SPEKTROFOTOMETRI

I. TUJUAN
- Menjelaskan dan menggunakan spektrometer ultraviolet-sinar tampak
- Menganalisa sampel dengan menggunakan spektrometer ultraviolet-sinar tampak

II. PERINCIAN KERJA

- Membuat larutan standar
- Menentukan panjang gelombang serapan maksimum (spektrum absorbans)
- Membuat kurva kalibrasi
- Menganalisa sampel

III. ALAT DAN BAHAN

Alat yang digunakan:
- Spektrofotometer
- Labu takar 50 ml
- Pipet ukur 5 ml, 25 ml
- Pipet tetes
- Gelas kimia 1000 ml, 400 ml, dan 100 ml
- Sarung tangan
- Bulb
- Labu semprot

Bahan yang digunakan:

- Aquadest
- CuSO4.5H2O
- H2SO4 pekat
- NH3 pekat
- Tissue
IV. DASAR TEORI

Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada pengukuran

serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang gelombang yang

spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum

phototube atau tabung foton hampa. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan

atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran

menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan

spektrofotometri (Basset, 1994).

Spektrofotometri menyiratkan pengukuran jauhnya penyerapan energi cahaya oleh

suatu sistem kimia itu sebagai suatu fungsi dari panjang gelombang radiasi, demikian pula

pengukuran penyerapan yang menyendiri pada suatu panjang gelombang tertentu (Underwood,

1990).

Spektrofotometri ini hanya terjadi bila terjadi perpindahan elektron dari tingkat energi yang

rendah ke tingkat energi yang lebih tinggi. Perpindahan elektron tidak diikuti oleh perubahan

arah spin, hal ini dikenal dengan sebutan tereksitasi singlet (Khopkar, 2002).

Spektrometri UV-Vis adalah salah satu metoda analisis yang berdasarkan pada

penurunan intensitas cahaya yang diserap oleh suatu media. Berdasarkan penurunan intensitas

cahaya yang diserap oleh suatu media tergantung pada tebal tipisnya media dan konsentrasi

warna spesies yang ada pada media tersebut. Spektrometri visible umumnya disebut kalori,

oleh karena itu pembentukan warna pada metoda ini sangat menentukan ketelitian hasil yang

diperoleh. Pembentukan warna dilakukan dengan cara penambahan pengompleks yang selektif

terhadap unsur yang ditentukan.

Spektrometer menghasilkan sinar dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu

dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi.

Kelebihan spectrometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar putih
dapat lebih terseleksi dan ini ndiperoleh dengan alat pengurai seperti prisma, grating, atau celah

optis. Pada fotometer filter berbagai filter dari berbagai warna yang mempunyai spesifikasi

melewatkan trayek panjang gelombang tertentu. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh

panjang gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek panjang

gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, pnjang gelombang yang benar-benar

terseleksi dapatdiperoleh dengan bantuan alat pengurai cahaya seperti prisma. Suatu

spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel

pengabsorbsi untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan

absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. Pengertian spektrofotometri lebih

spesifik atau pengertiannya lebih sempit karena ditunjukan pada interaksi antara materi dengan

cahaya (baik yang dilihat maupun tidak terlihat), sedangkan pengertian spektroskopi lebih luas

misalnya cahaya maupun medan magnet termasuk gelombang elektromagnetik ( Eka, 2007 ).

Spektrometri molekular (baik kualitatif dan kuantitatif) bisa dilaksanakan di daerah

sinar tampak, sama halnya seperti di daerah yang sinar ultraviolet dan daerah sinar inframerah.

Spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi

yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada

berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum

tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda (Martalius, 2005 ).

Prinsip penentuan spektrofotometer UV-Vis adalah aplikasi dari Hukum Lambert-Beer,

yaitu:

A = – log T = – log It / I0 = ε . b . C

Dimana:

A = Absorbansi dari sampel yang akan diukur

T = Transmitansi

I0 = Intensitas sinar masuk

It = Intensitas sinar yang diteruskan

ε = Serapan molar

b = Tebal kuvet yang digunakan

C = Konsentrasi dari sampel(Sanny,2010).

Spektrofotometer dibagi menjadi dua jenis, yaitu single-beam dan double-beam. Pada

spektrofotometer single-beam, cahaya hanya melewati satu arah sehingga nilai yang diperoleh

hanya nilai absorbansi dari larutan yang dimasukkan. Sedangkan spektrofotometer double-

beam, nilai blanko dapat diukur bersamaan dengan larutan yang diinginkan dalam satu kali

proses yang sama (Tin Yunis, 2010).

Kegunaan spektrofotometer UV/VIS

Kegunaan dari spektrofotometer UV/VIS adalah untuk mengukur transmitansi,
reflektansi dan absorbsi dari cuplikan sebagai fungsi dari panjang gelombang.
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi cahaya secara relatif jika energi tersebut
ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Suatu
spektrofotometer tersusun dari sumber spektrum sinar tampak yang sinambung dan
monokromatis. Sel pengabsorbsi untuk mengukur perbedaan absorbsi antara cuplikan dengan
blanko atau pun pembanding.

Cara kerja spektrofotometer UV/VIS

Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang berbeda.
Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-
350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi yang
cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul tersebut
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional atau gugus kromofor
yang mengandung elektron valensi dengan tingkat eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang
terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas. Kromofor-kromofor organik seperto karbonil,
alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang
gelombang maksimumnya dapat berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom
adalah gugus fungsional yang mempunyai elektron bebas nseperti hidroksil, metoksi, dan
amina. Terkaitnya gugus kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke
 panjang gelombang yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas
Ketika cahaya melewati suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan.
Kemungkinan pertama adalah cahaya ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya
discattering. Bila energi dari cahaya (foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan
energi eksitasi dari molekul tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi
dalam spektrofotometer .
Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya cahaya monokromatik dari
sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya
cahaya yang diteruskan maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang
kemudian menyampaikan ke layar pembaca.
Larutan yang akan diamati melalui spektrofotometer harus memiliki warna tertentu. Hal ini
dilakukan supaya zat di dalam larutan lebih mudah menyerap energi cahaya yang diberikan.
Secara kuantitatif, besarnya energi yang diserap oleh zat akan identik dengan jumlah zat di
dalam larutan tersebut. Secara kualitatif, panjang gelombang dimana energi dapat diserap akan
menunjukkan jenis zatnya.

Kelebihan Spektrofotometer UV/VIS

 Panjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi
 Caranya sederhana
 Dapat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil

Kekurangan Spektrofotometer UV/VIS

 Absorbsi dipengaruhi oleh pH larutan, suhu dan adanya zat pengganggu dan kebersihan dari
kuvet
 Hanya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang >185 nm
 Pemakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan energy
eksitasi rendah
 Sinar yang dipakai harus monokromatis

V. PROSEDUR KERJA
Pembuatan Larutan Standar (larutan kalibrasi)
1. Melarutkan 3,9278 gram CuSO4.5H2O dalam labu takar 500 ml dan ditambahkan 5
ml H2SO4 pekat, kemudian diencerkan sampai tanda batas dengan aquadest.
2. Mengambil larutan tersebut dan dimasukkan kedalam erlenmeyer 50 ml sebanyak :
 Erlenmeyer I II III IV V

Volume 2,5 ml 5 ml 7,5 ml 10 ml 12,5 ml

3. Menambahkan masing-masing 2,5 ml NH3 pekat dan diencerkan sampai tanda batas
dengan aquadest .
4. Menghitung konsenterasi dari tiap-tiap larutan dalam satuan mg/1

Mencari panjang gelombang yang mempunyai serapan maksimum

1. Menyalakan Spektrometer (menekan tombol power yang berada di belakang alat)

sehingga secara otomatis instrumen akan melakukan proses inisialisasi (proses
inisialisasi berlangsung sampai dilayar akan muncul “OK” paada setiap baris di layar
inisialisasi)
2. Menekan “mode” kemudian menekan angka 1 (photometric) sehingga muncul layar λ
dan DATA
3. Menekan tombol “GO TO WL”
4. Memasukkan nilai 760 nm kemudian menekan “ENTER”
5. Memasukkan larutan blanko pada kuvet 1 kemudian menekan “AUTO ZERO”
sehingga muncul Abs 0,000
6. Memasukkan larutan standar yang telah dibuat (larutan standar yang tidak terlalu
terang dan tidak terlalu gelap, larutan dengan volume larutan baku 7,5 ml yang
diambil) pada kuvet 2 kemudian menekan “GOTO” dan menunggu sampai panjang
gelombang yang dipilih tampak pada display abcissa. Mencatat panjang gelombang
dan absorbansinya
7. Memasukkan nilai 740 nm dan menekan “ GOTO “ lalu mencatat panjang gelombang
dan absorbansinya,
8. Masukkan nilai 720 nm dan metekan “ GOTO “ kemudian mencatat panjang
gelombang dan absorbansinya,
9. Melakukan hal yang sama sampai mendapatkan nilai absorbansi menurun dengan 3
titik terakhir.
10. Membuat kurva hubungan antara panjang gelombang dan absorbansi.
 Kurva Kalibrasi

1. Memasukkan panjang gelombang yang mempunyai absorbansi tertinggi, kemudian

menekan “ GOTO “ dan menunggu sampai panjang gelombang tersebut tampak pada
display abcissa.
2. Mengisi sel sampel dengan larutan blanko kemudian menekan “AUTO ZERO”
3. Mengisi sel sampel dengan larutan standar kemudian menekan “GOTO”
4. Melakukan hal yang sama dengan keempat larutan standar.
5. Membuat kurva antara konsenterasi dalam satuan mg/L (sebagai absis) terhadap
absorbans (sebagai ordinat)

Penentuan Sampel

1. Mengisi kuvet dengan sampel yang telah dibuat

2. Memasukkannya kedalam tempat kuvet dan mencatat absorbansi yang tampak pada
display abcissa
3. Menentukan konsenterasi sampel dengan menggunakan kurva kalibrasi

VI. DATA HASIL PENGAMATAN

panjang gelombang yang mempunyai serapan maksimum
Panjang Gelombang, λ Absorbansi
(nm) (abs)
760 0,056
740 0,060
720 0,071
700 0,083
680 0,096
660 0,109
640 0,121
620 0,129
600 0,132
 580 0,126
560 0,112
540 0,019

Kurva Kalibrasi (Larutan Standar)

λ = 600 nm

Volume Larutan Standar Absorbansi

(ml) (abs)
2,5 0,046
5 0,085
7,5 0,131
10 0,175
12,5 0,218

Penentuan Sampel

Panjang gelombang, λ (nm) = 600 nm

Absorbansi (abs) = 0,131

VII. PERHITUNGAN

Massa Cu = BA.Cu x Massa CuSO4.5H2O

BM.CuSO 4 .5H 2O

Massa Cu = 193,0461 x 3,927 gram

379,0461

Massa Cu = 2 gram

1 ml  2 mg Cu2+

1000 ml  2000 mg Cu2+

2000 𝑚𝑔
Konsentrasi = = 2000 ppm (dalam hal ini mg/L setara dengan ppm)
1𝐿
 Konsentrasi larutan standar
 Untuk volume 2,5 ml
V1 x M1 = V2 x M2
2,5 ml x 2000 ppm = 50 ml x M
M = 100 ppm

 Untuk volume 5 ml
V1 x M1 = V2 x M2
5 ml x 2000 ppm = 50 ml x M
M = 200 ppm

 Untuk volume 7,5 ml

V1 x M1 = V2 x M2
7,5 ml x 2000 ppm = 50 ml x M
M = 300 ppm

 Untuk volume 10 ml
V1 x M1 = V2 x M2
10 ml x 2000 ppm = 50 ml x M
M = 400 ppm

 Untuk volume 12,5 ml

V1 x M1 = V2 x M2
12,5 ml x 2000 ppm = 50 ml x M
M = 500 ppm

VIII. PEMBAHASAN

IX. KESIMPULAN

X. DAFTAR PUSTAKA