• Absorbância;
Fonte:
http://www.labome.com.br/method/Protein-
Quantitation.html
Eletroforese de Proteínas (SDS-PAGE)
• Permite determinação da
massa molecular
aproximada.
Eletroforese de Proteínas
• Géis de polímero de acrilamida - poliacrilamida.
• Migração afetada pela massa-carga e forma da
proteína.
Eletroforese de Proteínas
SDS-PAGE
• Aproximação da massa
molecular para proteínas
desconhecidas.
Western blot (imunoblot)
Trabalhando com Proteínas
Como purificar uma proteína
Fracionamento
Diálise
•Solubilidade
Ultra filtração
•Tamanho
•Carga Coluna
Cromatografica
•Afinidade Ligação
Purificação Proteica: Isolamento
Extrato Bruto
Métodos Cromatográficos
Cromatografia em Coluna
o Afinidade;
• Resina:
o Trocadora de cátions (grupos aniônicos);
o Trocadora de ânions (grupos catiônicos).
Cromatografia de troca iônica
• Afinidade afetada:
o pH (determina o estado de ionização da molécula);
o concentração dos íons dos sais livres que competem
na solução circundante.
Cromatografia de exclusão por tamanho
• Ou gel-filtração.
• Separação por tamanho.
• Fase sólida: grânulos de polímero com
ligações cruzadas, com poros de tamanho
específico.
• Proteínas grandes saem da coluna antes que
as pequenas.
maiores menores
Cromatografia de afinidade
• Baseado na afinidade de
ligação.
C+ Ind S FT W1
Blue-Sepharose
Fosfocelulose
Coloração com Prata Western Blot
Anticorpos que
reconhecem
Poli-histidina!!!
Como produzir a proteína contendo
a cauda de poli-histidina?
Sistemas de Expressão
Representação Esquemática de um Vetor
de Expressão Procariótico
1 - Abundância
Nativa vs
Recombinante
Determinação da Estrutura
Tridimensional de Proteínas por
Difração de Raios-X
Níveis estruturais das proteínas
• A difração de raios-X
aplicada à análise de cristais
de macromoléculas
biológicas tem influenciado
a bioquímica estrutural,
tendo contribuído para o
conhecimento da estrutura
3D de proteínas, ácidos
nucleicos, vírus e outras
macromoléculas.
Padrão de difração dos raios x
Cristalografia de raios-x
2º Semestre de 2016