ABSTRAK: Reactive oxygen species (ROS) memainkan peran penting dalam pensinyalan seluler

sebagai second messengers. Namun, mempelajari peran ROS dalam redoks fisiologis sinyal
terhambat oleh kesulitan teknis dalam mengendalikan generasi mereka di dalam sel. Di sini, kita
memanfaatkan dua komponen inert, fotosensitizer dan cahaya, hingga memanipulasi dengan
sempurna generasi ROS intraseluler dan memeriksa peran spesifik mereka dalam mengaktifkan
dendritic cells (DCs). Photoswitchable generation intraseluler ROS yang mudah dibawa dengan
cepat diinduksi mobilisasi sitosolik Ca2+, aktivasi diferensial mitogen-activated protein kinases,
dan translokasi nuklir dari NF-κB. Selain itu, lonjakan ROS intraseluler transien bisa terjadi
mengaktifkan DC belum matang ke dewasa dan dengan potensi meningkatkan migrasi in vitro
dan in vivo. Akhirnya, kami mengamati bahwa intraseluler ROS-stimulated DCs meningkatkan
respons sel T spesifik antigen secara in vitro dan in vivo, yang menyebabkan pertumbuhan tumor
tertunda dan kelangsungan hidup yang berkepanjangan pada tikus pembawa tumor saat
diimunisasi dengan antigen tumor spesifik. Karena itu, lonjakan ROS intraseluler sementara
sendiri, jika dimanipulasi dengan benar, dapat menyebabkan DC yang belum matang untuk
berdiferensiasi menjadi keadaan motil dan bentuk matang yang cukup memadai Mengawali
respons sel T adaptif secara in vivo.

Reactive oxygen species (ROS), yang mencakup radikal oksigen reaktif bebas (misalnya, O2 •
dan OH-) dan oksidan nonradikal (misalnya H2O2), diproduksi selama respirasi mitokondria dan
respons seluler terhadap berbagai stimulasi seperti faktor pertumbuhan dan infeksi pathogen.
Meski kelebihan ROS menyebabkan stres oksidatif yang terjadi kerusakan makromolekul dan
berbagai penyakit termasuk kanker dan penuaan, peningkatan bukti menunjukkan bahwa ROS
juga berfungsi sebagai molekul sinyal penting dalam proliferasi sel, diferensiasi, dan
kelangsungan hidup.Secara khusus, ROS secara langsung terlibat dalam aktivasi berbagai jalur
sinyal seluler, seperti MAP kinase dan signaling cascades tirosin kinase melalui oksidasi residu
sistein redoks-sensitif protein target. Faktor transkripsi, termasuk AP-1 dan NF-κB, juga subjek
pada regulasi redoks dan menyebabkan banyak perubahan biologis, mulai dari merespons faktor
pertumbuhan untuk respon inflamasi. Jadi sekarang diterima secara luas bahwa ROS berfungsi
sebagai second messengers yang penting dari jalur pensinyalan intraselular.
Persinyalan ROS dihasilkan pada permukaan sel atau di dalam kompartemen intraselular oleh
beberapa oksidase NADPH di respon terhadap berbagai rangsangan dan kemudian masuk ke
dalam sitoplasma. Bukti terbaru menunjukkan bahwa ROS dapat disertakan secara khusus ke
dalam sel melalui plasma tertentu saluran aquaporin. Sebagai tambahan, generasi ROS
mitokondria telah hadir telah diatur dan diikutsertakan secara ketat pada sinyal sel fisiologis
dikaitkan dengan berbagai tekanan. Dalam sitoplasma, ROS intraselular berpotensi dimodifikasi
residu sistein lebih dari 500 protein, seperti yang diungkapkan oleh pendekatan proteomik skala
besar, sehingga mempengaruhi variasi proses biologis. Studi terbaru yang menyelidiki peran
biologi ROS intraselular, bagaimanapun, biasanya digunakan pendekatan teknis negatif
Kelemahan teknis penggunaan antioksidan kimia untuk mengais ROS termasuk tindakan
nonspesifik karena mereka memiliki beberapa target potensial diluar ROS.
Knockout tunggal gen dari enzim penghasil ROS juga ada keterbatasan karena ROS intraselular
dapat dihasilkan oleh banyak enzim yang merespons rangsangan spesifik. Penambahan eksogen
oksidan, seperti H2O2, ke sistem biologis dapat digunakan untuk memantau aktivasi ROS-
spesifik. Sejak waktu dan lokasi kimia ROS diatur dengan ketat dalam sistem kehidupan,
bagaimanapun, sulit untuk meniru sistem biologi melalui penambahan sederhana agen ROS atau
agen generating ROS. Mengingat kuantitas ROS bisa menentukan spesifisitas dan fungsi,
regulasi ketat ROS dalam waktu dan lokasi sangat penting untuk partisipasi mereka dalam
persinyalan sel fisiologis. Sebelumnya, beberapa teknik menarik ada telah dikembangkan untuk
menghasilkan ROS intraseluler sesuai permintaan dan dengan cara yang terkontrol menggunakan
cahaya dan photosensitizer, peptida organel spesifik dengan fotosensitif, atau generator hidrogen
peroksida yang difotokopi. Mereka menunjukkan bahwa photogeneration dikontrol dengan tepat
dari ROS menginduksi aktivasi diferensial MAP kinase, ekspresi gen seluler, dan migrasi. Di
sini, kami menerapkan teknologi ini untuk menyelidiki peran spesifik ROS intraselular diregulasi
fungsional dendritic cells (DC), pengawal penting mengatur sistem imun bawaan dan adaptif.
ROS telah terlibat dalam berbagai aktivitas fisiologis DC: perkembangan mereka dari progenitor
hematopoietik sel, diferensiasi dari monosit, maturasi dan presentasi antigen setelah rangsangan
eksogen, dan migrasi seluler. Namun, sebagian besar studi ini, seperti yang disebutkan di atas,
gunakan pendekatan teknis tidak langsung dengan menggunakan ROS scavengers atau sistem
gen tunggal untuk memodulasi peran yang spesifik ROS dalam fungsi DC. Untuk menyelidiki
apakah ROS intraseluler saja dapat memodulasi aktivitas DC, kami memeriksa respon seluler
dan kemampuan DC untuk menginduksi respons sel T antigen spesifik setelah mengatur
photogeneration ROS intraselular.

METODE
Tikus dan Sel. C57BL/10NAGCSnAi-(KO) Tikus Rag2 (H-2b) (Taconic Farms), tikus transgenik
OT-II TCR (H-2b) (Jackson Laboratorium), dan tikus C57BL/6 (H-2b) (Orient Bio) ditempatkan
dan dipelihara di fasilitas bebas patogen spesifik di Seoul National Universitas (SNU) Fakultas
Kedokteran. Percobaan hewan adalah dilakukan setelah disetujui oleh SNU IACUC (izin ID:
SNU-090805-5). Tikus yang mengandung tumor dikorbankan secara manusiawi saat tumor
mencapai 2 cm Garis sel MC38/CEA/Luc yang mengekspresikan CEA manusia dan luciferase
kunang-kunang dibudidayakan dan dipelihara di rumah Dubecco Modifikasi Eagle Medium
(DMEM; Welgene) ditambah dengan 10% serum bovine janin yang tidak aktif dan (FBS) dan
antibiotik. DC dihasilkan dari sumsum tulang 6 - 12-minggu Rag2 knockout tikus dan dikultur
seperti yang dijelaskan sebelumnya. Singkatnya, sel sumsum tulang dibilas dari femur dan tibia
dengan Iscove bebas serum. dimodifikasi medium Eagle (IMDM; Gibco Invitrogen). Sel tunggal
Suspensi kemudian disaring melalui saringan sel nilon (70-μm Mesh nilon; Biosciences BD);
dicuci dua kali dengan IMDM lengkap dilengkapi dengan mouse rekombinan GM-CSF (1,5
ng/mL), mouse IL-4 (1,5 ng/mL; PeproTech), penisilin (100 unit/ml), streptomisin (100 μg/mL),
gentamisin (50 μg/mL), glutamin L-glutamin (2 mM), dan β-mercaptoethanol (50 nM; Gibco
Invitrogen); dan diunggulkan pada konsentrasi sel 1 × 106 per sumur di piring 24-sumur di
volume akhir 2 mL media IMDM lengkap. Setengah dari medium itu diganti setiap hari dengan
volume yang sama lengkap IMDM medium selama 6 hari. Kultur DC in vitro ini berasal dari
tulang Sel sumsum dianalisis dengan flow cytometry, yang menunjukkan ciri khas hasil 90-93%
dari CD11c+ DCs.

HASIL DAN DISKUSI

Generasi ROS setelah fotosensitisasi Hematoporfirin di dalam DC.
Kami pertama mengukur pemuatan khasiat dari fotosensitizer, hematoporfirin (HP), dalam DC
setelah inkubasi di media kultur. Karena fotosensitator bisa dimasukkan ke dalam kompartemen
intraselular yang beragam dan memiliki sifat fluoresensi yang unik, kita mengukur ambilan
relatif HP di DC oleh flow cytometry dan lokalisasi dalam sel dengan mikroskop confocal
(Gambar 1A). HP itu cepat diambil oleh DC, terlokalisasi di seluruh sitoplasma dan nukleus, dan
jenuh setelah 1 jam inkubasi. Analisis imunofluoresensi menunjukkan bahwa HP hampir tidak
dilokalisasi dengan organel selular tertentu seperti endosom, lisosom, atau mitokondria (Gambar
Informasi Penunjang S1). Sebanyak 1 μg/mL fotosensitizer sudah cukup untuk label lebih dari
60% dari DC, dan 4 μg/mL sudah cukup untuk label hampir 100% dari DC (Gambar 1B). Setelah
1 jam inkubasi sel dengan 1 μg/mL HP, konsentrasi intraselular fotosensitizer adalah sel 0,66 ±
0,04 × 10-11 mol/106. Selanjutnya, photogeneration ROS intraselular diperiksa in vitro oleh
sinyal kehilangan phosphorescence di DC yang memuat dengan HP dan pewarna fluorescent
yang sensitif terhadap ROS, 2',7'-diklorodihidro-fluoresen dietetat (DCFDA) reaktif terhadap
H2O2 dan hidroksil Radikal (HO•), atau Responsif Singlet Oksigen Sensor Reagen Hijau
terhadap oksigen singlet (1O2). Saat diberi label DC terkena cahaya dari light emitting diode
(LED, puncak panjang gelombang 517 nm, output daya 3,1 mW/cm 2), kedua ROS-responsif
fluoresensi secara bertahap meningkat, menunjukkan photogeneration ROS di seluruh iluminasi
periode (Gambar 2A). Sebaliknya, sel tanpa photosensitizer tidak menunjukkan adanya
perubahan pada tingkat fluoresensi selama penerangan. DC penuh dengan jumlah HP yang
meningkat menghasilkan fluoresensi lebih intens pada paparan cahaya, menunjukkan korelasi
konsentrasi fotosensitizer dengan meningkatkan generasi ROS. Sebagai eksperimen kontrol,
kami juga diukur tingkat ROS intraseluler di DC diperlakukan dengan berbeda konsentrasi H2O2
eksogen setelah pelabelan sel dengan pewarna ROS-sensitive (Informasi Pendukung Gambar
S2). Konsisten dengan laporan sebelumnya, H2O2 intraselular dan sinyal radikal hidroksil
dengan cepat meningkat dan jenuh dalam semenit setelah penambahan H2O2 eksogen (Informasi
Pendukung Gambar S2A dan B). Relatif intensitas fluoresen yang mewakili H2O2 intraselular
dan tingkat radikal hidroksil meningkat 1,6-2,4 kali lipat tergantung pada konsentrasi H2O2
ditambahkan di media dan secara bertahap menurun pada 5 menit setelah inkubasi. Kadar yang
sama dari intensitas fluoresen bisa dicapai pada DC yang terisi HP Saat sel terkena cahaya
selama 3 sampai 6 menit tergantung dari jumlah HP yang digunakan untuk pelabelan (Informasi
Pendukung Gambar S2C). Perlu dicatat bahwa tidak ada induksi yang terdeteksi dari sinyal
oksigen singlet selama inkubasi dengan eksogen H2O2. Untuk memeriksa apakah peningkatan
ROS intraselular yang dihasilkan oleh photosensitizer di DC dapat menginduksi sinyal seluler,
kami memeriksa kadar kalsium intraselular, yang penting second messenger, dengan iluminasi
memuat DC dengan fotosensitizer dan pewarna fluoresensi kalsium-sensitif, Fluo-4 AM. Setelah
3 menit paparan cahaya, kadar kalsium intraselular meningkat dengan cara bergantung
konsentrasi HP (Gambar 2B), menunjukkan bahwa photogeneration ROS menginduksi
pensinyalan seluler. Menariknya, kalsium intraselular cepat menurun setelah mematikan LED
(Gambar 2C). Peningkatan reversibel kadar kalsium intraselular yang diamati dengan paparan
ulang terhadap LED, menunjukkan bahwa generasi yang dapat dipotret ulang ROS intraselular
dapat digunakan untuk memanipulasi kadar kalsium di DCs Berbeda dengan memuat DC
dengan 1 μg/mL photosensitizer, yang menunjukkan peningkatan bertahap intraselular, kalsium
pada paparan sinar yang berulang, Mobilisasi kalsium kuat diikuti oleh berkurangnya respons
kalsium dalam memuat DC dengan 4 μg/mL HP. Ini mungkin karena kematian sel dipicu oleh
pembuangan kalsium seluler dan generasi.ROS kuat. Meskipun terjadi perubahan konsentrasi
kalsium intraselular yang merupakan pemicu utama untuk beragam fungsi seluler, target
molekuler untuk regulasi kalsium reversibel oleh potensi redoks intraselular sebagian besar tidak
diketahui. Beberapa channel transient receptor potential (TRP) atau oksidasi langsung dari
sitoplasma cyteins di saluran kalsium mungkin bertanggung jawab atas perubahan reversibel
kalsium intraselular dengan pengatur oksidasi protein. Saluran TRPM2, berada pada vesikel
endolysosomal dalam DC dan dibutuhkan untuk pematangan DC dan migrasi, mungkin
merupakan regulator potensial dari pelepasan kalsium yang dimediasi ROS di DCs. Untuk
menetapkan rentang optimal photogeneration ROS untuk pensinyalan seluler, kami memantau
fotototoksisitas DC memuat dengan HP. The photosensitizer (sampai 4 μg/mL) tidak adanya
cahaya tidak menunjukkan adanya sitotoksisitas hingga 7 hari (Informasi Pendukung Gambar
S3A). Namun, viabilitas sel secara bertahap menurun dengan meningkatnya konsentrasi (1-8
μg/mL) fotosensitizer atau dengan panjang yang meningkat (1-10 menit) dari iluminasi 18 jam
setelah penerangan (Informasi Pendukung Gambar S3B). Pada sel yang diberi label lebih dari 2
μg/mL HP, kematian sel apoptosis meningkat secara signifikan antara 1 dan 2 jam setelah 3
menit iluminasi, yang diukur dengan pewarnaan annexin V (Informasi Pendukung Gambar S3C).
Sebaliknya, kami tidak melakukannya amati adanya perubahan kematian sel apoptosis setelah 3
menit iluminasi DC yang diberi label kurang dari 2 μg/mL fotosensitizer.
Induksi Aktivasi DC dan Migrasi yang Disempurnakan oleh Photogeneration dari ROS
Intraseluler.
Untuk memeriksa efek ROS intraselular photogenerated pada aktivasi seluler, DC yang
diinkubasi dengan 1 μg/mL HP terpapar untuk cahaya selama 3 menit, diinkubasi dalam gelap
selama poinwaktu terindikasi, dan kemudian dilisiskan untuk analisis aktivasi pensinyalan
(Gambar 2D). Bakteri lipopolisakarida (LPS), sebuah aktivator DC poten, digunakan sebagai
kontrol positif.
Kenaikan substansial fosforilasi p38 dan JNK MAP kinase diamati 10 menit setelah stimulasi
dan dipertahankan sampai 4 jam. Karena aktivasi p38 di DC memerlukan aktivasi apoptosis
pengatur sinyal kinase 1 (ASK1) oleh ROS, 33 yang memicu disosiasi tioredoksin dari kompleks
ASK1 yang tidak aktif, fosforilasi ASK1 juga diperiksa. Meski aktivasi ASK1 oleh lonjakan
ROS intraselular lebih lemah dari sel yang dirangsang dengan LPS, fosforilasi ASK1 meningkat,
memuncak pada 30 menit setelah stimulasi Sebaliknya, ERK mengalami dephosphorylation
cepat 30 menit setelah paparan cahaya dan secara bertahap disokong ulang sampai 4 jam. Pola
diferensial yang serupa aktivasi MAP kinase sebelumnya dilaporkan pada sel melanoma tikus
oleh photogeneration ROS intraselular.
Selain itu, kami mengamati sedikit peningkatan fosforilasi IκB dan translokasi nuklir NF-κB di
DC setelah iluminasi transien, menunjukkan aktivasi potensial DC oleh photogeneration ROS
intraselular (Gambar 2D). Tidak ada perubahan yang terdeteksi dalam molekul pensinyalan ini
dalam tidak adanya iluminasi (data tidak ditunjukkan). Karena kami mengamati aktivasi sinyal
seluler yang signifikan di DC dengan photogeneration transien ROS, pematangan DC diperiksa
dengan mengukur tanda permukaan (MHC II, CD40, CD80, CD86, CCR7, CCR5, dan E-
cadherin) pada 18 jam setelah 3 menit penerangan (Gambar 3A dan Pendukung Informasi
Gambar S4). Kenaikan substansial (lebih dari 2-lipat) penanda aktivasi (MHC II, CD40, CD80,
dan CD86) terdeteksi di DC setelah photogeneration intraseluler ROS (HP + light), bila
dibandingkan dengan kontrol yang tidak diobati (iDC) atau DC yang diolah dengan HP tanpa
penerangan (HP-light), meskipun proporsi sel yang diaktifkan adalah sekitar 20% lebih rendah
dari LPS-stimulated DCs (LPS). Kadar aktivasi DC (HP + light) tidak terpengaruh oleh
peningkatan konsentrasi HP (~ 8 μg/mL) atau dengan waktu pencahayaan yang diperpanjang
(~10 min; Supporting Informasi Gambar S5A dan B). Peningkatan aktivasi DC oleh lonjakan
ROS intraselular dibatalkan dengan pretreatment dari sel dengan antioksidan, N-actyl sistein
(NAC, 25 mM), menunjukkan bahwa aktivasi seluler dapat dimediasi oleh stres oksidatif
(Informasi Pendukung Gambar S5C). Selain penanda aktivasi, ekspresi kemokin reseptor dan
molekul adhesi juga berubah selama pematangan DC. Dari catatan, CCR7, bertanggung jawab
atas chemotactic migrasi DC dari jaringan meradang lokal ke pengeringan kelenjar getah bening,
diinduksi oleh ROS intraseluler sementara mirip dengan LPS (Gambar 3A). Sebaliknya, ekspresi
permukaan CCR5 dan E-cadherin, yang turun-diatur untuk dimobilisasi sel sentinel dari jaringan
yang meradang saat aktivasi, Turun di DC yang dirangsang dengan ROS intraselular atau LPS
(Gambar 3A).
Untuk memeriksa apakah ROS eksogen dapat menginduksi aktivasi DC, kami menambahkan
konsentrasi H2O2 yang berbeda dalam media kultur dan mengukur ekspresi penanda permukaan
aktivasi pada 18 jam setelah stimulasi ROS (Informasi Pendukung Gambar S5D dan E). Meski
viabilitas seluler cepat menurun dengan adanya lebih dari 2 mM H2O2, ekspresi penanda
permukaan aktivasi tidak berubah secara signifikan pada apapun konsentrasi H2O2, sesuai
dengan penelitian sebelumnya. Hasil ini menunjukkan bahwa DC responsif dan diaktifkan
dengan photosensitisasi HP intraselular namun buruk H2O2 eksogen. Saat sel dirangsang secara
transien
photogeneration ROS intraselular dengan LPS (LPS/HP + light), ekspresi permukaan penanda
aktivasi upregulated lebih lanjut (Gambar 3A). Pretreatment sel dengan NAC membatalkan
aktivasi penanda ekspresi permukaan yang disempurnakan di bawah kondisi rangsangan apapun,
menyarankan peran yang aktif dari stres oksidatif pada aktivasi DC (Supporting Informasi
Gambar S5F).

Kemampuan DC yang diaktifkan untuk bermigrasi ke organ sekunder limfoid dimana sel T naif
berada merupakan langkah penting dalam generasi respon sel T primer. Migrasi DC ke kelenjar
getah bening regional adalah proses kompleks yang terdiri dari beberapa langkah, termasuk
gerakan ke jaringan interstitium, masuk ke pembuluh limfatik, dan ekstravasasi dari sistem
limfatik ke kelenjar getah bening. Untuk menyelidiki efek ROS intraseluler pada migrasi DC,
kami menggunakan 3D gel kolagen untuk meniru lingkungan mikro interstisial, dan sel-sel
terkena gradien difusi CCL19, sebuah ligan untuk CCR7. Seperti ditunjukkan pada Gambar 3B,
kecepatan dan migrasi jarak DC (HP + light) meningkat secara signifikan saat dibandingkan
dengan iDC atau DC (HP-light) (p <0,0001). Peningkatan migrasi oleh photogeneration ROS
bahkan lebih baik lagi dibandingkan dengan DC (LPS) (p <0,0001) dan sebanding dengan DC
(LPS / HP +) (p = 0,7209). Namun, migrasi dari sel yang dirangsang oleh H2O2 eksogen mirip
dengan iDC.
Untuk memeriksa masuknya DC ke pembuluh limfatik, kita digunakan merangkak-dalam tes di
mana DC dengan fluoresensi diberi label
ditempatkan pada dermis eksplan telinga. Setelah diinkubasi selama 2 jam,
jumlah DC dilokalisasi dalam LYVE-1 + limfatik
kapal dihitung dan dibandingkan (Gambar 3C dan D). Sebagai
diamati dalam matriks kolagen 3D, migrasi ex vivo dari
DC menjadi pembuluh getah bening sangat meningkat
stimulasi ROS intraseluler (p <0,0001), sedangkan pengobatan photosensitizer tanpa iluminasi
atau H2O2 eksogen
stimulasi tidak. Untuk mengkonfirmasi peningkatan migrasi DC
in vivo, kami menggunakan dua metode yang berbeda. Pertama, kita langsung
disuntikkan HP (1 μg dalam 20 μL garam buffer fosfat, PBS)
ke dalam kulit telinga, tinggalkan di kandang gelap selama 2 jam, dan kemudian
menyinari tempat suntikan selama 3 menit. Kelompok termasuk tikus
disuntikkan dengan PBS (20 μL) plus iluminasi (PBS), photosensitizer tanpa iluminasi (HP-
light), LPS (1 μg dalam 20 μL
dari PBS), LPS ditambah HP dengan penerangan (lampu LPS / HP +), dan
H2O2 (300 μM di PBS). Pada titik waktu yang ditunjukkan, telinga
epidermis di tempat suntikan diperiksa untuk distribusi
sel Langerhans perumahan, subtipe DC epidermal
(Gambar 4A dan B). Grup dirangsang dengan HP + light, LPS, atau
Lampu LPS / HP + menunjukkan pengurangan bertahap jumlah
Sel Langerhans sampai 4 hari setelah injeksi, dan jumlahnya
Sel sembuh total pada 14 hari setelah injeksi. Itu
Tingkat reduksi DC paling dramatis pada tikus yang dirangsang
dengan lampu HP +, sedangkan tidak terjadi perubahan signifikan pada
kelompok kontrol (PBS, HP-light, atau H2O2). Kedua,
DC berlabel fluoresensi dirangsang dengan agen yang ditunjukkan
disuntikkan di footpads tikus, dan getah poplitea mereka
Simpul dianalisis sampai 2 hari setelah injeksi untuk diperiksa pada
migrasi vivo DC (Gambar 4C dan D). Sekali lagi, kami mengamati a
Kenaikan yang lebih cepat dari DC yang diberi label fluorescence di popliteal
kelenjar getah bening saat sel dirangsang dengan ROS intraselular,
dibandingkan kelompok kontrol (Gambar 4D). Kami mengkonfirmasi
meningkatkan migrasi DC ke zona sel T kelenjar getah bening oleh
imunohistokimia (Gambar 4C). Konsisten dan
Peningkatan migrasi chemotactic dari DC yang dirangsang oleh
Lonjakan ROS intraselular transien dengan jelas menunjukkan bahwa ROS intraselular itu
sendiri cukup untuk menginduksi DC berkembang menjadi keadaan dewasa dan motil, sehingga
meningkatkan kemotaks
efisiensi. Sebelumnya, lonjakan ROS intraselular13 dan pengion
radiasi (berpotensi oleh generasi ROS) 41 diperlihatkan
untuk meningkatkan motilitas sel kanker dan migrasi DC kutaneous,
masing, namun jauh lebih sedikit yang diketahui tentang perubahan dalam
program genetik yang mengendalikan migrasi DC selama aktivasi.42,43 Mekanisme migrasi
yang lebih rinci
DC dengan stimulasi ROS intraseluler perlu diikuti.
Induksi Imunitas Adaptif dan Antitumor
Tanggapan oleh Intraselular ROS-Stimulated DCs. Sejak
DC matang yang mampu memprioritaskan sel T naif tidak hanya mengekspresikan
molekul costimulatory pada permukaannya tetapi juga menghasilkan
sitokin inflamasi seperti IL-12,16 kita juga diperiksa
sitokin proinflamasi yang dihasilkan oleh kultur DC yang distimulasi dengan lonjakan ROS
intraselular dan diamati secara substansial
jumlah sitokin inflamasi seperti IL-6, IL-10, IL-12,
serta TNF-α disekresikan ke media kultur
(Informasi Pendukung Tabel S1). Menimbang bahwa DC
dirangsang dengan H2O2 eksogen terbukti gagal untuk mengungkapkan
sitokin ini kecuali TNF-α, 44 data kami saat ini dikonfirmasi
ROS intraselular yang dihasilkan oleh photosensitisasi HP ini
lebih kuat daripada H2O2 eksogen dalam mengaktifkan DC. Untuk
Selidiki apakah DC dirangsang dengan transien intraselular
Lonjakan ROS dapat menginduksi imunitas adaptif, distres DC
Dibujuk secara in vitro dengan sel CD4 + T dari tikus OT-II di
kehadiran OVA323-339. Analisis flow cytometry menunjukkan a
secara signifikan meningkatkan jumlah CD4 + T yang mensekresikan IFN
Setelah inkubasi dengan DC (HP + light), DC (LPS), atau DC (LPS /
HP + light) dibandingkan dengan iDC atau DC (HP-light) (Gambar 5A,
panel atas dan Informasi Pendukung Gambar S6A).
DC (LPS) secara signifikan menginduksi sel T CD4 + yang mensekresi IFN-γ
ke tingkat yang lebih besar dari DC (HP + light). Kami juga memeriksa tanggapan Th1 / Th2
dalam kultur sel T CD4 + DC oleh
mengukur sitokin dalam supernatan budaya (Supporting
Informasi Gambar S7). Tingkat IFN-γ dan IL-4 secara signifikan
meningkat dan menurun, masing-masing, pada 72 jam setelah inkubasi
dengan lampu DC (HP + light), DC (LPS), atau lampu DC (LPS / HP +) dibandingkan dengan
iDC atau DC (HP-light), menunjukkan bahwa
DC yang dirangsang menginduksi respons Th1 yang manjur secara in vitro. Kapan
Tikus OT-II diimunisasi dengan DC yang sarat dengan OVA323-339
in vivo, frekuensi sel T CD4 + yang mensekresi IFN di Indonesia
Limpa juga meningkat secara signifikan pada 7 hari setelah detik
imunisasi di DC (HP + light), DC (LPS), atau DC (LPS / HP
+ cahaya) -vaksinasi dibandingkan dengan kelompok iDC atau DC (HPlight) yang diimunisasi
(Gambar 5A, panel bawah dan
Informasi Pendukung Gambar S6B). Perlu dicatat bahwa
frekuensi sel CD4 + T yang mensekresikan IFN-in di DC (HP + light) -
tikus yang diimunisasi sebanding dengan kelompok DC (LPS)
setelah in vivo imunisasi.
Untuk lebih membuktikan signifikansi fungsional adaptif
Kekebalan yang dihasilkan oleh DC dirangsang dengan intraseluler
Lonjakan ROS, kami mengimunisasi tikus dengan DC penuh dengan tumor
antigen, antigen carcinoembryonic (CEA) -dari sel T
epitopes.45,46 Pada 7 hari setelah imunisasi DC dua kali pada a
interval mingguan, tikus yang diimunisasi dengan DC (HP + light) menunjukkan
tingkat sel T CD4 + dan CD8 + T CEA yang spesifik
tanggapan terhadap kelompok yang diimunisasi dengan DC (LPS) dan
Lampu DC (LPS / HP +) (Gambar 5B). Frekuensi IFN-γ-
mensekresikan sel CD4 + dan CD8 + T di limpa imunisasi
kelompok kira-kira 2 sampai 3 kali lipat lebih tinggi dari pada tikus
diimunisasi dengan iDC dan DC (HP-light). Selain itu, DC (HP
+ cahaya), DC (LPS), atau DC (LPS / HP + light) yang diinduksi vaksinasi
Respons CTL sel spesifik tumor yang efisien dibandingkan dengan iDC
atau DC (HP-light) (Gambar 5C). Hasil ini menunjukkan bahwa DC yang distimulasi hanya
dengan ROS intraseluler transien dapat menginduksi
Respon sel T spesifik antigen seefisien stimulasi LPS
DC setelah imunisasi berulang. Konsisten dengan
induksi imunitas sel T sistemik oleh DC dirangsang
dengan ROS intraselular, CEA-mengekspresikan pertumbuhan tumor itu
tertunda secara signifikan pada tikus yang diimunisasi dengan DC (LPS / HP
+ cahaya), bila dibandingkan dengan tikus yang diimunisasi dengan iDC (p =
0.0001) (Gambar 6A dan B). Meskipun DC (LPS)
Imunisasi menunjukkan sedikit peningkatan penekanan tumor
pertumbuhan dari DC (HP + light) (p = 0,1035), DC (lampu LPS / HP +)
lebih unggul dari DC (LPS) (p = 0,0683) dan DC (HP + light) (hlm
<0,0001). Sehubungan dengan hasil tersebut, DC (HP + light)
Imunisasi secara signifikan memperpanjang masa kelangsungan hidup rata-rata
untuk 38 hari dari 33 hari tikus tumor-bantalan, dibandingkan dengan
kelompok kontrol, iDC dan DC (HP-light) (p = 0,002 dan 0,0026
masing; Gambar 6C). Masa kelangsungan hidup rata-rata lebih jauh
diperpanjang sampai 50 hari pada tikus yang diimunisasi dengan DC (LPS / HP
+ cahaya). Oleh karena itu, fotogenerasi transien intraseluler
ROS dapat menginduksi aktivasi fungsional DC menjadi prima
tanggapan sel T spesifik antigen dan protektif in vivo dan
meningkatkan keampuhan vaksin DC bila dikombinasikan dengan a
adjuvant imun konvensional.
Photogeneration dari ROS telah lama dipekerjakan di lapangan
terapi fotodinamik untuk pengobatan kanker, 47 tapi paling banyak
penelitian telah berfokus pada efek langsung pada kematian sel
jalur 22 dan efek inflamasi tidak langsung pada antitumor
imunitas.23 Di sini, kami menerapkan teknologi ini secara baru
arah: manipulasi terkontrol dan fungsional DC, a
sel antigen-presenting kuat yang mengatur bawaan dan bawaan
kekebalan adaptif.16 Meskipun beberapa penelitian menunjukkan hal itu
photogeneration terkontrol ROS dalam sel mamalia dapat
Digunakan untuk memanipulasi sinyal dan fungsi seluler, 12,13 no
laporan lain untuk pengetahuan kami menunjukkan fungsional
modulasi DC oleh generasi ROS intraseluler yang dapat diputar meski perannya penting dalam
sistem kekebalan tubuh. Oleh
menggunakan dua komponen inert, photosensitizer dan cahaya,
photogeneration transient ROS intraseluler dapat secara efisien
menginduksi aktivasi dan pematangan DC tanpa signifikan
kematian sel. Menarik untuk dicatat bahwa inkubasi DC
Dengan H2O2 eksogen juga meningkat dengan cepat H2O2 intraselular
atau radikal oksigen dengan kinetika dan amplitudo yang berbeda
dibandingkan dengan yang dihasilkan oleh photosensitisasi HP
(Informasi Pendukung Gambar 2) namun gagal menginduksi DC
pengaktifan. Selain itu, H2O2 eksogen tidak menghasilkan
oksigen singlet intraselular, yang terbentuk secara efisien oleh
fotosensitisasi Meski tetap tidak mungkin
Membedakan antara efek pensinyalan oksidatif yang berbeda
ROS, akan ada kemungkinan radikal bebas dan oksigen singlet
dapat memediasi efek diferensial pada sinyal seluler di vivo.48
Meskipun demikian, pendekatan kita saat ini mungkin tidak hanya menyediakan a
alat berharga untuk mempelajari peran ROS intraseluler di
sel redoks sinyal sel kekebalan tubuh, tetapi juga memberikan kontribusi untuk
pengembangan bahan pembantu vaksin yang efektif yang dimanipulasi
sistem kekebalan tubuh.