KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Dalam analisis kimia suatu bahan, maka akan sering

dihadapkan pada pekerjaan-pekerjaan seperti menghilangkan

konstituen pengganggu atau mengisolasikannya maupun memekatkan

konstituen yang dikehendaki sebelum dilakukuan identifikasi maupun

pengukuran jumlahnya. Untuk melakukan analisis kimia tersebut

maka kita harus menggunakan suatu metode agar dapat

menentukan hasil yang tepat, kromatografi salah satunya, dan dapat

pula digunakan sebagai analisa secara kuantitatif.

Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara

lama yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran

yang rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini

kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High Performance

Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja

Tinggi.

Salah satu metode pemisahan yang memerlukan biaya paling

murah dan memakai peralatan sangat sederhana ialah kromatografi

lapis tipis preparatif (KLTP). Walaupun KLTP dapat memisahkan

dalam jumlah gram,sebagian besar pemakaian hanya dalam jumlah

miligram. KLT preparatif dilakukan dengan menggunakan lapisan tebal

(sampai 1 mm) sebagai pengganti lapisan penyerap yang tipis

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan metode isolasi

yang sudah lama popular karena metode ini telah digunakan secara

universal oleh mahasiswa dan peneliti-peeliti bahan alam. Selain itu

metode ini tidak memerlukan biaya pengerjaan yang mahal. Ini

menjadi nilai tambah dari metode kromatografi lapis tipis preparative.

Prinsip kerja dari metode kromatografi lapis tipis preparatif,

adalah dimana proses isolasi berdasarkan perbedaan daya serap

dengan kecepatan yang berbeda sehingga terjadi pemisahan.

B. Rumusan Masalah

1. Apa defenisi umum dan bagaimana prinsip kerja dari Kromatografi

Lapis Tipis Preparatif ?

2. Apa hasil yang dapat diperoleh dari metode Kromatografi Lapis

Tipis Preparatif ?

C. Maksud dan Tujuan Praktikum

1. Maksud

Adapun maksud dari praktikum ini yaitu Untuk mengisolasi

komponen kimia dengan menggunakan metode Kromatografi Lapis

Tipis Preparatif pada daun bagore (Caesalpinia crista L.)

2. Tujuan

Adapun tujuan percobaan ini yaitu untuk memisahkan

senyawa kimia fraksinasi kasar daun bagore (Caesalpinia crista L.)

menggunakan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif berdasarkan

warna dan tingkat kepolaran.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

D. Manfaat Praktikum

Adapun manfaat dari praktikum ini yaitu praktikan dapat

mengetahui prinsip dan mekanisme kerja Kromatografi Lapis Tipis

Preparatif dalam memisahkan senyawa dengan berbagai

perbandingan eluen dari kepolaran rendah hingga kepolaran yang

tinggi.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Uraian Tanaman

Klasifikasi Ilmiah (Itis,Gov,2014)

Kingdom : Plantae (Tumbuhan)

Subkingdom : Tracheobionta (Tumbuhan berpembuluh)

Super Divisi : Spermatophyta (Menghasilkan biji)

Divisi : Magnoliophyta (Tumbuhan berbunga)

Kelas : Magnoliopsida (berkeping dua / dikotil)

Sub Kelas : Rosidae

Ordo : Fabales

Famili : Caesalpiniaceae

Genus : Caesalpinia

Spesies : Caesalpinia crista L.

Nama simplisia : Daun Bagore

Kandungan kimia : Alkaloid, karbohidrat, glikosida, tannin,

flavonoid, dan kumarin

B. Metode Isolasi

Isolasi adalah proses pemisahan komponen kimia yang

terdapat dalam suatu ekstrak. Hal ini dilakukan ketika ingin mengambil

bahan aktif dari ekstrak kasar (crude extract) (Skalika-Wozniak et al,

2008).

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Kromatografi merupakan suatu proses pemisahan yang mana

analit-analit dalam sampel terdistribusi antara dua fase, yaitu fase

diam dan fase gerak. Fase diam dapat berupa bahan padat atau

porus dalam bentuk molekul kecil atau dalam bentuk cairan yang

dilapiskan pada pendukung padat atau dilapiskan pada

dinding kolom. Fase gerak dapat berupa gas atau cairan. Jika gas

digunakan sebagai fase gerak, maka prosesnya dikenal sebagai

kromatografi gas. Dalam kromatografi cair dan juga kromatografi lapis

tipis, fase gerak yang di gunakan selalu cair (Rohman,2009).

Kromatografi dapat dibedakan atas berbagai macam,

tergantung pada pengelompokannya. Berdasarkan pada

mekanisme pemisahannya, kromatografi dibedakan menjadi

(Rohman, 2009):

a. Kromatografi adsorbsi

b. Kromatografi partisi

c. Kromatografi pasangan ion

d. Kromatografi penukar ion

e. Kromatografi ekslusi ukuran

f. Kromatografi afinitas

Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran

berdasarkan perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh

senyawanya. Perbedaan yang dapat dimanfaatkan meliputi kelarutan

dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Fase gerak membawa

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fase diam akan

berikatan dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-

beda. Jenis kromatografi yang berlainan bergantung pada perbedaan

jenis fase, namun semua jenis kromatografi tersebut berdasar pada

asas yang sama (Bresnick, 2012).

Kromatografi lapis tipis digunakan untuk pemisahan senyawa

secara cepat, dengan menggunakan zat penjerap berupa serbuk

halus yang dipaliskan serta rata pada lempeng kaca. Lempeng yang

dilapis, dapat dianggap sebagai “kolom kromatografi terbuka” dan

pemisahan dapat didasarkan pada penyerapan, pembagian atau

gabungannya, tergantung dari jenis zat penyerap dan cara pembuatan

lapisan zat penyerap dan jenis pelarut. Kromatografi lapis tipis dengan

penyerap penukar ion dapat digunakan untuk pemisahan senyawa

polar. Harga Rf yang diperoleh pada kromatografi lapis tipis tidak

tetap, jika dibandingkan dengan yang diperoleh pada kromatografi

kertas. Oleh karena itu pada lempeng yang sama di samping

kromatogram zat yang di uji perlu dibuat kromatogram zat

pembanding kimia, lebih baik dengan kadar yang berbeda-beda

(Dirjen POM, 1979).

Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara

lama yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran

yang rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini

kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High Performance

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Thin-layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja

Tinggi (Munson, 2010).

Perbandingan jarak perambatan suatu zat dengan jarak

perambatan fase bergerak di hitung dari titik penotolan larutan zat,

dinyatakan dengan Rf (Retondary factor) zat tersebut. Perbandingan

perambatan suatu zat dengan jarak perambatan zat pembanding

dinyatakan dengan Rr (Anonim, 2012).

Jarak perambatan noda

Rf = ------------------------------------

Jarak perambatan eluen

Teknik kromatografi lapis tipis (KLT) dikembangkan oleh Egon Stahl

dengan menghamparkan penyerap pada lempeng gelas, sehingga

merupakan lapis tipis. KLT merupakan kromatografi serapan, tetapi dapat

juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah dilapisi

air dari udara (Sudjadi, 1986).

Ada beberapa macam silika gel yang beredar, diantaranya

(Sudjadi, 1986) :

1. Silika gel dengan pengikat.

2. Silika gel dengan pengikat dan indikator fluoresensi.

3. Silika gel tanpa pengikat.

4. Silika gel tanpa pengikat tapi dengan indikatorberfluoresensi.

5. Silika gel untuk keperluan pemisahan preparatif.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Metode identifikasi. Untuk melihat senyawa tak berwarna pada

lempeng, biasanya digunakan metode berikut (Sudjadi, 1986) :

1. Metode kromatogram di bawah sinar ultraviolet (254 atau 366 nm).

a. Pada lapisan berflouresensi,misalnya Silica Gel GF254, bercak

muncul sebagai noda hitam.

b. Untuk senyawa berflouresensi digunakan lapisan biasa, bercak

terlihat berflouresensi.

2. Menyemprot dengan pereaksi yang menghasilkan warna dan atau

berflouresensi.

Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu

metode yang memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai

peralatan paling dasar. Walaupun KLTP dapat memisahkan bahan

dalam jumlah gram, sebagian besar pemakainya hanya dalam jumlah

miligram.KLTP bersama-sama dengan kromatografi kolom terbuka,

masih dijumpai dalam sebagian besar publikasi mengenai isolasi

bahan alam (Hostettmann, 2006).

Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada

KLTP adalah sekitar 0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20

x 20 cm atau 20 x 40 cm. Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran

pelat sudah tentu mengurangi jumlah bahan yang dapat dipisahkan

dengan KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan ialah silika gel

dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun

campuran senyawa hdrofil (Hostettmann, 2006).

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum

ditotolkan pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri (

heksana, diklorometana, etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri

akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi cuplikan harus sekitar 5% -

10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus sesempit mungkin

karena pemisahan tergantung pada lebar pita (Szekely 1983).

KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan

yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan

dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus

dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius (misalnya

Adolf dkk. 1982). Kekurangan yang lainya ialah jangka waktu yang

diperlukn untuk pemisahan dan adanya pencemar dan sisa dari pelat

sendiri setelah pengekstrasian pita yang mengandung senyawa yang

dipisahkan dengan pelarut (Szekely 1983).

Untuk mengatasi beberapa masalah tersebut, beberapa

pendekatan yang melibatkan kromatografi sentrifugal telah dicoba.

Pada prinsipnya kromatografi sentrifugal adalah kromatografi klasik

dengan aliran fase gerak yang dipercepat oleh gaya sentrifugal

(Szekely 1983).

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

BAB III

PROSEDUR KERJA

A. Alat dan Bahan

1. Alat

Alat yang digunakan adalah batang pengaduk panjang, botol

UC Bekas, cawan porselin, chamber KLTP, corong kaca, gelas

kimia, gelas ukur, kertas saring, lempeng 7 x 0,5 cm, lampu UV 254

dan 366 nm, lempeng KLTP, pipa kapiler, pipet tetes, statif,

timbangan analitik, vial.mistar, dan sendok tanduk besi.

2. Bahan

Bahan yang digunakan adalah aluminium foil, fraksi

methanol daun bagore (Caesalpinia crista L.), etil-Asetat, kapas,

kertas saring, methanol, n-Hexan, silica gel kasar dan halus, tisu.

B. Prosedur Kerja

Disiapkan alat dan bahan. Dipilih hasil fraksi yang terelusi

dengan baik pada kromatografi kolom konvensional dan kromatografi

kolom cair vakum. Kemudian masing-masing fraksi yang telah dipilih

dilarutkan dengan eluen dan ditotolkan pada lempeng KLTP

menggunakan pipa kapiler. Selanjutnya dielusi dalam chamber yang

berisi eluen n-heksan:etil (8:2) yang telah jenuh. Kemudian dibiarkan

terelusi, selanjutnya diamati penampakan bercak noda pada lampu

UV 254 dan 366 nm. Dan dilakukan uji antioksidan dengan pereaksi

DPPH.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

BAB IV

HASIL PENGAMATAN

A. Tabel Pengamatan

NO Fraksi Jumlah Pita Warna

Kromatografi Kolom Kuning dengan
1 2
Konvensional (KKK) Latar Ungu
Kromatografi Cair Vakum Kuning dengan
2 2
(KCV) Latar Ungu

B. Gambar Hasil Pengamatan

Hasil Praktikum

Gambar Hasil Pengamatan

a. Gambar dari fraksi KKK dan KCV

KKK KCV

UV 366

Dari gambar pengamatan tersebut diperoleh 2 pita untuk fraksi

KKK dan 2 pita juga dari Fraksi KCV yang bersifat antioksidan

dimana ditandai dengan pita warna kuning dengan latar belakang

ungu setelah disemprotkan DPPH.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

C. PEMBAHASAN

Kromatografi Lapis Tipis merupakan teknik pemisahan cara lama

yang digunakan secara luas, terutama dalam analisis campuran yang

rumit dari sumber alam. Tetapi dalam kuantisasi belakangan ini

kromatografi lapis tipis digantikan oleh “HPLC” (High Performance Thin-

layer Chromatography) atau Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi.

Pada percobaan ini dilakukan identifikasi sampel ektrak Daun

bagore menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif. Dimana

metode ini KLTP klasik mempunyai beberapa kekurangan, kekurangan

yang utama adalah pengambilan senyawa dari pelat yang dilanjutkan

dengan pengekstrasian dari penjerap. Jika senyawa beracun harus

dikerok dari pelat, dapat menimbulkan masalah yang serius.

Pada pengerjaan pertama, alat dan bahan yang akan digunakan

siapkan agar dapat meminimalisir dan memperlancar proses pengerjaan.

selanjutnya penyiapan pelarut dari n-heksan: etil (8:2). Hal ini dilakukan

agar dapat mengetahui apakah sampel dapat membentuk fraksi yang baik

atau terelusi dengan baik.

Pada metode Kromatogrfi kolom konvensional dipilih fraksi pada

vial nomor 22 sebagai fraksi yang akan ditotolkan di Lempeng KLTP. Dan

pada metode kromatografi cair vakum dipilih fraksi pada perbandingan 6:4

sebagai fraksi yang akan ditotolkan di Lempeng KLTP.

Selanjutnya disiapkan serangkaian alat kromatografi kromatografi

lapis tipis preparative. Dimana terdapat chamber berukuran besar untuk

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

menampung eluen dengan panjang 20x20 cm untuk membentuk pita

noda, yang akan diambil atau dikeruk sebagai isolate.

Pada percobaan ini, merupakan percobaan berkelanjutan, dimana

hasil penetolan eluen yang cocok berdasarkan data hasil pengamatan

pada percobaan kromatogrfai cair vakum yaitu pada fraksi ke 4 dengan

menggunakan eluen n-heksan: etil (1:1). Selanjutnya digunakan lempeng

kltp untuk mendeteksi pembentukan pita yang sebelumnya telah ditotolkan

hasil campuran fraksi dan eluen n-heksan: etil (8:2). Setelah itu dielusi

pada chamber dan menghasilkan pita noda.

Kemudian diamati pada lampu UV. Dari hasil pengamatan noda

atau pita dapat terlihat pada lampu UV 254 dan juga UV 366. Terdapat 2

pita yang terbentuk pada lempeng KLTP untuk metode KKK dan KCV

setelah disemprotkan dengan DPPH. Kemudian pada metode KKK dan

KCV dikeruK lurus pita panjang berwarna kuning pada bagian yang tidak

di semprotkan dengan DPPH.

Hasil pengerukan kemudian disimpan kedalam vial dan hasil

pengamatan pada percobaan KLTP akan dilanjutkan pada percobaan

selanjutnya dengan cara sentrifuge untuk mengetahui dengan pasti

senyawa yang terbentuk pada lempeng.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

BAB V

KESIMPULAN

A. Kesimpulan

Dari hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa dengan

menggunakan metode kromatografi lapis tipis preparatif 2 noda atau

pita yang terbentuk dengan optimal yaitu dengan menggunakan eluen

n-heksan: etil perbandingan (8:2) pada sampel ekstrak daun bagore.

B. Saran

Sebaiknya alat-alat di laboratorium harus ditambah agar dapat

meminimalkan dan mengefisienkan waktu praktikum. Terutama alat

yang berhubungan dengan praktikum ini.

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
 KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

DAFTAR PUSTAKA

Anonim., 2012, ”Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 2”,

Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.

Anonim., 2015, ”Penuntun dan Buku Kerja Praktikum Fitokimia 2”,

Fakultas Farmasi, Universitas Muslim Indonesia, Makassar.

Bresnick, Stephen., 2002. Intisari Fisika.Hipokrates.Jakarta

Ditjen POM., 1979 ” Farmakope Indonesia edisi III Depkes Ri : Jakarta

Munson, James,W., 2010. Analisis Farmasi. Airlangga University Press:

Surabaya

Sudjadi, Drs., 1986, “Metode Pemisahan”, UGM Press, Yogyakarta.

Hostettmann. M, Hostettmann. K, Marston. A., cara kromatografi

preparatif, 1995. ITB Bandung

Rohman, Abdul., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar. : Jakarta

Skalicka-Woźniak, 200, Isolation of the new minor constituents

dihydropyranochromone and furanocoumarin from fruits of
Peucedanum alsaticum L. by high-speed counter-current
chromatography, Journal of Chromatography A 1216 (30)
: 5669- 5675

Http :// www.itis.com

(diakses Makassar, 26/04/2015 20:00)

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS PREPARATIF

LAMPIRAN

Gambar 1. Metode Kromatografi cair vakum

Gambar 1. Metode Kromatografi cair vakum

DIANA SYAM MULIADI WAHYUDDIN

150 2012 0131