TRANSLATE HAL 4

P.TRAYHURN
Dalam kasus deteksi chemiluminescent, pemecahan substrat chemiluminescence
tertentu dikatalisis oleh alkali fosfatase (EC 3.1.3.1) atau horseradish peroksidase (EC
1.11.1.7), dengan emisi cahaya. enzim ini dapat terkonjugasi langsung ke probe, atau lebih
umum probe dilabeli dengan ligan (misalnya digoksigenin, fluorescein, biotin) yang
kemudian diterjemahkan oleh antibodi (atau avidin atau streptavidin jika biotin adalah
ligan) yang alkali fosfatase atau horseradish peroxidasenya terpasang.
X-ray Film adalah cara biasa dimana sinyal hibridisasi dikumpulkan, dan ini dapat
digunakan dengan baik pada radioaktivitas dan chemiluminescence. Kuantifikasi dicapai
dengan densitometri, dan didasarkan pada unit dan perubahan relatif antara eksperimental
kelompok dan kontrol. Atau, penyimpanan fosfor menyaring secara bersamaan dengan
imager molekul yang juga dapat digunakan.
Prosedur sederhana non-radioaktif
Dengan maksud untuk meningkatkan aksesibilitas nourthen blotting untuk studi gizi dan
fisiologis, terutama untuk laboratorium dengan fasilitas yang terbatas dan keahlian dalam
biologi molekuler, kami baru mendirikan, prosedur non-radioaktif yang cepat (Trayhurn et
al. 1994). Anti-sense oligonukleotida (30-35-mer) sebagai probe hibridisasi dengan deteksi
chemiluminescence. Pendekatan ini melibatkan oligonukleotida anti-sense melalui
databanks gen (Molekuler Eropa Laboratorium Biologi, atau Genbank), dan pelabelan
oligonukleotida dengan ligan digoksigenin (Boehringer Mannheim). Antibodi untuk
digoksigenin, terkonjugasi dengan fosfatase alkali, digunakan untuk mendeteksi
hibridisasi oligonukleotida label digoksigenin ke mRNA sasaran. Sensitivitas tinggi pada
substrat chemiluminescence, seperti CSPD atau CDP-Star (Tropix, USA), menyediakan
deteksi dalam beberapa menit pemaparan dari membran untuk film (Trayhurn et al. 1994,
199%). Strategi umum menggabungkan deteksi berbasis chemiluminescence dengan
oligonukleotida anti-sense sebagai probe telah berhasil dimanfaatkan untuk deteksi cepat
oleh nourthen blot dari sejumlah mRNA dalam jaringan mamalia. Ini termasuk protein
mitochondria1 uncoupling, transporter glukosa fasilitatif (GLUT 1-4), lipoprotein lipase
(EC 3.1.1.34), dan gen ob (Trayhurn et al. 1994, 19956).
MASALAH: RNases
Semua teknik biokimia memerlukan perawatan teliti dalam pelaksanaannya. Masalah
tertentu dalam kasus nourthen blotting berkaitan dengan degradasi potensi RNA melalui
aksi RNases. Enzim ini tersebar luas di jaringan, dan pencemaran lingkungan adalah
mungkin tahapan paling utama pada analisis nourthen blot, dengan jari-jari menjadi
sumber utama kontaminasi. Masalah ini dapat diatasi dengan sterilisasi, dan dengan
menggunakan inhibitor RNase tertentu seperti dietil pyrocarbonate (DEPC). Penggunaan
sarung tangan lateks pelindung sangat penting.
Masalah penting lainnya adalah latar belakang yang tinggi pada membran, mengurangi
signal : rasio kebisingan. penyesuaian dari kondisi pencuci pasca-hibridisasi penting dalam
meminimalkan latar belakang, terutama dengan deteksi berbasis chemiluminescence.
NORTHERN blotting DI STUDI GIZI
Nourthen blotting telah banyak digunakan untuk menguji ekspresi gen tertentu