Teknik Biologi Molekuler

Diperiksa secara langsung, dan probe hibridisasi tidak akan mudah menembus gel.
Sesudah blotting, RNA harus bergerak pada membran (langkah 5), baik dengan pembakaran
pada oven atau dengan paparan sinar UV. Hal ini menyebabkan hubungan kovalen RNA pada
membran, yang mencegah asam nukleat hanyut selama pengolahan selanjutnya. Probe
hibridisasi harus disiapkan (langkah 6), dan probe hibridisasi dengan membran (langkah 7).
Hal ini diikuti dengan pencucian dengan keras post-hibridisasi, yang memastikan bahwa
probe terikat secara spesifik untuk menuju target mRNA dan mengabaikan ikatan non-
spesifik untuk mRNA lain atau membran nilon sendiri. Sinyal hibridisasi kemudian
terdeteksi, biasanya dengan film dan diukur oleh densitometri (langkah 8).
Pilihan harus dibuat dalam pemilihan probe hibridisasi dan sifat deteksi sinyal, dan ini
dianggap secara rinci pada bagian berikutnya.
Probe Hibridisasi
Hibridisasi asam nukleat mengharuskan probe melengkapi semua, atau sebagian, dari
urutan mRNA yang penting. Hal ini tergantung pada pemasangan basis yang tepat antara C
(Sitosin) dan G (guanin), dan antara A (adenin) dan T (timin). Secara umum, ukuran
minimum pada probe untuk memastikan spesifisitas adalah sekitar dua puluh lima basis,
asalkan terdapat kecocokan lengkap antara urutan probe dan urutan mRNA sasaran; hal ini
dapat diatur, namun dengan kondisi yang tepat. Dengan probe sekitar tiga puluh basis dalam
panjang, probabilitas yang mana urutannya sama yang terjadi pada genom mamalia secara
kebetulan adalah dari urutan 1 dalam 1 miliar (lihat Sambrook et al. 1989).
Ada dua bentuk utama dari probe hibridisasi, pendekatan seperti biasanya
menggunakan DNA komplementer (cDNA). Sebagai kemungkinan lain, oligonukleotida anti-
sense (umumnya tiga puluh empat puluh basis panjang) dapat dirancang dari urutan data dan
disintesis. Oligonukleotida menawarkan beberapa keuntungan dalam hal kesederhanaan
(misalnya meniadakan kebutuhan untuk isolasi plasmid), dan mengurangi waktu hibridisasi.
Meskipun secara luas digunakan dalam penelitian hibridisasi in situ, oligonukleotida anti-
sense belum luas digunakan dalam aplikasi Blotting Northern. Oligonukleotida seperti
cDNA, adalah molekul DNA, tetapi 'riboprobes' dasar dari RNA juga dapat digunakan.
Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas dibandingkan dengan probe DNA, tetapi mereka
kurang stabil dalam arti menjadi subjek yang mengalami kerusakan oleh RNA-RNA (lihat
hal. 586).
Deteksi dicapai baik melalui penggunaan strategi radioaktivitas atau dengan non-
radioaktif. Kebanyakan laboratorium terus menggunakan radioaktivitas, probe dilabeli
dengan 32P (atau 33P). Ada beberapa keuntungan menggunakan probe berlabel radioaktif;
prosedur yang stabil dan kuat, dan ada tingkat yang tinggi dalam sensitivitas. Meskipun
begitu, pertumbuhan yang penting pada protokol non-radioaktif, yang mencerminkan
kerugian dari radioisotop (lihat Kricka, 1992; Selama 1993). kerugian ini termasuk
keamanan, ketidakstabilan probe (mencerminkan paruh pendek dari isotop yang digunakan),
dan meningkatnya kesulitan dengan pembuangan limbah. Celupan warna dapat digunakan
dalam deteksi non-radioaktif, meskipun ini umumnya memiliki sensitivitas rendah. Saat ini,
Pendekatan non-radioaktif utama didasarkan pada chemiluminescence, dan hal ini populer.
Deteksi mungkin juga didasarkan pada fluoresensi, tapi ini memerlukan substansial investasi
dalam instrumentasi berdedikasi.
Dalam kasus deteksi chemiluminescent, pemecahan chemilumi tertentu