BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
II.1 Dasar Teori
II.1.1 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Spektrofotometri adalah suatu metode analisis yang berdasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna
pada panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum phototube
atau tabung foton hampa . (Underwood, 1981).
Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu suatu alat yang
digunakan untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun
kualitatif dengan mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu
cuplikan sebagai fungsi dari konsentrasi. Spektrometer menghasilkan sinar
dari spectrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat
pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Kelebihan
spectrometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar
putih dapat lebih terseleksi dan ini ndiperoleh dengan alat pengurai seperti
prisma, grating, atau celah optis. Pada fotometer filter berbagai filter dari
berbagai warna yang mempunyai spesifikasi melewatkan trayek panjang
gelombang tertentu. Pada fotometer filter tidak mungkin diperoleh panjang
gelombang yang benar-benar monokromatis, melainkan suatu trayek
panjang gelombang 30-40 nm. Sedangkan pada spektrofotometer, pnjang
gelombang yang benar-benar terseleksi dapatdiperoleh dengan bantuan alat
pengurai cahaya seperti prisma. Suatu spektrofotometer tersusun dari
sumber spektrum tampak yang kontinyu, monokromator, sel pengabsorbsi
untuk larutan sampel atau blanko dan suatu alat untuk mengukur perbedaan
absorbsi antara sampel dan blanko ataupun pembanding. (Underwood,
1981).
 Skema Instrumen Spektrofotometri UV-VIS (Yahya, 2013)

1. Sumber sinar polikromatis berfungsi sebagai sumber sinar polikromatis

dengan berbagai macam rentang panjang gelombang.
2. Monokromator berfungsi sebagai penyeleksi panjang gelombang yaitu
mengubah cahaya yang berasal dari sumber sinar polikromatismenjadi
cahaya monokromatis. Padagambar di atas disebut sebagai pendispersi
atau penyebar cahaya. dengan adanya pendispersi hanya satu jenis
cahaya atau cahaya dengan panjang gelombang tunggal yang mengenai
sel sampel. Pada gambar di atas hanya cahaya hijau yang melewati
pintu keluar.Proses dispersi atau penyebaran cahaya seperti yang tertera
pada gambar.

3. Sel sampel berfungsi sebagai tempat meletakan sampel-UV,VIS dan UV-

VIS menggunakan kuvet sebagai tempat sampel. Kuvet biasanya terbuat
dari kuarsa atau gelas, namun kuvet dari kuarsa yang terbuat dari silika
memiliki kualitas yang lebih baik. Hal ini disebabkan yang terbuat dari
kaca dan plastik dapat menyerap UV sehingga penggunaannya hanya pada
spektrofotometer sinar tampak (VIS). Kuvet biasanya berbentuk persegi
panjang dengan lebar 1 cm.
4. Detektor berfungsi menangkap cahaya yang diteruskan dari sampel dan
mengubahnya menjadi arus listrik. Macam-macam detector yaitu Detektor
foto (Photo detector),Photocell, misalnya CdS, Phototube, Hantaran foto,
Dioda foto, Detektor panas
5. Read out merupakan suatu sistem baca yang menangkap besarnya isyarat
listrik yang berasal dari detector.
Keuntungan dari spektrofotometer untuk keperluan analisis kuantitatif
adalah (Underwood,1989):
1. Dapat digunakan secara luas
2. Memiliki kepekaan yang tinggi
3. Keseletifannya cukup baik
4. Tingkat ketelitian tinggi
Syarat larutan yang dapat digunakan untuk analisis campuran dua
komponen adalah (Underwood,1989),
1. Komponen-komponen dalam larutan tidak boleh saling bereaksi
2. Penyerapan komponen-komponen tersebut tiak sama
3. Komponen harus menyerap pada panjang gelombang tertentu
Senyawa-senyawa yang diukur dengan metoda spektrofotometri harus
memenuhi hukum Lambert-Beer, yaitu (Alexeyev, V. 1969)
1. Bila suatu sinar monokromatis dilewatkan pada medium
pengabsorbsi,maka berkurangnya intensitas cahaya per unit tebal
medium sebanding dengan intensitas cahaya tersebut.
2. Berkurangnya intensitas cahaya per unit konsentrasi akan berbanding
lurus dengan intensitas cahaya.
Dari hukum Lambert Beer didapat rumus sebagai berikut
A = a.b.c A = -log T
 Rumus yang digunakan untuk analisis dua komponen adalah :
A1 = ax1. b. cx + ay1 . b . cy
A2 = ax2 . b. cx + ay2 . b . cy
Dimana:
A1 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum pertama
A2 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum kedua
C = konsentrasi larutan
Kondisi berikut adalah keabsahan hukum Beer. Cahaya yang
digunakan harus monokromatis, bila tidak demikian maka akan diperoleh
dua nilai absorbansi pada dua panjang gelombang. Hukum tersebut tidak
diikuti oleh larutan yang pekat. Konsentrasi lebih tinggi untuk beberapa
garam tidak berwarna justru mempunyai efek absorbsi yang berlawanan.
Larutan yang bersifat memancarkan pendar-fluor atau suspensi tidak selalu
mengikuti hukum Beer. Jika selama pengukuran pada larutan encer terjadi
reaksi kimia seperti polimerisasi, hidrolisis, asosiasi atau disosiasi, maka
hukum Beer tidak berlaku. (Alexeyev, V. 1969)
Cara Kerja Spektrofotometer Cara kerja spektrofotometer secara
singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan pembanding, misalnya
blanko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis pada sel
kedua. Kemudian pilih fotosel yang cocok 200-650 nm ( 650-1100 nm )
agar daerah λ yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang fotosel dalam
keadaan tertutup ” nol ” galvanometer dengan menggunakan tombol dark-
current. Pilih h yang diinginkan, buk fotosel dan lewatkan berkas cahaya
pada blanko dan ” nol ” galvanometer didapat dengan memutar tombol
sensitivitas. Dengan menggunakn tombol transmitansi, kemudian atur
besarnya pada 100 %. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang
akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
(Vogel (refisi) Svela, G. 1995)
Spektrum UV-Vis merupakam hasil interaksi antara radiasi
elektromagentik (REM) dengan molekul. REM merupakan bentuk energy
radiasi yang mempunyai sifat gelombang dan partikel (foton). Karena
bersifat sebagai gelombang maka beberapa parameter perlu diketahui,
misalnya panjang gelombang, frekuensi, bilngan gelombang, dan serapan.
REm mempunyai vector listrik dan vector magnet yang bergetar dalam-
dalam bidang-bidang yang tegak lurus satu sama lain dan masing-masing
tegak lurus pada arah perambatan radiasi. (Vogel (refisi) Svela, G. 1995)
Perubahan warna mencerminkan suatu perubahan dalam
pengabsorpsian cahaya oleh larutan, yang menyertai perubahan konsentrasi
dari spesies yang menyerap. Dalam suatu titrasi visual, seenarnya orang
menggunakan semua segi titrator fotometrik yang automatic, cahaya
dilewatkan larutan menuju mata, yang merupakan transduser peka cahaya
yang berespon dengan isyrat dan kalau tidak, membuatnya tepat untuk
diteruskan ke system penyetopan aliran yang bersifat elektromekanis
(khopkar, 2002).
Kadang-kadang suatu zat yang terlihat langsung dalam reaksi titrasi
menyerap cukup anyak pada suatu panjang gelombang yang dapat dicapai,
dan titrasi itu diikuti secara spektrofotometri tanpa menambahkan suatu
indicator. Bentuk kurva titrasi dapat diramalkan dari nilai spesies kimia
yang diperhatikan. Beberapa kurva titrasi fotometrik yang khas
diperagakan, jika reaksi titrasi itu cukup tidak lengkap disekitar titik
kesetaraan, kurva itu akan jadi membundar. Titik akhir itu kemudian dicari
letaknya dengan titik potong garis-garis lurus yang diekstrapolasi, yang
ditarik lewat titik-titik yang diambil secukupnya sebelum dan sesudah
bagian yang membundar. Kurva titrasi semacam itu mudah dihitung, orang
semata-mata menghitung konsentrasi spesies yang menyerap titik dimana
saja, dengan menggunakan tetapan keseimbangan reaksi itu, kemudian
menghitung sumbangan tiap spesies pada absorbans dari larutan menurut
Hukum Beer (Underwood, 1981).
Kadang-kadang dimungkinkan untuk melengkapi sebuah
spektrofotometri dengan suatu ruangan sel yang diubah sehingga suatu
bejana titrasi seperti sebuah gelas piala dapat ditaruh dalam berkas cahaya.
Lebih nyaman bila pengaduk yang digunakan adalah pengaduk magnetic
yang diletakkan dibawah ruangan harus dijaga agar penataan itu kedap
cahaya. (Underwood, 1981).
Menurut hukum Bouguer-Beer, suatu alur absorbans dengan
konsentrasi molar akan berupa garis lurus dengan arah lereng. Tetapi sering
kali pengukuran terhadap system kimia riil menghasilkan alur Hukum Beer
yang tidak linear sepanjang seluruh jangka konsentrasi untuk system-sistem
semacam itu, namun pemahaman yang lebih mendalam menimbulkan suatu
pandangan yang agak lebih canggih (Underwood, 1981).
Komponen utama dari spektrofotometer diantaranya yaitu :
1. Monokromator berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi
sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran, macam-
macam monokromator : (Satiadarma, Kosasih. 2004)
a. Prisma
b. kaca untuk daerah sinar tampak
c. kuarsa untuk daerah UV
d. Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR
e. Kisi difraksi
2. Detektor fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang
sebanding dengan besaran yang dapat diukur.
Syarat-syarat ideal sebuah detektor :
a. Kepekan yang tinggi
b. Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
c. Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
d. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
e. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga
radiasi.
Macam-macam detektor :
a. Detektor foto (Photo detector)
b. Photocell
c. Phototube
d. Hantaran foto
 e. Dioda foto
f. Detektor panas
II.1.2 Penetapan kadar Vitamin C
Vitamin C atau asam askorbat, merupakan vitamin yang dapat
ditemukan dalam berbagai buah-buahan dan sayuran. Vitamin C dapat
disintesis dari glukosa atau diekstrak dari sumber-sumber alam tertentu
seperti jus jeruk. Vitamin pertama kali diisolasi dari air jeruk nipis oleh
Gyorgy Szent tahun 1928.
Vitamin C bertindak ampuh mengurangi oksigen, nitrogen, dan
sulfur yang bersifat radikal. Vitamin C bekerja sinergis dengan tokoferol
yang tidak dapat mengikat radikal lipofilik dalam area lipid membrane dan
protein. Pengobatan dengan vitamin C dapat memulihkan kadar zat besi
dalam tubuh. Ada beberapa metode yang dikembangkan untuk penentuan
kadar vitamin C diantaranya adalah metode spektrofotometri UV-Vis
(panjang gelombang 265 nm) dan metode iodimetri.
Metode Spektrofotometri dapat digunakan untuk penetapan kadar
campuran dengan spektrum yang tumpang tindih tanpa pemisahan terlebih
dahulu. Karena perangkat lunaknya mudah digunakan untuk instrumentasi
analisis dan mikrokomputer, spektrofotometri banyak digunakan di bidang
analisis kimia sedangkan iodimetri merupakan metode yang sederhana dan
mudah diterapkan dalam suatu penelitian.
Asam askorbat BPFI. Spektrofotometri adalah sebuah metode
analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan
kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya.
Spektrofotometri adalah alat yang terdiri dari spektrofotometer dan
fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah alat pengukur
intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorpsi. Istilah
spektrofotometri berhubungan dengan pengukuran energi radiasi yang
diserap oleh suatu sistem sebagai fungsi panjang gelombang dari radiasi
maupun pengukuran panjang absorpsi terisolasi pada suatu panjang
gelombang tertentu (Underwood 1994).
Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :
a. Spektrofotometer ultraviolet
b. Spektrofotometer sinar tampak
c. Spektrofotometer infra merah
d. Spektrofotometer serapan atom
Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan
sifat-sifat yang berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian
biokimia adalah ultra lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS,
350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan ini mempunyai energi yang cukup
untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul tersebut (Keenan
1992).
Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus fungsional
atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat
eksutasi rendah. Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan dihasilkannya
cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian
menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan
maupun yang diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian
menyampaikan ke layar pembaca (Hadi 2009).
Salah satu contoh instrumentasi analisis yang lebih kompleks adalah
spektrofotometer UV-Vis. Alat ini banyak bermanfaat untuk penentuan
konsentrasi senyawa-senyawa yang dapat menyerap radiasi pada daerah
ultraviolet (200 – 400 nm) atau daerah sinar tampak (400 – 800 nm)
Analisis ini dapat digunakan yakni dengan penentuan absorbansi dari
larutan sampel yang diukur. Pengukuran absorbansi untuk tujuan analisis
kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Visibel harus memenuhi
hukum Lambert-Beer.
Hukum Lambert Beer berlaku dengan baik bila larutannya tidak
terlalu encer ataupun pekat. Selain absorbansi (A), dapat juga dibaca
transmitan (%T). %T ini menunjukkan jumlah sinar REM yang diteruskan
 (ditransmisikan) oleh senyawa yang diukur. Nilai dari %T merupakan
kebalikan dari absorbansi atau sinar yang diserap (A = -log %T).
Kadar dapat dihitung berdasarkan persamaan : A1 x C1 = A2 x C2
(dengan A adalah nilai absorbansi dari sampel atau standar, dan C adalah
konsentrasi dari sampel atau standar). Kadar yang diperoleh dari
perhitungan ini baru menunjukkan kadar yang terukur, belum menunjukkan
kadar sampel yang sebenarnya. Untuk memperoleh kadar sampel
sebenarnya, hasil perhitungan tersebut kemudian dikalikan dengan besarnya
pengenceran yang dilakukan saat pembuatan larutan yang akan diukur
serapannya.
Faktor-faktor yang sering menyebabkan kesalahan dalam
menggunakan spektrofotometer dalam mengukur konsentrasi suatu analit :
1. Adanya serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi dengan penggunaan
blangko, yaitu larutan yang berisi selain komponen yang akan dianalisis
termasuk zat pembentuk warna.
2. Serapan oleh kuvet. Kuvet yang ada biasanya dari bahan gelas atau
kuarsa, namun kuvet dari kuarsa memiliki kualitas yang lebih baik.
3. Kesalahan fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi
sangat rendah atau sangat tinggi, hal ini dapat diatur dengan pengaturan
konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan
(melalui pengenceran atau pemekatan).
II.1.3 Uji Efektifitas Antioksidan
Radikal bebas merupakan atom atau molekul yang memiliki elektron
bebas yang tak berpasangan (unpaired electron). Hal ini dapat dilihat
misalnya pada air (H2O). Ikatan atom oksigen dengan hidrogen pada air
merupakan ikatan kovalen, yaitu ikatan kimia yang timbul karena sepasang
elektron dimiliki bersama oleh dua atom. Elektron yang tidak memiliki
pasangan cenderung akan menarik eletron dari senyawa lainnya, sehingga
elektron tersebut akan dimiliki bersama oleh dua atom atau senyawa dan
terbentuk suatu senyawa radikal bebas baru yang lebih reaktif. Reaktivitas
yang meningkat tersebut menyebabkan senyawa radikal bebas menjadi
lebih mudah untuk menyerang sel-sel sehat dalam tubuh. Jika pertahanan
tubuh lemah maka sel-sel tersebut menjadi sakit atau rusak (Uppu, Murthy,
Pryor, dan Parinandi, 2010).
Radikal bebas tersebut memiliki 2 sifat yaitu:
1. Reaktivitasnya yang tinggi karena akan cenderung menarik elektron
dari senyawa yang lainnya lagi.
2. Memiliki kemampuan untuk mengubah suatu molekul, atom, atau
senyawa untuk menjadi suatu radikal baru (Morello, Shahidi, Ho,
2002).
Target utama radikal bebas adalah protein, karbohidrat, asam lemak
tak Jenuh dan lipoprotein, serta unsur-unsur DNA. Dari molekul-molekul
target tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah
asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh dapat
merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel sehingga dinding
sel menjadi rapuh, merusak basa DNA sehingga mengacaukan sistem
genetika, dan berlanjut pada pembentukan sel kanker. Radikal bebas akan
terus mencari elektron dari molekul-molekul di sekitarnya dan apabila tidak
dikendalikan reaksi berantai ini dapat berlangsung secara terus menerus
(Halliwell dan Gutteridge, 2000).
Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor)
atau reduktan. Senyawa ini mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi
oksidasi, dengan cara mencegah terbentuknya radikal. Antioksidan juga
dapat didefinisikan sebagai senyawa yang apabila dalam konsentrasi rendah
berada bersama substrat yang dapat teroksidasi, dapat menunda atau
menghambat oksidasi senyawa tersebut (Sunardi, 2007).
Berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan diklasifikasikan
menjadi dua kategori, yaitu antioksidan pencegah dan antioksidan pemutus
rantai. Antioksidan pencegah bekerja dengan menghambat pembentukan
reactive oxygen species(ROS), seperti enzim katalase, peroksidase,
superoksida dismutase, dan transferin. Antioksidan pemutus rantai
merupakan senyawa yang menangkap radikal oksigen kemudian memutus
rangkaian rantai reaksi radikal, contohnya vitamin C, vitamin E, asam urat,
bilirubin, polifenol, dan sebagainya. Antioksidan
pemutus rantai memiliki dua jaul reaksi. Jalur pertama merupakan jalur
transfer atom hidrogen dengan mekanisme radikal oksigen menangkap
hidrogen dari antioksidan sehingga terbentuk kompleks antioksidan radikal
yang bersifat stabil. Jalur kedua, antioksidan mendeaktivasi radikal bebas
dengan transfer elektron tunggal. Transfer elektron tunggal sangat
dipengaruhi oleh kestablilan pelarut pada muatan tertentu (Ou, Huang,
Woodill, Flanagan, dan Deemer, 2002).
Metode DPPH merupakan metode yang cepat, sederhana, dan tidak
membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan
menggunakan radikal bebas 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH). Metode
inisering digunakan untuk menguji senyawa yang berperan sebagai free
radical scavengers atau donor hidrogen dan mengevaluasi aktivitas
antioksidannya, serta
mengkuantifikasi jumlah kompleks radikal-antioksidan yang terbentuk.
Metode DPPH dapat digunakan untuk sampel yang berupa padatan maupun
cairan (Prakash, Rigelhof, dan Miller, 2001).
Gugus kromofor dan auksokrompada radikal bebas DPPH
memberikan absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm
sehingga menimbulkan warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu
menjadi kuning seiring penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal
pada DPPH berpasangan dengan hidrogen dari antioksidan.Hasil
dekolorisasi oleh antioksidan setara dengan jumlah elektron yang
tertangkap.