.
Isomerisasi juga lazim dan sulit dikendalikan. Sekali lagi, banyak protein
yang dimurnikan mengandung sejumlah besar produk yang diisomerisasi, baik dari
deamidasi atau isomerisasi secara langsung. Karena pembentukan intermediate
suksinimida tidak memerlukan adanya air, sehinggan dapat dengan mudah terjadi
dalam keadaan padat. Isomerisasi Asp adalah salah satu jalur degradasi utama untuk
MAb terliofilisasi yang dapat meningkat dengan meningkay=tnya suhu penyimpanan
keduanya dia atas atau dibawah nilai Tg mereka.
Isomerasi dapat sangat dipengaruhi oleh efek sterik. Sebagai contoh, antibodi
anti-IgE monoklonal rekombinan (E25) mengandung dua urutan Asp-Gly dalam
CDR-nya, namun hanya satu lokasi yang ditemukan labil terhadap isomerisasi (Asp
L32). Ketidakaktifan satu residu Asp dimungkinkan karena terbentuknya ikatan
hidrogen.