Sulfat radikal menghasilkan prekusor non-enzimatik pada siklus

Krebs
Markus A. Keller1,2,3 , Domen Kampjut1 , Stuart A. Harrison1 and Markus Ralser1,4*
Asal usul evolusioner siklus Krebs (siklus asam tricarboxylic) tidak begitu jelas. Meski keberadaan katalisator non-
enzimatik sederhana siklus krebs dihilangkan beberapa tahun yang lalu sebagai 'appeal to magic’, sitrat dan zat
intermediate lainnya sejak saat itu telah ditemukan di meteorit berkarbon dan melakukan interkoneksi non-enzimatik.
Untuk mengidentifikasi metabolisme katalis siklus Krebs non-enzimatik, kami menggunakan kombinatorial, analisa
kuantitatif melalui metabolomik hingga secara sistematis layar besi dan senyawa sulfat dalam campuran reaksi yang
mengarahkan pada komponen khas endapan Archaean. Siklus Krebs intermediate ditemukan untuk stabil di air dan pada
sebagian besar spesies molekul, termasuk mineral sulfat besi sederhana. Namun, dengan adanya radikal sulfat yang
dihasilkan dari peroksidisulfat, intermediet mengalami 24 interkonversi reaksi. Reaksi non-enzimatik ini menutupi
topologi kritis siklus Krebs oksidatif, yaitu pelepasan glyoxylate dan jalur succinic-semialdehyde. Dirakit dalam jaringan
kimia, reaksi menghasilkan lebih dari 90% pemulihan karbon. Hasil kami menunjukkan bahwa prekursor non-enzimatik
siklus Krebs secara biologis masuk akal, efisien, dan terbentuk secara spontan dengan adanya radikal sulfat.

S
iklus asam tricarboxylic (TCA), atau siklus Krebs,
merupakan pusat jalur metabolisme, khususnya sebagai
oksidatif. Jalur metabolik ini menyediakan prekursor untuk
biosintesis asam amino, dan memainkan peran penting dalam
kerusakan asam lemak, respirasi seluler, dan metabolisme energi
dan redoks. Terjadinya kemunculan sekurang-kurangnya pada
reaksi oksidatifnya menunjukkan bahwa setidaknya sebagian dari
Siklus Krebs berasal dari tahap awal evolusi; mungkin kembali
ke asal usul kehidupan. Sebuah hipotesis yang sering dibahas
mengusulkan bahwa siklus Krebs memperoleh topologi
strukturalnya dengan prinsip seleksi Darwin yang dimungkinkan
oleh 'dunia asam ribonuklead (RNA)'. Asal post-genetic
mengimplikasikan bahwa jalur topologi tunduk pada perubahan
progresif, menyiratkan bahwa Siklus Krebs modern dapat
berbeda secara substansial dari prekursor awal. Namun, asal
mula post-genetic metabolisme berusaha untuk menjelaskan
banyak, banyak enzim yang kompleks secara struktural masuk ke
dalamnya awalnya; Enzim itu sendiri dibuat dari metabolisme
produk dari siklus Krebs. Kedua, asal Darwinian topologi
jaringan metabolik mengalami kesulitan dalam menjelaskan
tingginya jumlah reaksi yang terjadi antara kerajaan meskipun
kurangnya konservasi urutan enzim. Sebuah hipotesis alternatif
mengusulkan bahwa setidaknya reaksi metabolik utama berasal
dari lingkungan kimia. Dalam konteks ini, katalisis anorganik
menentukan struktur dasar metabolisme.
Sebagai mekanisme enzimatik siklus Krebs memiliki
kemiripan yang terbatas untuk katalisis anorganik, gagasan asal
non-enzimatik itu diragukan oleh kebanyakan. Misalnya, Leslie
Orgel, seorang pemimpin ilmuwan dalam membentuk hipotesis
dunia RNA, menolak kemungkinan tersebut bahwa katalis
anorganik sederhana yang bisa menggantikan serangkaian reaksi
mirip TCA sebagai 'daya tarik terhadap sihir'. Namun, terlepas
dari kenyataan bahwa katalis sederhana memang hilang, ada
yang berpendapat beberapa metabolit siklus Krebs terbentuk
dalam reaksi kimia organik. Sementara itu, kehadiran
serangkaian intermediet TCA telah dikonfirmasi pada meteorit
berkarbon. Selanjutnya, sitrat dan intermediet TCA lainnya
mengalami reaksi interkonversi reduktif yang sangat efisien pada
partikel semikonduktor saat terpapar sinar ultraviolet yang kuat.
Prekursor non-enzimatik ke siklus Krebs Oleh karena itu siklus
dimungkinkan secara katalitis. Apalagi keberadaan pemersatu,
memebuat katalis sederhana menjadi masuk akal. Reaksi non-
enzimatik yang meniru dua jalur metabolisme lainnya, yaitu
glikolisis dan jalur pentosa fosfat, mereka disatukan bersama
pada besi ferrous sebagai katalis dan co-substrat. Fe (ii)
melimpah pada sedimen khas Archaean, menyiratkan bahwa
lingkungan kimia umum, lebih jarang pada kondisi khusus,
mungkin merupakan kunci untuk membentuk struktur jalur
metabolisme.
Kami memilih strategi penyaringan yang sistematis dimana
8.850 absolut. Percobaan kuantitatif dilakukan untuk menguji
reaktivitas dari intermediet TCA terhadap unsur khas sedimen
Archaean, serta zat besi dan belerang. Kami menemukan bahwa
zat antara TCA tidak reaktif terhadap adanya besi dan kombinasi
sulfat, termasuk mineral sederhana, ferrous sulfide (FeS).
Namun, terhadap keberadaan donor peroksidisulfat radikal, kami
mendeteksi 24 non-enzimatik reaksi interkonversi. Reaksi ini
menyerupai isomerisasi dan reaksi oksidatif dari siklus Krebs
enzimatik, perpindahan glikoksilat dan jalur semialdehida
suksinik, sehingga topologi kritis mereka ditutupi. Sebuah
jaringan kimia yang dirakit dari reaksi ini menghasilkani lebih
dari 90% perolehan kembali karbon, membentuk prekursor non-
enzymatic yang masuk akal untuk asal mula awal Siklus Krebs.
Hasil
Kami mengoptimalkan melalui beberapa kromatografi cairan
metode pemantauan reaksi (LC-MRM) untuk memungkinkan
kuantifikasi absolut TCA intermediate pada 6.100 sampel yang
dihasilkan oleh penelitian ini. Kami selanjutnya menilai
reaktivitas sitrat, cis-aconitate, isocitrate, α -ketoglutarat,
suksinat, fumarat,
malat dan oksaloasetat bila dipanaskan dalam air dalam bentuk atmosfer
nitrogen buatan (untuk mereplikasi konsentrasi oksigen rendah dari dunia
pra-metabolisme). Intermediet TCA stabil dan tidak secara spontan
bereaksi untuk membentuk zat antara TCA lainnya atau produk lainnya
(Gambar 1a, b dan Tambahan Gambar 1). Satu-satunya Pengecualian
adalahoksaloasetat, yang membentuk piruvat melalui dekarboksilasi
(Gambar 1b dan Gambar Tambahan 2). Siklus Krebs demikian kontras
dengan jalur glikolisis dan pentosa fosfat, di mana beberapa intermediet
secara spontan saling bertukar air. Nonenzymatic Reaktivitas seperti TCA
sangat bergantung pada memungkinkan kimia Selanjutnya eksperimen ini
berfungsi sebagai kontrol penting karena mereka memastikan tidak
adanya enzimatik kontaminasi.
Logam transisi secara prebiotically berlimpah dan tetap ada katalis
metabolik umum hari ini. Kami menguji logam transisi campuran yang
mencerminkan besi, kobalt, nikel dan molibdenum konsentrasi sedimen
Archaean khas dan menemukan itu isocitrate bereaksi membentuk α -
ketoglutarat, suksinat dan piruvat, dan α -ketoglutarat bereaksi
membentuk suksinat (Gambar 1c dan Tabel Tambahan 1). Reaksi ini
bergantung pada Fe (ii) (Supplementary Fig.3 dan Supplementary Table
2), dan oleh karena itu Mungkin tergantung pada α-hidroksil atau α -keto
moieties yang ada secara khusus hadir dalam isocitrate dan α -
ketoglutarat-sejak ini bagian-bagiannya membentuk situs pengikat besi
(Gambar 1d). Selanjutnya, ini Reaksi mengikuti profil pH yang jelas
(Tambahan Gambar 4), serupa untuk Fe (ii) reaksi glikolisis-reaksi serupa.
Rendahnya jumlah reaksi mengesampingkan kemungkinan terjadinya
transisi katalisis cukup untuk memungkinkan siklus Krebs non-enzimatik
(Gambar 1d). Hambatan utama terjadi pada konversi sitrat ke isocitrate,
dan suksinat menjadi fumarat, yang keduanya biasanya dikatalisis oleh
enzim sulfur-cluster besi. Besi-sulfur mineral seperti pirit bisa bertindak
sebagai katalis dalam metabolisme prebiotik4, tapi kimia permukaan
mineral ini sedikit berbeda kimia katalisis metabolik. Kami menguji
sulfida besi sebagai a mimetik sederhana dari mineral besi-belerang,
namun tidak mendeteksi adanya TCA reaksi (Tabel Tambahan 3 dan 4,
dan Gambar Tambahan 5 dan 6). Kami melanjutkan dengan layar yang
sistematis, menguji sepuluh belerang senyawa, tujuh sumber besi dan lima
substrat TCA dalam semua kemungkinan kombinasi (Gambar 2a). Sekali
lagi, sebagian besar campuran reaksi tidak berpengaruh pada intermediet
TCA (Gambar 2b). Namun, a Spektrum reaktivitas yang komprehensif
dimungkinkan pada penambahan peroksidisulfat (Gambar 2b dan Tabel
Tambahan 3). Dalam dua titik format penyaringan, kami mendeteksi
hingga 13 metabolit TCA pembentukan reaksi (Gambar 2b dan Gambar
Tambahan 5 dan 6).
Kami memperhatikan bahwa bila digabungkan dengan sumber zat
besi, khususnya ferrous sulfide, spektrum reaksi yang diaktifkan oleh
peroxydisulfate diubah secara substansial. Sebagian besar reaksi
dipercepat, sementara beberapa intermediet tidak lagi diobservasi dengan
mengorbankan tambahan metabolit TCA yang terbentuk (Supplementary
Table 1). Oleh karena itu kami melanjutkan dengan rinci dan kuantitatif
(kinetik) karakterisasi reaksi yang dimulai dari sitrat, cisonononon,
isocitrate, α -ketoglutarat, suksinat, semialdehida sccinik, fumarat dan
malat dengan adanya peroksidisulfat dan besi sulfida. Dalam analisis deret
waktu kuantitatif, kami mendeteksi 24 reaksi yang menginterpretasikan
metabolit TCA (Gambar 3a). Grafik jaringan Rakitan dari reaksi ini
menunjukkan bahwa proporsi yang tinggi siklus TCA (reaksi oksidatif dan
isomerisasi), glyoxylate shunt, dan jalur semialdehida suksinik ditutupi
oleh topologi sistem non-enzimatik ini (Gambar 3b, c).
Menimbang bahwa kondisi kami dioptimalkan untuk mendapatkan a
jumlah maksimum reaksi mirip TCA, bukan maksimal Hasilnya, jaringan
non-enzimatik ditemukan sangat tinggi efisien. Setelah dua jam, 91,9%
karbon ditemukan kembali dalam intermediet TCA, dimana 42,3% adalah
TCA yang baru dibentuk metabolisme. Hanya 8,1% metabolit non-TCA,
termasukkarbon dioksida (Gambar 3c).
24 reaksi non-enzimatik terjadi pada tingkat rata-rata 0,280 μ mol
min-1, untuk 100 μ M substrat dengan adanya peroxydisulfate dan
sulfida besi; Namun, tingkat itu menurun menjadi hanya 0,0433 μ mol
min-1 dengan tidak adanya sulfida besi. Konversi Semialdehida suksinat
untuk suksinat adalah reaksi tercepat, Sedangkan sitrat terhadap suksinat
merupakan reaksi yang paling lambat (Gambar 3a dan Gambar
Tambahan 7). Selain itu, kedua reaksi tersebut diaktifkan oleh Fe (ii)
(Gambar 1), dan secara substansial lebih cepat pada peroksidisulfat /
lingkungan sulfida besi, dan masing-masing terjadi pada tingkat 33,0
dan 34,7% pada lingkungan Fe (ii) (Supplementary Gambar 7 dan Tabel
Tambahan 1). Selanjutnya, zat antara yang terdeteksi secara eksklusif
dengan adanya peroksidisulfat mungkin eksklusif untuk lingkungan
sederhana, karena mereka dikonversi ke produk hilir pada tingkat yang
lebih cepat daripada yang terbentuk, Setelah sumber zat besi
digabungkan dengan peroksidisulfat (Gambar 3a). Peroksidisulfat dapat
bertindak melalui mekanisme satu (radikal) - atau dua elektron (25) dan
memiliki potensi oksidatif tinggi karena adanya sumbangan radikal
sulfat yang terbentuk pada aktivasi oleh zat besi dan sedimen yang
mengandung besi seperti pirit, logam jejak lainnya, serta fotolisis dan
termolisis. Hipotesa bahwa Reaksi mirip TCA bergantung pada
pembentukannya radikal, kami menyelidiki efek hidrogen peroksida
(H2O2), yang dengan adanya Fe (ii) menghasilkan radikal hidroksil
melalui Reaksi Fenton. Dari 24 reaksi tersebut, 10 juga dimungkinkan
oleh H2O2 (Gambar 4a dan Tabel Tambahan 5); Namun,
kekhususannya adalah 83% lebih rendah dan laju reaksi kumulatif
91,1% lebih rendah (Gambar 4a). Selanjutnya, kita mengeksploitasi sifat
pemulung diferensial dari 2-propanol dan tert-butanol. Sedangkan 2-
propanol diparut secara efisien radikal hidroksil dan sulfat (k (HO •) =
1,9 × 109 M-1 s-1, k (SO - -) 4 = 8,2 × 107 M-1 s-1), tert-butanol
kurang efisien dalam pemulungan radikal sulfat (k (SO4 • -) = 8,5 x 105
M-1 s-1), daripada hidroksil radikal (k (HO •) = 5,2 × 108 M-1 s-1)
(Gambar 4b, panel kiri) 33. Seperti TCA Reaksi tidak dicegah oleh tert-
butanol, namun pemulungan sulfat Radikal oleh 2-propanol
menghilangkan sebagian besar reaktivitas (Gambar 4b, c dan Tabel
Tambahan 5). Pendinginan radikal memiliki dampak yang lebih rendah
pada beberapa reaksi, yang bisa dijelaskan dengan pemulungan yang
tidak lengkap atau oleh aktivitas non-radikal peroksidisulfat dan
produknya (Gambar 4d). Namun, untuk sebagian besar reaksi, adanya
radikal sulfat sangat penting.
Pembahasan
Semua sel hidup memiliki jaringan metabolisme yang topologisnya
struktur dilestarikan melintasi kerajaan; ini termasuk jalur seperti
glikolisis dan variannya, dimana enzim tidak berurutan dilestarikan
Terkadang bingung dengan pertanyaan penting lainnya tentang apakah
kehidupan berasal dari heterotrofik atau autotrofik, asal jaringan
metabolisme ini tetap merupakan masalah yang belum terpecahkan.
Peningkatan jumlah eksperimen mengungkapkan bahwa intinya Bagian
struktural menyerupai reaksi kimia spontan dan nonenzimatik katalisis.
Sebuah teori yang menjelaskan asal metabolisme oleh kimia anorganik
lingkungan memang menarik, karena memfasilitasi skenario bertahap
untuk asal enzim. Di adanya jaringan kimia, tidak semua enzim yang
membentuk a Jalur perlu muncul bersamaan pada saat mencapai
fungsional unit Apalagi sistem kimia bisa diperbaiki secara bertahap
mulai dari reaksi yang paling membatasi.
Fe (ii) tergantung reaksi non-enzimatik yang menyerupai glikolisis
dan jalur pentosa fosfat (PPP) mengungkapkan hal itu jaringan reaksi
seperti metabolisme bisa terbentuk secara sederhana dan katalis
prebiotically melimpah. Dilihat dari perspektif lain, reaksi kimia yang
digerakkan oleh Archaean yang paling melimpah logam transisi adalah
bagian dari jaringan metabolik. Namun, dua pertanyaan kunci tetap
tidak terjawab Pertama, saat ini tidak ada kemungkinan skenario yang
masuk akal yang membentuk prekursor glikolitik dan PPP; misalnya
glukosa-6-fosfat dan 6-fosfogluconat, masing-masing. Dengan demikian
tidak diketahui bagaimana glikolisis non-enzimatik bisa
 Gambar 1 | intermediet TCA stabil di air namun menunjukkan reaktivitas dengan adanya logam transisi yang sering ditemukan pada sedimen
archaean.
a. Skema reaksi siklus TCA, termasuk topologi kanonik untuk siklus Krebs, glikoksilate shunt dan jalur semialdehida suksinat (SSA).
b. intermediet TCA stabil dalam air pada suhu 70 ° C, tanpa reaktivitas yang terdeteksi selama periode pemantauan lima jam; kecuali untuk oksaloasetat,
yang membentuk piruvat (panah merah, lihat Gambar Tambahan 2). Garis putus-putus Gray menunjukkan topologi siklus Krebs. c, Campuran logam
campuran Arsen seperti Archaean meningkatkan reaktivitas saat diperiksa dalam percobaan waktu kursus (0-300 min). Isositrat diubah menjadi α-
ketoglutarat, suksinat dan piruvat, sedangkan α-ketoglutarat diubah menjadi suksinat (Supplementary Fig.3). d, Reaksi yang teridentifikasi pada c (panah
merah) diproyeksikan ke skema siklus TCA. α-Hidroksil dan α-keto yang memungkinkan interaksi spesifik dengan besi besi ditunjukkan dengan warna
merah.

melepaskan diri dari keseimbangan. Kedua, glikolisis - dan reaksi mirip Yang menarik dari siklus Krebs adalah nonenzymatic pembentukan zat
PPP tidak bisa jelaskan asal jalur lain yang bergantung pada yang berbeda antaranya telah berulang kali dijelaskan, termasuk kehadiran mereka
kimia, satu tanpa zat antara terfosforilasi. Krebs Siklus adalah contoh jalur dalam konsentrasi tinggi sebuah meteorit berkilau13-15. Dalam
seperti itu. pencarian sistematis kami untuk
Gambar 2 | Peroksidisulfat memungkinkan interkonversi non-enzimatik intermediet tCa.
a. Penyaringan kondisi kombinatorial: lima intermediet TCA diinkubasi bersama selama 0 dan 300 menit dengan kombinasi tujuh sumber besi dan
sepuluh belerang. b. Kiri: reaksi signifikan, dinyatakan sebagai hitungan per detik, diilustrasikan dalam matriks panas. Untuk setiap kemungkinan reaksi,
akumulasi produk dan konsumsi substrat lebih dari 300 min dihitung dari sinyal SRM terpadu. Sebagian besar kondisi tidak mendukung reaktivitas yang
signifikan (ambang signifikansi, z> 1.6; Tabel Tambahan 3 dan Gambar Tambahan 5 dan 6). Kanan: sepuluh contoh reaksi signifikan yang terdeteksi
untuk kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi. Kiri, 0 menit; kanan, 300 min.
 Gambar 3 | reaksi mirip siklus Krebs non-enzimatik dengan adanya peroksidisulfat dan peroksidisulfat / sulfida besi.
a. reaktivitas TCA Non-enzimatik (laju reaksi relatif, dinormalisasi untuk perbandingan) dengan adanya peroksidisulfat dan / atau sulfida besi. Lihat
Tabel Tambahan Tambahan dan Gambar 7 untuk data tingkat. b. Skema siklus Krebs yang dikatalisis enzim (abu-abu), glikoksilat shunt (oranye) dan
jalur semialdehida suksinik (merah). c. Reaksi mirip TCA non enzimatik sangat efisien dan mereplikasi sebagian besar spektrum reaksi siklus TCA,
piroklik glyoxylate dan jalur semialdehida suksinik. Reaksi non-enzimatik diwarnai menurut apakah mereka meniru siklus Krebs (hitam), pirau
glyoxylate (oranye) atau jalur semialdehid suksinik (merah). Diagram lingkaran menggambarkan efisiensi dalam hal pemulihan metabolisme TCA
(pembentukan substrat; biru), pembentukan intermediate TCA (red) dan kehilangan karbon (pembentukan zat antara non-TCA; abu-abu). Lingkaran
dalam dan luar masing-masing mewakili peroksidisulfat dan kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi. * Perhatikan bahwa kuantifikasi sitrat
menunjukkan variabilitas teknis yang lebih tinggi untuk kombinasi peroksidisulfat dan sulfida besi-lihat Metode untuk rinciannya. Singkatan: Succ.
semiald., semialdehida succinik; lainnya adalah seperti Gambar 2a.

katalis siklus Krebs yang masuk akal, kami mengecualikan kondisi
kimiawi yang tidak dapat bertahan dalam batas-batas sel (khususnya,
sinar ultraviolet, tekanan tinggi, suhu di atas 100 ° C), dan kita
menghindari kondisi niche dan logam yang hampir tidak memainkan
peran dalam metabolisme (titanium, borate). Kami hanya menyaring
molekul Berdasarkan unsur penting untuk metabolisme yang sering
terjadi komponen sedimen Archaean, menggunakan kondisi oksigen
rendah dan dikompromikan pada suhu (70 ° C) yang cukup tinggi untuk
memudahkan pengukuran reaksi lambat, namun cukup rendah
kompatibel dengan kehidupan.
Meskipun intermediet siklus TCA sangat stabil secara keseluruhan,
Layar high-throughput kami memang mengungkapkan satu pukulan.
Peroksidisulfat memungkinkan serangkaian reaksi mirip TCA, yang
kami temukan tergantung pada pembentukan radikal sulfat. Non-
enzimatik reaksi ini meniru reaksi oksidatif dan isomerisasi dari siklus
Krebs, pirau glyoxylate dan jalur semialdehida suksinik (Gambar 2),
membentuk jaringan reaksi kimiawi yang luar biasa hasil tinggi (>
90%). Memang, dalam beberapa reaksi, terbentuknya metabolit non-
TCA diabaikan (Gambar 3c). Dengan kata lain, TCA metabolit yang
secara khusus interkonverted antara intermediet TCA, sementara
membentuk hampir tidak ada banyak termodinamika lainnya produk
yang mungkin Untuk menempatkan hasil non-enzimatik ke dalam
perspektif, secara substansial melebihi dari glikolisis in vitro dengan
menggunakan dimurnikan Enzim Escherichia coli. Penjelasan untuk
spesifitas tinggi ini
 Gambar 4 | Peroksidisulfat memungkinkan reaktivitas seperti tCa dengan menyediakan radikal sulfat.
a, Perbandingan efek radikal sulfat dan hidroksil donor pada reaksi non-enzimatik TCA. Tingkat reaksi ditentukan dengan adanya hidrogen peroksida
(H2O2) dan diberikan relatif terhadap tingkat masing-masing (garis putus-putus) dengan adanya peroksidisulfat ((NH4) S2O8). H2O2 memungkinkan
subset reaksi yang rata-rata 91,1% lebih lambat. Inset: total laju reaksi kumulatif absolut untuk hidrogen peroksida, peroksidisulfat dan kontrol (air);
untuk semua tingkat kumulatif (panel a-c), konsentrasi substrat awal adalah 100 μM. Data diberikan sebagai mean ± s.d .; n = 3. b. Kiri: kapasitas
pemulungan diferensial 2-propanol dan tert-butanol (seperti yang ditunjukkan oleh konstanta kesetimbangan masing-masing, k) memungkinkan adanya
diskriminasi antara reaktivitas yang dimediasi oleh radikal sulfat dan yang dimediasi oleh radikal hidroksil. Kanan: reaktivitas yang dimediasi oleh
peroksidisulfat dipadamkan oleh pemulung radikal sulfat, 2-propanol. Data diberikan sebagai mean ± s.d .; n = 3 (lihat Tabel Tambahan 5 untuk data
tarif). c. Efek 2-propanol dan tert-butanol pada tiga reaksi non-enzimatik yang representatif (titik hitam menunjukkan adanya pemulung yang sesuai; 2-
propanol untuk SO4 • - dan tert-butanol untuk HO •). Untuk reaksi, isositrat ke α-ketoglutarat, 2-propanol dan tert-butanol menyebabkan reduksi besar
dan menengah pada laju reaksi. Reaksi cis-aconitate terhadap suksinat dan isositrat pada semialdehida suksinat terutama terjadi, namun dengan penetrasi
yang berbeda, dipengaruhi oleh pemulung radikal sulfat. d. Efek berbeda dari 2-propanol (merah) dan tert-butanol (hitam) mengkonfirmasi
ketergantungan reaksi lebih besar pada radikal sulfat. Nilai dihitung berdasarkan kemampuan pemulung untuk mengurangi reaktivitas non-enzimatik
versus kontrol; seperti yang dijelaskan dalam c. Singkatan: 2-PrOH, 2-propanol; t-BuOH, tert-butanol; lainnya adalah seperti Gambar 2a.

diberikan oleh sifat fisikokimia radikal sulfat. Dibandingkan dengan
radikal hidroksil yang waktu paruhnya dalam air hanya 10-9 s, Radikal
sulfat adalah urutan yang lebih stabil, dan bertahan beberapa detik43.
Selanjutnya radikal sulfat membawa yang negatif mengisi pada pH
fisiologis, dan karenanya dipengaruhi oleh repulsif kekuatan antara
dirinya dan kelompok karboksil yang dibebankan pada intermediet
TCA. Interaksi elektrostatik ini, bersamaan dengan hambatan sterik
disebabkan oleh dimensi spasial radikal sulfat yang lebih besar,
batasnya akses ke posisi reaktif pada intermediet TCA. Properti ini
batasi jumlah produk reaksi, setidaknya untuk stabil akhir produk reaksi
multi langkah yang terdeteksi dengan pengaturan kami (Tabel
Tambahan 6). Reaksi yang diamati meliputi dekarboksilasi, Reaksi
redoks oksidoreduktase seperti redoks dan dehidrasi, dan untuk
beberapa reaksi topologi seperti siklus TCA diperoleh. Misalnya,
suksinat bisa terbentuk dari sitrat, akonit, isocitrate dan α -ketoglutarat.
Reaksi ini menunjukkan hal serupa ketergantungan pada radikal sulfat
dan perilaku pendinginan serupa. Ini menyiratkan bahwa suksinat
terbentuk dalam siklus Krebs urutan reaksi yang dimulai dengan sitrat
diubah menjadi cisaconitate, yang kemudian diubah menjadi isocitrate,
α -ketoglutarat, semialdehida suksinik dan akhirnya suksinat.
Sebaliknya, pembentukannya dari piruvat dari sitrat tampaknya tidak
tergantung pada spesies radikal, sementara reaksi pembentukan piruvat
lainnya dihambat oleh pemulung radikal Dengan demikian, piruvat
kemungkinan terbentuk melalui lebih dari satu jalur reaksi.
Fakta bahwa hampir semua reaksi bergantung pada Kehadiran
radikal sulfat bisa menjadi indikasi lingkungan prebiotik di mana siklus
Krebs muncul. Meski reaktif Radikal sendiri belum dipelihara selama
miliaran tahun, Masih ada jejak tidak langsung dari kimia redoks sulfur
awal. Mikrofosil di batuan berumur 3,4 miliar tahun dari Australia Barat
adalah beberapa jejak awal kehidupan di Bumi, dan ditandai dengan
formasi mereka dalam pirit dan asal biotiknya44. Ini kontras dengan
glikolisis dan PPP, yang bergantung pada Fe (ii) tapi tidak pada spesies
belerang16. Pengamatan ini bisa memberi penerangan baru pada teori
endosymbiont. Sementara glikolisis dan PPP biasanya sitoplasma, pada
kebanyakan spesies eukariotik, baik siklus TCA dan perakitan gugus
sulfat besi terjadi di mitochondira45.
Bagaimana serangkaian reaksi non-enzimatik memungkinkan
terjadinya evolusi dari siklus Krebs, yang, dan juga kontradiktif dan
metabolit pengoksidasi, berperan dalam anabolisme dan mencakup
kunci reaksi co-factor-coupled? Untuk melengkapi siklus Krebs, C-C
reaksi pembentukan ikatan terhadap sitrat yang dihasilkan (dikatalisis
oleh sitrat sintase) diperlukan tapi ini hilang dari seri non-enzimatik.
Namun, siklus penuh atau reduktif hadir hanya dalam subset spesies
biologis, dan karenanya mungkin bukan awal evolusi titik untuk siklus
Krebs2,3. Memang, directionalitas oksidatif adalah hasil termodinamika
yang diharapkan untuk reaksi non-enzimatik. Reaksi bergantung pada
kofaktor membalikkan arah di sistem hidup dan mencegah sistem
mencapai kesetimbangan, Ini dianggap sebagai spesialisasi katalisis
enzimatik. Penutupan Siklus TCA melalui reaktivitas sitrat-sintase
berarti itu Keuntungan yang signifikan bisa diraih dengan
menambahkan hanya satu langkah enzimatik. Ini memberikan kasus
yang menarik untuk evolusi dari metabolisme enzim-dikatalisis.
Kemungkinan lain adalah itu versi pertama dari siklus Krebs bisa saja
heterotrofik di alam, dengan prekursor berasal dari bahan kimia
lingkungan Reaksi itu tidak lantas memiliki kemiripan dengan
metabolisme jalur14,15. Sebagai alternatif, penutupan awal siklus Krebs
mungkin terjadi tidak diperlukan jika reaksi oksidatifnya diberi makan
oleh yang lain reaksi seperti metabolisme, seperti karboksilasi piruvat
itu mengaktifkan kopling ke glikolisis awal. Adanya nonenzymatic
Reaksi piruvat karboksilase dapat menyatukan masalah utama
dimenjelaskan asal mula glikolisis, siklus PPP dan Krebs.
Singkatnya, kami menggambarkan saling kompatibel, efisien,
nonenzimati katalisis yang interkonversi intermediet siklus TCA.Reaksi
diaktifkan oleh radikal sulfat yang terbentuk pada
aktivasiperoxydisulfate. Jaringan kimia yang dihasilkan
mencakuptopologi bagian konservatif (oksidatif) dari siklus Krebs,dan
mencapai efisiensi karbon lebih dari 90%. Kesederhanaan kondisi
'lingkungan' ini, yang berbasis di sekitar pemersatu katalis sulfat,
menunjukkan bahwa siklus Krebs bisa muncul dari prekursor non-
enzimatik yang terbentuk secara spontan di adanya radikal sulfat.
Metode
Desain penelitian umum. Ukuran sampel. Eksperimen mengeksplorasi
yang tersedia ruang reaksi kimia dibatasi oleh kombinatorik: jumlah
Sampel dikalikan dengan setiap kondisi tambahan yang akan diuji.
Untuk mengatasi ini Kami menyederhanakan dan mengoptimalkan
persiapan sampel, kromatografi cair pemantauan reaksi selektif (LC-
SRM) dan analisis statistik untuk skrining tujuan, dengan
mengorbankan pengukuran tingkat reaksi yang tepat. Selanjutnya
Percobaan verifikasi, kami menggunakan lebih banyak metode intensif
sumber daya untuk optimal pemisahan kromatografi dan kuantifikasi
mutlak laju reaksi. Hal ini memungkinkan kami untuk mengukur lebih
dari 4.850 sampel bersamaan dengan 1.250 kontrol, standar eksternal
dan kekosongan, dan untuk menganalisa dan mengatur secara efisien
kromatogram LC-SRM 65.000 yang sesuai.
Replikasi dan deret waktu. Setiap laju reaksi dihitung berdasarkan deret
waktu bereksperimen dengan enam titik pengumpulan, yang dilakukan
setidaknya dalam tiga bereplikasi Tarif hanya dihitung untuk reaksi
yang menunjukkan signifikan akumulasi produk di ketiga ulangan
tersebut. Akibatnya, perhitungan tarif untuk satu reaksi di bawah kondisi
tertentu terdiri dari 18 titik pengukuran.
Sampel koleksi / titik akhir. Sampel poin dalam percobaan time-course
adalah biasanya diatur ke 0, 10, 30, 60, 120 dan 300 menit untuk
menutup keduanya relatif cepat dan lambat reaksi. Reaksi oksaloasetat
terhadap piruvat adalah satu-satunya yang juga cepat untuk interval ini
dan kami merancang setup eksperimental alternatif dengan Interval yang
lebih sempit mengikuti reaksi ini.
Kontrol kualitas dan outlier. Puncak diidentifikasi dengan mencocokkan
retensi waktu dan sifat fragmentasi secara eksternal diukur secara
kimiawi murni standar. Puncak otomatis memetik dan mengintegrasikan
transisi tertentu dengan MassHunter (Agilent) didukung oleh
pemeriksaan manual tambahan puncak (lihat bagian metode LC-SRM).
Kami mengendalikan kontaminasi silang dan dibawa-bawa dengan
pengukuran kosong berulang-ulang dan kontrol bebas-substrat.
Bahan. Metabolit standar diperoleh dengan kemurnian tinggi. Jika tidak
sebaliknya Diindikasikan, nomor produk mengacu pada Sigma-Aldrich:
natrium sitrat (71635), sodium isocitrate (I1252), asam cis-aconitic
(A3412), natrium α –ketoglutarat (K2010), natrium suksinat (14160),
semialdehida suksinik (Santa Cruz Bioteknologi, F1114), natrium
fumarat (F1506), asam l-malat (M6413), natrium piruvat (P2256), asam
oksaloasetat (O4126), besi asetat (339199), FeCl2 (372870), FeCl3
(157740), Fe (ClO4) 2 (334081), Fe (ClO4) 3 (309281), ferrocene
(F408), FeS (268704), H3PO4 (P5811), 2-mercaptoethanol (Merck
Millipore, 805740), sistein (30095), dl-etionin (E5139),
dimetilsulfoksida (D8418), homokistik asam (69453), NaHSO3 (Acros
Organics, 41944), metionin (M9375), amonium peroksidisulfat (Fischer
Scientific, 10219790), natrium sulfit Na2SO3 (Fischer Ilmiah,
10070400), natrium sulfat Na2SO4 (Fischer Scientific, 10493372).
Semua air diperoleh secara komersial dengan kemurnian yang sesuai
untuk kinerja ultra kromatografi cair (UPLC) dan spektrometri massa
(Biosolve Chemicals, Cat no. 23214102).
Metode LC-SRM untuk kuantifikasi metabolit TCA. Untuk
kuantifikasi TCA intermediet, sebuah Agilent 1290 Infinity Binary LC
sistem dengan online digabungkan Agilent 6460 triple quadrupole mass
spectrometer digunakan. Pemisahan sampel dicapai pada kolom Zorbax
Eclipse Plus C18 Rapid Resolution (1,8 μ m, 2,1 mm x 50 mm; suhu
kolom, 30 ° C; Agilent). Pelarut A yang terkandung 5% metanol, 0,2%
asam asetat dan 10 mM tributylamine dalam air kelas UPLC
(Greyhound) dan Pelarut B 100% metanol (Greyhound). Suntikan 1,5-
2,5 μ l sampel ke kolom pada 0,5 ml min-1 diikuti oleh gradien elusi
sesuai dengan kondisi gradien UPLC yang diberikan pada
Supplementary Tabel 7-11. Untuk setiap injeksi jarum dicuci dengan
air: asetonitril (2: 1) mengandung FlushPort untuk mencegah
pengambilan contoh. Termasuk mencuci dan re-equilibration, ini
menghasilkan waktu siklus antara 4,4 dan 16 menit, tergantung pada
kondisi gradien (Tabel Tambahan 7-11).
Kuantifikasi spektrometri kuantitatif produk spesifik dilakukan di mode
pemantauan reaksi multipel atau selektif (MRM atau SRM). Instrumen
parameter dan transisi metabolit untuk setiap fitur dioptimalkan dengan
menggunakan standar yang tersedia secara komersial (Tabel Tambahan
12 dan 13). Data spektrometri massa Tandem dianalisis dengan
menggunakan Masshunter Workstation (Agilent) melalui perangkat
lunak analisis QQQ-nya. Semua puncak yang terintegrasi secara
otomatis adalah dikurasi secara manual untuk memastikan kualitas dan
konsistensi data yang tinggi dengan teratur standar kontrol kualitas yang
diukur. Pengenceran standar eksternal yang diukur berulang kali seri
digunakan untuk penentuan konsentrasi metabolit absolut. Lebih lanjut
analisis dan pemasangan laju reaksi dilakukan di R (www.R-
project.org).
Penentuan laju reaksi. Untuk setiap ulangan, deret waktu yang
direkam digunakan untuk menentukan tingkat pembentukan produk
(akumulasi waktu-tergantung produk reaksi). Algoritma pemasangan
yang berbeda digunakan untuk menjelaskan Berbagai mode
pembentukan produk, disebabkan oleh kimia yang berbeda sifat
substrat, produk dan co-produk, serta efek lainnya sebagai stabilitas
menengah, perintah reaksi atau perubahan akibat reaksi terhadap
lingkungan kimia. Model yang digunakan adalah: (1) model linier
kuadrat terkecil untuk formasi produk kontinu; (2) model pertumbuhan
nonlinier, y = ae-b⋅c x, yang merupakan bagian dari modul SSgompertz
di R; (3) tingkat pertumbuhan awal maksimum dalam rentang linier
menggunakan model kuadrat terkecil, untuk digunakan untuk produk
dengan formasi dinamis / perilaku degradasi; dan (4) dan eksponensial
model peluruhan, y = a 2-bx + c. Model pas terbaik dipilih menurut
masing nilai koefisien determinasi (R2) dan telah dikonfirmasi dengan
meninjau secara manual kurva plotted.
Analisis statistik layar reaktivitas besi/sulfur. Daerah puncak mentah
diferensial data (Δ Xi = Xt = 300 - Xt = 0) antara t = 300 menit dan t = 0
menit dihitung dari daerah puncak LC-SRM individu yang diekstraksi
menggunakan perangkat lunak Masshunter (Agilent) dan merupakan
indikasi akumulasi produk (nilai positif) atau pemindahan substrat (nilai
negatif). Dengan asumsi distribusi normal, Kami kemudian menghitung
z-score (zi) (untuk representasi grafis, lihat Supplementary Gambar 5):
=
dengan σ (X) didekati oleh median absolut penyimpangan (MAD)
menurut: σ = MAD (X) × 1.4826. Nilai P dua ekor adalah kemudian
dihitung dari z-score dengan menggunakan fungsi distribusi normal, f
(x) dimana rata-rata populasi, μ, adalah 0 dan σ adalah 1:
Semua perhitungan dilakukan pada R dengan menggunakan fungsi
inbuilt standar, termasuk gila () dan pnorm (). Sebuah representasi grafis
dari hasil dapat ditemukan pada Gambar 2b dan Gambar Tambahan 6
Percobaan sedimen Archaean yang kaya zat besi. Substrat TCA (100
μ M) digabungkan dengan campuran logam kaya yang baru disiapkan
(200 μM FeCl2, 10 nM CoCl2, 400 nM NiCl2, 10 nM MoO4 dan 100 μ
M H3PO4) dalam atmosfer N2 rendah oksigen yang dihasilkan oleh tiga
siklus vakum / N2 berulang di ruang anoxic (Coy Lab Products).
Campuran kemudian disegel dalam botol kaca yang dirancang untuk
kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) (Agilent, 5182-0717 dan 5182-
0716), dan diinkubasi pada suhu 70 ° C dalam rendaman air. Untuk
semua substrat, selain oksaloasetat, sampel dikumpulkan setelah 0, 10,
30, 60, 120 dan 300 menit dengan pendinginan cepat di atas es. Hal ini
mengakibatkan pengukuran 486 sampel ditambah kontrol. Setelah
inkubasi, campuran reaksi dipindahkan ke 384-piring sumur (Greiner
Bio-One, 781186) dalam kondisi normoksik dan disimpan pada - 80 ° C
untuk pengukuran LC-SRM berikutnya dengan menggunakan Kondisi
gradien UPLC yang ditentukan pada Tabel Tambahan 7.
Efek logam individual. Untuk mengetahui kontribusi masing-masing
logam Untuk memfasilitasi interkonversi metabolit TCA spesifik, kami
menguji masing-masing penyusun simulasi sedimen Archaean untuk
katalitiknya. potensi. Penyiapan eksperimental yang sama seperti di atas
diterapkan, menggunakan isocitrate dan α -ketoglutarat sebagai substrat
dan mencampurnya dengan masing-masing logam secara terpisah (200
μM FeCl2, 200 μM FeCl3, 10 nM CoCl2, 400 nM NiCl2, 10 nM MoO4,
100 μMH3PO4) dibawah kondisi oksigen rendah; Kondisi normoksik
digunakan untuk Fe (iii). Substrat dan produk dalam 324 sampel
ditambah kontrolnya diukur melalui metode LC-SRM dengan
menggunakan kondisi gradien UPLC yang diberikan di Tabel Tambahan
8.
Campuran reaksi yang mengandung oksaloasetat dihasilkan dengan
menggabungkan oksaloasetat dengan FeCl2 pada konsentrasi yang sama
seperti yang disebutkan di atas tetapi di bawahmkondisi normoksik,
langsung diikuti dengan inkubasi pada suhu 40 ° C pada autosampler
dari sistem HPLC Agilent 1290. Alih-alih menghentikan reaksi es,
Sistem HPLC diprogram untuk secara otomatis menyuntikkan 1,5 μ l
sampel ke kolom setiap 5 menit sampai 2,5 jam. Ketiga ulangan untuk
kondisi FeCl2 dan Kontrol bebas besi diukur dengan urutan bolak-
balik. Substrat dan produk pada 113 sampel ditambah kontrol diukur
melalui metode LC-SRM dengan menggunakan Kondisi gradien UPLC
pada Tabel Tambahan 8.
Ketergantungan pada pH. Untuk mengetahui pengaruh pH terhadap
ferrous-iron-induced reaktivitas non-enzimatik, percobaan interkonversi
dilakukan dengan adanya buffering 5 mM natrium fosfat pada pH 3, 5,
6, 7, 8 dan 9, dengan cara yang serupa dengan eksperimen yang
dijelaskan dalam ref. 17. Selanjutnya, Campuran reaksi terdiri dari 100
μ M isocitrate (atau air sebagai kontrol) dan 200 μ M besi (ii) klorida
(Sigma-Aldrich, 372870). Awal yang benar pH dikontrol dengan
pengukuran awal, dan tetap konstan sepanjang inkubasi melalui
kapasitas penyangga buffer masing-masing. Substrat dan produk dalam
252 sampel, ditambah 56 kontrol, diukur dengan metode LC-SRM
menggunakan kondisi gradien UPLC pada Tabel Tambahan 9.
Pemutaran senyawa besi / belerang untuk dampak katalitiknya
terhadap TCA peralihan siklus. Untuk penyaringan spesies besi dan /
atau belerang yang aktif meningkatkan reaktivitas non-enzimatik antara
metabolit TCA, percobaan Penyiapan disesuaikan dengan format 96-
well. Sampel disiapkan dilapisi kaca96 piring sumur (Thermo Scientific,
60180-P300), disegel di bawah kondisi oksigen rendah dan juga
dikemas dengan vakum untuk mencegah kemungkinan dilakukannya
crosscontamination dengan baik. Substratnya (100 μM), sitrat, cis-
akonitat, suksinat, malat dan fumarat digunakan secara terpisah dan
dicampur dengan semua kemungkinan kombinasi sumber besi
(FeC2H3O2, FeCl2, FeCl3, Fe (ClO4) 2, Fe (ClO4) 3, ferrocene, FeS
dan kontrol bebas besi) dan spesies sulfur anorganik atau organik (2-
mercaptoethanol,
sistein, DL-etionin, dimetilsulfoksida, asam homocysteic, NaHSO3,
metionin, (NH4) 2S2O8, Na2SO3, Na2SO4 dan kontrol bebas
belerang); semua besi dan belerang ini Spesies digunakan pada 200 μ
M. Sampel dipanaskan sampai 70 ° C dalam pemandian air untuk 0 dan
300 min. Hal ini mengakibatkan total 1.320 sampel ditambah kontrol.
Sampelnya adalah kemudian dipindahkan ke piring 384-well (Greiner
Bio-One, 781186) di bawah normoksi kondisi dan disimpan pada - 80 °
C untuk pengukuran LC-SRM berikutnya dengan menggunakan Kondisi
gradien UPLC pada Tabel Tambahan 10.
Non-enzimatik TCA kualitatif dan kuantitatif (kinetik) validasi
percobaan. Berdasarkan analisis statistik zat besi / belerang Hasil
skrining, kami memilih interkonversi non-enzimatik yang paling
potensial kondisi dan diverifikasi mereka dalam percobaan deret waktu
dengan tiga ulangan menggunakan metode kuantifikasi spektrometri
massa yang ditargetkan secara menyeluruh. Substrat sitrat, isocitrate,
cis-aconitate, α -ketoglutarat, suksinat, Semialdehida suksinat, fumarat
dan malat diencerkan sampai 100 μM di UPLC grade air dan dicampur
dengan 200 μ M peroxydisulfate dengan adanya ketiadaan dari 200 μ M
ferrous sulfide (FeS). Sebagai analogi dengan eksperimen di atas, ini
Campuran disegel di bawah kondisi anoksik dan diinkubasi pada suhu
70 ° C dalam a pemandian air. Sampel dikumpulkan setelah 0, 10, 30,
60, 120 dan 300 menit dengan cepat pendinginan di atas es,
menghasilkan 432 sampel ditambah kontrol, yang dipindahkan ke 384
pelat sumur dan disimpan pada - 80 ° C untuk analisis LC-SRM
selanjutnya kondisi gradien UPLC yang diberikan pada Tabel
Tambahan 11.
Perhitungan pemulihan dan spesifisitas. Tingkat pemulihan dihitung
melalui hasil bagi metabolit TCA masing-masing pada timepoint t = 0
dan totalnya jumlah konsentrasi diukur setelah 2 jam inkubasi pada suhu
70 ° C. Jumlah produk pada timepoint t = 2 h dibagi dengan jumlah total
metabolit TCA (substrate + produk) dihitung untuk mengetahui
persentase spesifik Produk TCA Perhatikan bahwa kuantifikasi absolut
sitrat di hadapan peroxydisulfate (dan dengan itu tingkat pemulihan
yang dihitung) terhambat olehvarians yang luar biasa tinggi (koefisien
varians, CV = 25,6%) untuk metabolit ini karena mekanisme yang tidak
diketahui / gangguan kimia (varians rata-rata untuk semua fitur lain,
metabolit, dan tingkat pemulihan tetap rendah: CV = 3,48%).Untuk
alasan teknis ini, tingkat pemulihan dihitung untuk sitrat dan
efisiensinya Reaksi yang dimulai dari sitrat, memiliki ketidakpastian
yang lebih tinggi untuk nilai CV ini.
Perbandingan hidrogen peroksida dan peroksidisulfat sebagai
donor radikal untuk reaksi mirip TCA non enzimatik. Untuk
mengetahui potensi kontribusi Spesies radikal belerang terhadap
reaktivitas non-enzimatik yang difasilitasi oleh peroksidisulfat, kami
membandingkannya dengan radikal hidroksil yang dihasilkan dari
hidrogen peroksida. Dalam tiga ulangan, kita diinkubasi 100 μM sitrat,
isocitrate, cis-aconitate, alphaketoglutarat, suksinat, fumarat dan malat
dengan hidrogen peroksida 200 μ M atau 200 μ M peroksidisulfat pada
suhu 70 ° C di bawah kondisi anoksik dan sampel yang dikumpulkan
setelah 0, 10, 30, 60, 120 dan 300 menit (378 sampel ditambah kontrol)
dan mengukurnya melalui LC-SRM menggunakan kondisi gradien
UPLC pada Tabel Tambahan 11.

Percobaan pemulungan radikal sulfida dan hidroksil. Radikal

diferensial Sifat pemulungan 2-propanol dan ters-butanol dieksploitasi
untuk diuji pentingnya sulfat di atas radikal hidroksil. Dalam percobaan
ini, 200 μM peroksidisulfat dicampur dengan 100 μM sitrat, isocitrate,
cis-aconitate, α -ketoglutarat, suksinat, fumarat atau malat secara
individu dan masing-masing Kombinasi diolah dengan 500 μM 2-
propanol, 500 μ M tert-butanol atau air sebagai kontrol Sampel disegel
di bawah kondisi anoksik, dipanaskan sampai 70 ° C dalam rendaman
air dan diinkubasi selama 0, 10, 30, 60, 120 dan 300 menit (504 sampel
ditambah kontrol) dan kemudian diukur dengan analisis LC-SRM
kondisi gradien UPLC yang ditentukan dalam Tabel Tambahan 11.

Ketersediaan data. Data laju reaksi disediakan dalam table tambahan

1-5 dan data kuantifikasi mentah telah disimpan di gudang data
Mendeley.