contribución genética de genes relacionados con retinoides para defectos del tubo neural

Li Huili 1,2, Zhang Jing 1, shuyuan Chen 3, Wang fang 2, Zhang Ting 2 *, Lee Niswander 1 *

1 Departamento de Pediatría, Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus, Hospital de Niños

Colorado, Aurora, Colorado 80045;

2 Pekín clave Laboratorio Municipal de Desarrollo Infantil y Nutriomics, Capital Institute de

Pediatría, Beijing 100020, China

3 Departamento de Pediatría, Hospital Xiangya de la Universidad Central del Sur, Changsha 410008, China

* Más información debe ser dirigida a:

LEE Niswander, Ph.D.

Departamento de Biología Molecular, Biología Celular y Desarrollo

Universidad de Colorado Boulder

Boulder, CO 80309-0347

E-mail: Lee.Niswander@colorado.edu

Tel: 303 735-5928

Ting Zhang, Ph.D.

Beijing Municipal clave Laboratorio de Desarrollo Infantil y Nutriomics

Este artículo ha sido aceptado para su publicación y sometido a revisión por pares lleno, pero no ha pasado por el proceso de corrección de

estilo, composición, paginación y corrección de pruebas, lo que puede dar lugar a diferencias entre esta versión y la Versión de Registro . Por

favor citar este artículo como doi: 10.1002 / humu.23397 .

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Capital Institute of Pediatrics

Distrito de Chaoyang, Albemarle Road 2,

Beijing, 100020, China

E-mail: zhangtingcv@126.com

Tel: + 86-10-85695586

Fax: + 86-10-85631504

Concesión de autor: Este trabajo fue apoyado por el NIH HD81117; la Fundación Nacional de Ciencias Naturales

de China, Beijing, China (Nº 81471163, 81701441).

Abstracto

variantes raras se consideran causas de enfermedades complejas subyacentes. El grupo complejo y grave

de trastornos llamados defectos del tubo neural (DTN) resulta de fallo del tubo neural se cierre durante

embriogénesis temprana. cierre del tubo neural requiere la coordinación de numerosos señalización

vías, incluyendo la regulación precisa de ácido retinoico concentración (RA) que está controlado por

enzimas implicadas en la síntesis de RA y la degradación. Aquí hemos utilizado una pantalla mutación de casos y controles

estudio para revelar las variantes raras en los genes relacionados con retinoides en una población china Han NTD por

la secuenciación de seis genes en 355 casos y 225 controles NTD. variantes raras-NTD específica se encontraron en

exonic regiones y regiones de aguas arriba. Los genes AR-sensible Cyp26A1, CRABP1 y ALDH1A2

albergado variantes raras NTD-específicas en sus regiones aguas arriba. Inesperadamente, la mayoría de

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variantes de cambio de sentido en casos de DTN se encontraron en CYP26B1 que codifica una enzima de degradación RA,

mientras que no hay variantes de cambio de sentido en este gen se han encontrado en los controles. El análisis funcional indica que

el CYP26B1 variantes NTD eran ineficaces en la degradación de RA usando ensayos de inducida por RA

la transcripción y diferenciación neuronal iniciado-RA. Nuestro estudio apoya la contribución de rara

variantes en los genes relacionados con la AR a la etiología de las enfermedades tropicales desatendidas humanos.

1. INTRODUCCIÓN

variantes raras son factores genéticos causales de enfermedades complejas (Bruel et al, 2017;.. Manolio et al,

2009). defectos del tubo neural (DTN; MIM # 601634) son malformaciones congénitas complejas de la

sistema nervioso central, causado por el fallo de cierre del tubo neural durante la embriogénesis. NTD incluyen

defectos craneales tales como anencefalia y encefalocele y defectos caudales incluyendo la espina bífida.

Los estudios genéticos de ratones han identificado más de 240 genes implicados en el cierre del tubo neural (Harris

Y Juriloff, 2010; Wilde, Petersen, y Niswander, 2014; Wilson & Maden, 2005) y esta información

ha proporcionado un marco para explorar las causas genéticas de defectos del tubo neural en los seres humanos durante la última década (X.

Chen et al, 2017.; De Marco et al, 2014.; Kibar et al., 2007; Qiao et al., 2016). Los genes que funcionan en

vías particulares implicados en la polaridad celular plana (PCP), ciliogenesis, el sistema de escisión de glicina

y el metabolismo de un carbono se han explorado en un número relativamente grande de casos (Allache et al.,

2015; C. Cai y Shi, 2014; De Marco et al, 2014.; Dowdle et al., 2011; Hopp et al., 2011; Jones, Fiozzo,

Aguas, McKnight, y Brown, 2014; Kibar et al., 2007; Y. Lei et al, 2013.; Y. Lei et al, 2014.; YP Lei et

al., 2010; Marini et al., 2011; Merello et al, 2015.; Miao et al, 2016.; Narisawa et al, 2012.; Qiao et

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al, 2016.; Roberson et al, 2015.; Robinson et al, 2012.; Shaheen et al, 2015.; Yang et al, 2013.; Zhang

et al., 2015). variantes genéticas PCP se han asociado con el fenotipo más grave defecto del tubo neural, cranio,

así como defectos del tubo neural más limitados, como el mielomeningocele. variantes raras en los cilios genes

han sido asociados con fenotipos NTD craneales humanos (X. Chen et al, 2017;.. Miao et al,

2016) y múltiples potencialmente perjudiciales mutaciones en genes cilios y el TMEM eran superfamilia

encontrado en el síndrome de Meckel-Gruber (MKS) pacientes, un trastorno letal prenatal caracterizado por la

rasgos de encefalocele occipital, polidactilia y riñón poliquístico (Dowdle et al, 2011;.. Hopp et al,

2011; Jones et al, 2014.; Roberson et al, 2015.; Shaheen et al, 2015.; Zhang et al., 2015). Varios

mutaciones de sentido erróneo y variantes de corte y empalme NTD-específica se identificaron en genes que funcionan de la

glicina sistema de división y el metabolismo de un carbono (Marini et al, 2011;. Narisawa et al, 2012.;

Saxena, Gupta, Pandey, Gangopadhaya, y Pandey, 2011; Tilley, Northrup, y Au, 2012). Estas

vías han sido relativamente bien explorado por su asociación con defectos del tubo neural en humanos, pero muchos

NTD casos no han conocido etiología genética.

La vitamina A ácido retinoico derivado de (RA) es esencial para el patrón y la diferenciación de

células progenitoras neurales en el cordón posterior del cerebro y la médula (Duester, 2008; Guan, Chang, Rolletschek, y

Wobus, 2001; Maden, 2007). Es fundamental para mantener un equilibrio adecuado de la vitamina esencial

A y RA, como demasiado o demasiado poco se asocia con una variedad de defectos de nacimiento (Alles y Sulik, 1990; W.

H. Chen, Morris-Kay, y Copp, 1995; Iulianella, Beckett, Petkovich, y Lohnes, 1999; Lee et al, 2012.;

Maden, Gale, Kostetskii, y Zile, 1996). Durante la embriogénesis, los niveles de la AR son establecidos por el

sintetizar ALDH1A2 enzima y el degradativa enzimas cyp26A1 / CYP26B1 / CYP26C1 (Figura

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. 1A) (Niederreither et al, 2002; Pennimpede et al, 2010).. Por otra parte, la señalización de RA es exquisitamente

controlado localmente y esto se logra por la expresión específica de tejido de metabolismo de retinoides

genes que permiten la producción localizada y la destrucción de la AR. RA actúa como un ligando y se asocia con

dos familias de receptores nucleares que se unen al ADN a través de elementos de respuesta a RA (RARE) y directamente

regular la transcripción. receptores de RA (RARA, RARB y GAPA) unen a la forma abundante de RA conocida

como todo-trans-RA y los receptores de retinoides X (RXRA, RXRB y RXRG) se unen de un isómero conocido como

9-cis-RA (Chawla, Repa, Evans, y Mangelsdorf, 2001).

La relación entre los polimorfismos genéticos en los genes del metabolismo de retinoides y el aumento

riesgo de defectos del tubo neural en los seres humanos está bien documentado. Una pantalla de polimorfismo descubrimiento se llevó a cabo para

ALDH1A2 ( MIM # 603687), cyp26A1 ( MIM # 602239), CYP26B1 ( MIM # 605207), CRABP1 ( MIM #

180230) y CRABP2 ( MIM # 180231) genes en 230 individuos con mielomeningocele lumbosacro

(Incluyendo aperta espina bífida o cystica espina bífida), y una asociación significativa entre tres

fue identificado polimorfismos en ALDH1A2 y esto médula NTD (Deak et al., 2005). En otro estudio,

una deleción (g.3116delT) en el cyp26A1 gen que crea un codón de parada prematuro fue encontrado en una

muestra de pacientes con espina bífida 40 de origen caucásico del sur de Italia (Rata et al., 2006).

Por otra parte, la investigación de los tres receptores de RA codificada por RARA ( MIM # 180240), RARB ( MIM #

180220) y GAPA ( MIM # 180190) en 329 tríos familia afectada y 281 afectados duos de la familia

pacientes con mielomeningocele de Texas, SNPs identificados en cada uno de estos genes y estos eran

asociado con un efecto protector contra meningomyelocele (Tran et al., 2011). Es importante

probar el significado funcional de variantes raras para comenzar a desarrollar un profundo

mecanicista

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comprensión de defectos del tubo neural en los seres humanos. Esto se ha hecho para algunos de los estudios anteriores, tales como las pruebas

cómo variantes PCP afectar el comportamiento celular o cómo truncada cyp26A1 afecta el metabolismo de RA (Rat et al.,

2006)

Para aumentar nuestro conocimiento acerca de la importancia de los genes relacionados con la AR en un rango más amplio de defectos del tubo neural

en el ser humano, se analizó una población china Han que incluyeron 355 casos de NTD que van desde craneal

a los defectos caudales y 225 controles etnicidad emparejados. Nos centramos en los genes del metabolismo de cada seis RA

y señalización de genes relacionados (subrayado en la Figura 1A). Esta pantalla mutación de casos y controles mostró una

fuerte correlación entre variantes raras ubicados en o aguas arriba de los genes relacionados con la AR en craneal y

DTN caudal. sorprendentemente, CYP26B1 albergado numerosas variantes de sentido erróneo dentro del cuerpo de genes. Nosotros

también proporcionan evidencia experimental de que éstos CYP26B1 variantes función interrumpen según la evaluación de la

transcripción de genes diana con AR y la diferenciación mediada por RA de células neuroepiteliales.

2. Sujetos y métodos

2.1 Los sujetos

Como se describe en nuestro documento anterior (S. Chen et al., 2016), se realizó secuenciación de alto rendimiento

de muestras de ADN genómico obtenidos de sujetos con NTD en la población china Han van de

la edad gestacional de la semana (GW) de 12 a 10 años de edad y desde varios hospitales locales en seis provincias

en China. controles Descendencia emparejados se obtuvieron de terminaciones no relacionadas con la medicina y

estaban libres de cualquier defectos del tubo neural. Se incluyó a individuos con defectos del tubo neural que habían sido evaluados por clínica

genetistas y los coloca en al menos uno de los siguientes grupos de diagnóstico: anencefalia, espina

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bífida (aperta o cystica), Craneorraquisquisis, y encefalocele (Tablas 1 y 2). En total había

19 individuos con cranio; 17 anencefalia; 55 anencefalia con aperta espina bífida; 2

anencefalia con espina bífida quística; 27 encefalocele y espina bífida aperta; 57 encefalocele;

91 bífida aperta espina; 26 espina bífida oculta; 42 bífida quística espina, y 19 espina bífida sin

más detalles clínicos.

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética Médica del Instituto de Capital de

Pediatría (Pekín, China) (SHERLLM 2.009.002). Hemos llevado a cabo el estudio de acuerdo con las

Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki) para los experimentos que implican

Los seres humanos y de conformidad con las directrices aprobadas. Se obtuvo un consentimiento por escrito

de los padres. Las mujeres embarazadas inscritas fueron diagnosticados por los médicos locales que utilizan

ecografía.

2,2 secuenciación de ADN genómico

Similar a nuestro anterior documento (S. Chen et al., 2016), la secuenciación objetivo se realizó en CYP26B1

(NC_000002.11; NM_019885.3; NP_063938.1); cyp26A1 ( NC_000010.10; NM_000783.3;

NP_000774.2); CRABP1 ( NC_000015.9; NM_004378.2; NP_004369.1); ALDH1A2 ( NC_000015.9;

NM_003888.3; NP_003879.2); CRABP2 ( NC_000001.10; NM_001878.3; NP_001869.1); RARA

(NC_000017.10; NM_000964.3; NP_000955.1). Se preparó ADN genómico utilizando un ADN Truseq

kit de preparación de la muestra (Illumina Inc, San Diego, CA), bibliotecas construidas con Agilent personalizada

SureSelect Enriquecimiento Kit, y se ejecutan en una matriz de enriquecimiento de Agilent personalizada (Código de la sonda:

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BI426526171). La secuencia se lee fueron alineados a la UCSC genoma humano GRCh37 / hg19 usando BWA

(V0.5.9) (Li & Durbin, 2009). La profundidad media de la cobertura en la presente secuenciación fue 22.5X.

Sobre la base de la secuencia de ADNc, la numeración de nucleótidos utiliza 1 como la A de la iniciación de la traducción ATG

codón en la secuencia de referencia, con el codón de iniciación como de codones 1. variantes de nucleótido simple

(SNVS) se llama usando GATK (Samtools cacharro (MAPQ30)) (versión 0.1.17) (Li et al., 2009) y

Varscan (Koboldt et al., 2009) (cobertura mínima = 1, alelo mínimo alterativa lee = 1, mínimo

frecuencia variación> 0,03) y cortas indeles (inserciones y eliminación) fueron llamados usando Varscan

con un estándar suelto (cobertura mínima = 2, el alelo alternativo mínimo lee = 2, la variación mínimo

frecuencia> 0,1). Los genotipos fueron llamados utilizando Bayes. Las variantes fueron anotados con ANNOVAR

(Wang, Li, y Hakonarson, 2010). variantes raras se filtraron a cabo utilizando el dbSNP en NCBI, el 1000

Proyecto genomas, el Proyecto de Secuenciación del NHLBI Exoma y variantes compartidas en los casos y controles.

2.3 línea de células neuroepiteliales y el plásmido de transfección

células NE-4C (ATCC CRL-2935), una línea de células neuroepiteliales aislado a partir de embriones de ratón E9

cerebro, se cultivaron a 37 ° C y 5% de CO2 en MEM (41090, Invitrogen) suplementado con 6% de FBS, 1X

ácidos MEM no esenciales aminoácidos (11140, Invitrogen), y 1X GlutaMax (35050, Invitrogen). Todas- trans

RA (Sigma Aldrich) se preparó como un stock 1 mM (1000X) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) y se utiliza en

una concentración final de 1 • M. DMSO se usó como un vehículo de control para todos los experimentos con AR. Humano

CYP26B1 clon de ADNc en pCMV6-AC-GFP vector fue comprado (RG221075, Origene) y

Se usó mutagénesis dirigida al sitio (Agilent Technologies) para introducir las variantes NTD-específicos.

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Los plásmidos que contienen de tipo salvaje (WT) o mutadas CYP26B1 etiquetado con GFP fueron verificados secuencia.

WT o mutante CYP26B1 construcciones fueron co-transfectadas con pCMV-AN-RFP (PS100033, Origene) en

células NE-4C utilizando el reactivo de transfección Xfect (Clontech) de acuerdo con el protocolo del fabricante

(2μg plásmido CYP26B1 y 2μg pCMV-AN-RFP para co-transfección por pocillo de placa de 12 pocillos). por

ensayos funcionales, WT o mutante CYP26B1 constructos se transfectaron como plásmido 7.5μg por pocillo de una

placa de 6 pocillos o plásmido 1? g por pocillo de placa de 24 pocillos. Para el análisis de la expresión génica aguas abajo

(Figura 3), las células fueron transfectadas con CYP26B1 construcciones, 1 • M RA agregó 24 horas más tarde, y las células

cosecharon 24 horas después de la adición RA. Para el análisis de la diferenciación neural, se transfectaron células,

1 • M RA agregó 24 horas más tarde, y las células se tiñeron para los marcadores neuronales 7-8 días después de la adición RA.

2.4 Western Blot

extractos de proteínas se sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida y electrotransferencia a

Las membranas de PVDF. Las membranas se bloquearon con leche no grasa al 5% y después se sondearon con el

anticuerpos indicados en TBS-Tween, 5% (w / v) de leche en polvo no grasa durante la noche a 4 ° C. Los anticuerpos utilizados fueron

contra 2H8 anti-turboGFP (Origene, TA150041, 1: 2000), anti-turboRFP clon OTI2D9 (Origene,

TA150061, 1: 1000), anti-Gapdh (Sigma, G9545, 1: 2000), anti-RARA (c-20) (Santa Cruz, sc-551, 1:50),

anti-RARB (C-19) (Santa Cruz, sc-552, 1:50), anti-GAPA (C-19) (Santa Cruz, sc-550; 1:50), y •• tubulina

(Sigma, T3952, 1: 2000).

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tinción de inmunofluorescencia 2,5

células NE-4C se fijaron con formaldehído al 4% en PBS durante 15 min a temperatura ambiente, se enjuagaron

con PBS y, a continuación se trató durante 10 minutos con 0,1% de Triton X-100 a 4 ° C. Las células se bloquearon con 4%

suero fetal bovino en PBS durante 1 hora y se incubaron con anticuerpos primarios a 4 ° C durante la noche.

Los anticuerpos contra Tuj1 (Covance, PRB-435P, 1: 1000), anti-Map2 (Sigma, M2320, 1: 200), y

se utilizaron: anti-Tbr2 (500 Abcam, ab23345, 1). Las imágenes se obtuvieron en un láser Zeiss LSM510 Meta

microscopio confocal de barrido utilizando el software Zen. Imaris software de 8,0 se utilizó para el recuento de células

análisis cuantitativo. Para cada grupo, se realizaron de tres a cuatro repeticiones biológicos. los

número de células marcadas con Hoechst en un campo se contó y el porcentaje de Tuj1, Map2, o Tbr2

células positivas se cuantificaron y, finalmente, los valores en todos los mutantes se compararon con la WT.

2.6 Real-Time PCR cuantitativa

El ARN se aisló de acuerdo con las instrucciones del fabricante utilizando el kit de aislamiento de ARN de alta pura

(Roche) y el ADNc se generó usando hexámeros aleatorios y el ADNc Transcriptor Primera Strand 18

Kit de Síntesis (Roche). qPCR se realizó en un LightCycler 480 (Roche) usando los LightCycler 480 Sondas

Maestro reactivo (Roche) y Biblioteca de la sonda universal (Roche) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Todas

cebadores y las sondas se enumeran en Supp. Tabla S1. Los datos se recogieron y se analizaron con LightCycler 480

Software (Roche, versión 1.5.1). Todos los experimentos fueron de tres réplicas biológicas.

2.7 Análisis estadístico

Para los análisis de la variación genética, se utilizó la prueba exacta de Fisher para comparar la diferencia entre los casos y

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controles y tasa de falso descubrimiento (FDR) de corrección se realizó (Benjamini, Drai, Elmer, Kafkafi, y Golani,

2001). Los estudiantes t- Se utilizó la prueba para experimentos de transferencia y tinción de inmunofluorescencia occidentales (* =

P < 0,05, ** = P < 0,01, *** = P < 0,0001).

3. RESULTADOS

3.1 los genes relacionados con retinoides albergan variantes raras específicas de la enfermedad en las regiones exónicas y aguas arriba en

casos de NTD

La vitamina A es procesada por la vía de metabolismo de retinoides a la AR (Figura 1A) y la señalización a través

esta vía es crítica para el patrón neural, la diferenciación neural, y el cierre del tubo neural (Copp y

Greene, 2010; Duester, 2008; Maden, 2007). Se realizó una pantalla mutación de casos y controles por

la secuenciación de los genes de la ruta de RA ALDH1A2, CRABP1, CRABP2, RARA, cyp26A1 y CYP26B1 en el 355

NTD casos que afectan el sistema nervioso central craneal y caudal y 225 controles de la dinastía Han

población china.

Para estos seis genes en el control y los casos de defectos del tubo neural se encontró 1002 variantes en total. -NTD específica rara

variantes fueron ligeramente más de variantes raras de control específico (Figura 1B; P = 0,0654; Q = 0,1177).

Aunque no hubo una diferencia significativa entre las ETD casos y controles para las variantes raras

presente en las regiones intrónicas, 5'UTR o 3'UTR, el número de variantes raras NTD-específicos aumentó

significativamente dentro de las regiones exónicas y regiones aguas arriba ( P = 0,0027; Q = 0,0122 para la exonic y P =

0,0090; Q = 0,0203 para aguas arriba). Por otra parte, la aparición de missense variantes en el 6603bp de

codificación de las regiones secuenciado fue significativamente mayor en NTD casos que en los controles (Figura 1B; 5,12

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variantes de cambio de sentido por ADN Mb secuenciados en defectos del tubo neural [12/355 / 6603bp] vs. 0 por Mb en los controles

[0/225 / 6603bp], P = 0,0046; Q = 0,0138). Todas las variantes de cambio de sentido descubiertos fueron heterocigotos. Cuando

visto como raras mutaciones recurrentes en las regiones exonic arriba y aguas abajo, el número de defectos del tubo neural específica

variantes no fueron significativamente diferentes del control (6/355 vs. 0/225, P = 0,0871; Q = 0,1307; Figura

1B). Sin embargo, el número de individuos portadores de variantes raras en las regiones exónicas o regiones aguas arriba

eran dramáticamente más en NTD casos que en los controles (Figura 1B, 35/355 NTD individuos vs. 4/225

controles, P = 0,0002; Q = 0,0018). Las variantes raras en exonic regiones y regiones aguas arriba se enumeran

en la Tabla 1 y la Tabla 2.

Para las variantes raras identificados en regiones de aguas arriba, definido como 2000 pb aguas arriba de

la transcripción de inicio del sitio, la mayoría se encuentra en Cyp26A1, CRABP1 y ALDH1A2. En el sentido ascendente

regiones, se encontraron seis apariciones de dos variantes raras-NTD específico en cyp26A1, cuatro ocurrencias de

tres variantes raras en CRABP1 y seis casos de seis variantes raras en ALDH1A2 ( Tabla 2 y la Figura

1D-1F). Es interesante que estos son todos los genes AR-responsivo a base de experimentación con la unión RARO

sitios ubicados en sus regiones aguas arriba (Li et al, 2015;. Loudig et al, 2000;. Ohoka, Yokota-Nakatsuma,

Maeda, Takeuchi, y Iwata, 2014) o RXR sitios de unión predichos por PROMO (Farre et al., 2003;

Messeguer et al., 2002) (Figura 1D-1F). A pesar de las distancias genómicas entre agrupado

-NTD específicos variantes raras y RARE son alrededor de 130 pb ( ALDH1A2), 1294 pb ( Cyp26A1), y 1664 pb

( CRABP1) ( Figura 1D-1F), es posible que las variantes raras NTD-específicos podrían afectar su

regulación transcripcional de AR, una idea que aún no se ha probado. Además, el uso PROMO (Farre

et al., 2003; Messeguer et al., 2002) para predecir el factor de transcripción sitios de unión en el ser humano

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genoma, estas variantes podría romper la unión (Figura 1D-1F), destacando la posible funcional

importancia de estas variantes en la regulación de la expresión de genes. Por otra parte, nos encontramos con una

supresión en cyp26A1 (Cyp26A1: NC_000010.10: g.94832265_94832266del) produjo cuatro veces

(Figura 1D) y un total de tres mutaciones raras recurrentes fueron encontrados en las regiones aguas arriba de

cyp26A1 y CRABP1 ( Figura 1D-1E), subrayando así la posible asociación de estas variantes

con una prevalencia de defectos del tubo neural. Todas las variantes reportadas fueron sometidos a la ClinVar (identificación de la petición:

SUB3259094; https://submit.ncbi.nlm.nih.gov/subs/clinvar_file/SUB3259094/overview)

A continuación se correlacionó exonic variantes o aguas arriba con el fenotipo clínico. Las 18

ocurrencias de NTD-específica variantes raras en las regiones exónicas estaban presentes en los siguientes casos: espina

bífida nueve, cuatro encefalocele, dos cranio, dos espina bífida con encefalocele, y uno

anencefalia (Tabla 1). Las 21 ocurrencias en regiones de aguas arriba estaban presentes en doce espina bífida,

cinco con espina bífida anencefalia, encefalocele dos, uno encefalocele con espina bífida, y uno

anencefalia (Tabla 2). Por lo tanto, las variantes raras en los genes del metabolismo de retinoides se pueden asociar con

múltiples tipos de defectos del tubo neural (Tablas 1 y 2). Curiosamente, algunos casos que llevan las variantes de cambio de sentido en

CYP26B1 y / o variantes en regiones aguas arriba de Cyp26A1, RARA, ALDH1A2, y CRABP2 exposición

hipoplasia pulmonar o urinario malformación o extremidad malformación (Tabla 1 y 2), consistente con

los fenotipos observados en ratones con genéticos-deficiencias de estos genes (F. Chen et al, 2010;.. Lee et al,

2012; Maclean, Dolle, y Petkovich, 2009; Malpel, Mendelsohn, y Cardoso, 2000), haciendo hincapié en la

importancia de RA para el tubo neural, pulmón, sistema urinario y desarrollo de las extremidades.

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 En total, 158 variantes comunes fueron encontrados en el presente estudio. Después de Hardy-Weinberg

modelos de equilibrio en el control y filtrado, cuatro polimorfismos de nucleótido único (SNP) eran

asociado con el riesgo de defectos del tubo neural humanos (Supp. Tabla S2). Entre ellos, CRABP2 rs12039622: T> C y

CYP26B1 rs72374435: C> T aparecen como factores de riesgo para la enfermedad, mientras ALDH1A2 rs4646579: G> C

y rs4238328: G> A puede desempeñar un papel protector (. Supl Tabla S2).

3.2 enzima de degradación RA CYP26B1 gen alberga la mayoría de las variantes raras missense NTD-específica

Encontramos el CYP26B1 gen albergaba la mayoría de las variantes raras NTD-específicos dentro de la exonic

regiones de los seis genes analizados (Tabla 3, 12 variantes exónicas en CYP26B1 vs. 6 para los cinco restantes

genes) y más de la sola CYP26B1 variante exonic identificado en los controles (Tabla 3, P = 0,0215, Q

= 0,129 después de la corrección FDR). Además, 9 de las 12 variantes exónicas en el CYP26B1 gen en NTD

casos fueron missense o mutaciones de empalme previstos, significativamente más que en el control (Tabla 1; NTD

vs. Control: 9/355 vs. 0/225; P = 0,0152). Los dos ALDH1A2 y uno CRABP1 exonic variantes eran

también de sentido erróneo o mutaciones de empalme predicho mientras que los tres cyp26A1 exonic variantes estaban en silencio

mutaciones (Tabla 1).

los CYP26B1 gen se localiza en el cromosoma 2 en la región genómica p13.2 (Figura 2A).

De acuerdo con la base de datos de Exoma Agregación Consortium (EXAC), este gen es intolerante
para

mutaciones de sentido erróneo (z = 2,06) y extremadamente intolerantes para la pérdida de mutaciones funcionales (PLI = 0,95)

(Supp. Tabla S3) (Lek et al., 2016). En nuestro estudio de casos y controles, la codificación y regiones no codificantes

Se examinaron el gen. En total había 45 ocurrencias de NTD-específico y 16 ocurrencias de

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variantes raras-específicos de control en el CYP26B1 gen (Figura 2B, P = 0,0701). La visualización de los raros

variantes en el contexto de la secuencia codificante humana muestra acumulación de NTD-específica rara

variantes en las regiones exónicas (Figura 2B), pero no parece ser una región genómica específica que

se asocia más causalmente con defectos del tubo neural. Cuando se ve en el contexto de la proteína CYP26B1, la

mutaciones de sentido erróneo-NTD específica exonic agrupados en una región de 120 aminoácidos

(ChR2: 72362036-ChR2: 72362395) alrededor de dos sitios de reconocimiento de sustrato (Figura 2C). Sanger

La secuenciación se realizó para confirmar las variantes raras (Figura 2D y no mostrado). Tres Se

esperaría que NTD-específica variantes para producir mutaciones silenciosas (NP_063938.1: p.Arg77 =, p.Leu169 =

y p.Leu322 =), cuatro para producir mutaciones de sentido erróneo (observado como ocho ocurrencias:

NP_063938.1: p.Arg195Trp, p.Leu197Met, p.Gln238Glu y p.Ala239Thr), y uno de empalme / exonic

mutación (NC_000002.11: g.72362274C> T NP_063938.1: p.Arg235Gln). En contraste, sólo un silencio

mutación se encontró en control (NP_063938.1: p.Arg195 =, que se muestra en verde en la Figura 2C). Entre

ellas, las variantes NC_000002.11g.72362395G> Un NP_063938.1: p.Arg195Trp,

NC_000002.11g.72362389G> T NP_063938.1: p.Leu197Met y NC_000002.11g.72362274C> T

NP_063938.1: p.Arg235Gln han sido reportados en EXAC y las frecuencias de los alelos son 0,0001, 0,0001

y 0,0002, respectivamente (Lek et al., 2016). La variante NC_000002.11g.72362039G> p.Gln238Glu C

y la variante g.72362036C recurrente> T p.Ala239Thr (3 ocurrencias) se encontraron sólo en el NTD

casos y no estaban presentes en la base de datos EXAC. omega Clustal se utilizó para analizar la

conservación de la secuencia entre especies en la posición de estas variantes de cambio de sentido (Sievers et al.,

2011). Los resultados indicaron que los residuos de aminoácidos p.Arg195, p.Leu197 y p.Ala239 son

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invariante de pez cebra a humano, mientras que p.Arg235 y p.Gln238 se conservan en los mamíferos (Figura

2E). Cabe destacar que, incluso cuando las personas realizan la misma mutación sin sentido en CYP26B1, la clínica

fenotipos variado y van desde la médula a defectos craneales (Tabla 1), lo que sugiere que estos

mutaciones sin sentido en heterocigosis CYP26B1 podría contribuir a la NTD, pero no son los únicos

determinante del fenotipo.

3.3 Las predicciones sobre el impacto de las variantes raras en función de las proteínas

missense mutaciones raras o de empalme previstos tienen el potencial de afectar la función de proteínas

y los estudios anteriores mostraron una carga significativa de éstos potencialmente perjudicial NTD-específica

variantes en el CYP26B1 gene. Por lo tanto, nos centramos nuestra atención en las pruebas de los efectos de

missense o mutaciones de empalme NTD-específicos en CYP26B1 gene. En primer lugar, se evaluó la predicho

empalme / mutación de sentido erróneo NM_019885: c.704G> A, Arg235Gln, que se produjo al final del exón 3

(Supp. Figura S1). Uso Humano Buscador de Splice 3,0 (Desmet et al., 2009), esta variante se encuentra en una

empalme sitio donante y podría influir potencialmente empalme; Por otra parte, se podría crear una nueva exonic

silenciador de empalme (ESS) sitio. Por otra parte, se esperaría que esta variante en el exón 3 para crear una

mutación de sentido erróneo (p. (Arg235Gln)) (Supp. Figura S1B y S1C). Este potencial de alterar tanto empalme

y la secuencia de la proteína nos llevan a evaluar la única mutación otro empalme visto, que estaba en el

ALDH1A2 gene. Esto ocurrió en exon10 (NM_003888) y la variante se prevé crear una

sitio exonic ESS o una alteración de un potenciador de empalme exonic (ESE), así como para crear una

p. (Ile363Val) mutación sin sentido. Por lo tanto, se clasificaron tanto de éstos como de empalme variantes /
missense

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en la Tabla 1. A continuación, evaluaron el efecto predicho de las variantes missense individuales sobre aminoácido

carga y la hidrofobicidad y cribar utilizado y algorithims PolyPhen para predecir el efecto sobre las proteínas

función (Tabla 1 y la Figura 2F). Estas herramientas predicen que los cinco variantes de cambio de sentido probaron a continuación

impactaría función de la proteína.

3.4 Análisis funcional de CYP26B1 variantes demuestra la pérdida de función en la modulación de

la transcripción de genes RA-mediada

Para probar experimentalmente el impacto de estas mutaciones perjudiciales predichos, transitoriamente

expresado de tipo salvaje marcado con GFP (WT) CYP26B1 ADNc o mutantes construcciones que contienen cada NTD

específicos de variante en una línea celular neuroepitelial NE-4C y expresión de la proteína evaluado, el efecto sobre

la transcripción, y la diferenciación neural RA-mediada. La línea de células neuroepiteliales NE-4C se deriva

a partir del día 9 de ratón tejido neural craneal embrionaria durante el período de cierre del tubo neural. Los plásmidos

llevar a WT o mutante CYP26B1 ( todas las construcciones fusionadas a GFP) y un plásmido de expresión RFP-a de

control para la eficiencia de transfección se transfectaron transitoriamente en las células NE-4C. El relativo niveles

de expresión de GFP indicaron que no había ninguna diferencia significativa entre WT y mutante

construcciones (Supp. Figura S2A). ensayos de transferencia de Western indicó que el nivel de proteína de RFP fue similar

para el WT y todos los constructos mutantes y que el anticuerpo GFP detectó una banda prominente a 84kD,

el tamaño predicho de la proteína de fusión CYP26B1-GFP para todos los constructos (57kD CYP26B1 más GFP

27 kD; Supp. Figura S2B). Estos constructos fueron utilizados en células NE-4C para el siguiente funcional

estudios.

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 RA puede promover la diferenciación de las células madre neurales y células NE-4C responde al tratamiento RA por

la activación de la expresión de ambos genes directos e indirectos RA-sensible dentro de las 24 horas. los

CYP26B1 gen codifica un modulador clave de los niveles de AR intracelulares a través de la degradación de la AR. por lo tanto, nosotros

postulado que la introducción de la WT CYP26B1 resultaría en la degradación de la AR y mínimo

inducción de genes RA-sensible. Por el contrario, si la variante NTD crea una pérdida de la función CYP26B1,

entonces sería fallar para degradar RA y daría resultados similares como controles en blanco después de la inducción de la RA. Si

el CYP26B1 variante retiene la función parcial, entonces puede haber un nivel de aguas abajo

RA-sensible transcripción de genes intermedia entre WT y el control en blanco. Para probar CYP26B1

función transfectadas transitoriamente la CYP26B1 plásmidos de expresión en células NE-4C y luego

tratadas las células con RA (1 • M) durante 24 horas. El uso de PCR cuantitativa en tiempo real, se evaluó la

los niveles de mRNA de los genes que se activan por RA y / o están implicados en el cierre del tubo neural o neuronal

diferenciación (Balmer y Blomhoff, 2002;. Wilde et al, 2014). cuando WT CYP26B1 Fue presentado,

la expresión de todos los genes mostrados en la Figura 3A-G fue en relación al control en blanco reducido en gran medida.

Esto indica que WT CYP26B1 reduce el nivel de RA en la célula que conduce a un RA-mediada por menor

respuesta transcripcional. Por el contrario, toda la CYP26B1 variantes mostraron perfiles de expresión similares a

el blanco de control (Figura 3A-G), indicando que la CYP26B1 variantes no pueden modular la señalización RA,

esencialmente actuando como pérdida de alelos de función. Los genes que fueron suprimidos por WT CYP26B1 pero no por

el CYP26B1 variantes fueron los blancos directos con AR RARB y CRABP1 ( Figura 3A y 3B), que contienen

sitios raros y acto en un bucle de retroalimentación como componentes de la vía de señalización RA (Bastien y

Rochette-Egly, 2004; Wilde, Siegenthaler, Dent, y Niswander, 2017); wnt11 ( Figura 3C), que

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codifica un ligando para vía de señalización Wnt no canónica (Hardy et al., 2008); CDH2 que codifica una célula

proteína de adhesión (Figura 3D); el gen del factor de transcripción FoxA1 ( Figura 3E), que desempeña un papel en

patrón dorsal-ventral del tubo neural (Maier, Lo, y Harfe, 2013); el gen de la homeobox Hoxb1

(Figura 3F), que los patrones de células progenitoras en el cerebro posterior (Gaufo, Flodby, y Capecchi, 2000;

Zigman, Laumann-Lipp, Tito, Postlethwait, y Moens, 2014) y en consonancia con el aumento de la

Hoxb1 los niveles de mRNA en RA-trataron células madre neuronales humanas (Colleoni et al., 2011); y casp3 ( Figura

3G) que codifica la proteína pro-apoptótica. En contraste, el nivel de ARNm de POU5f1 ( Figura 3H), que

codifica la proteína de la pluripotencia de células madre embrionarias Oct4 no se ve afectada por WT o NTD-específica

CYP26B1 variantes. Estos cambios en la actividad transcripcional mediada por RA-ocurren sin aparente

influencia sobre la expresión de la proteína del receptor RA como se indica por análisis de transferencia Western de Rara, RARB y

GAPA en relación con WT (Supp. Figura S3). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la CYP26B1

variantes introducen mutaciones de pérdida de función que atenúan la función CYP26B1 en la degradación de

RA y la actividad RA modulación en el contexto de la regulación transcripcional de genes aguas

abajo.

3.5 CYP26B1 variantes de modulación impacto de la diferenciación neural

Una función conocida de la AR es el de promover la diferenciación de células progenitoras neurales a

CYP26B1 transfectadas transitoriamente células NE-4C con 1 • M RA para inducir la diferenciación. Nosotros entonces

evaluó la diferenciación neuronal 7- 8 días después de tratamiento de la AR mediante la cuantificación del número de células

que se tiñeron positivamente para los marcadores neuronales Tuj1, Map2, y Tbr2. WT CYP26B1 suprimido

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neuronas. Para poner a prueba la capacidad de las CYP26B1 construye para afectar a la diferenciación neuronal, se trataron

CYP26B1 transfectadas transitoriamente células NE-4C con 1 • M RA para inducir la diferenciación. Nosotros entonces

evaluó la diferenciación neuronal 7- 8 días después de tratamiento de la AR mediante la cuantificación del número de células

que se tiñeron positivamente para los marcadores neuronales Tuj1, Map2, y Tbr2. WT CYP26B1 suprimido

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la diferenciación neuronal como se evaluó con los tres marcadores neuronales (Figura 4). Por el contrario, toda

CYP26B1 variantes mostraron capacidad atenuada para suprimir la diferenciación y eran más similares a

controles de vectores en blanco o vacíos. Para todos los constructos mutantes, el número de células Tuj1-positivos fue

significativamente mayor que para WT CYP26B1 ( Figura 4A y 4D). Para Mapa2 y Tbr2 señalamos algunos

respuestas intermedias o no significativos lo que sugiere que algunas variantes pueden retener función parcial,

en particular, p. (Arg235Gln), mientras que otras variantes tales como p. (Arg195Trp) y p. (Ala293Thr) mostró

pérdida significativa de fenotipos de función en todos los ensayos (Figura 4B-4D).

4. DISCUSIÓN

Nuestro caso NTD: estudio de control ha identificado un número significativo de mutaciones raras en retinoide

genes del metabolismo asociados con defectos del tubo neural en los seres humanos. Por otra parte, nuestros experimentos funcionales

demostrar que las mutaciones de sentido erróneo el NTD-específicas en CYP26B1 crear la pérdida de la función

mutaciones. actos CYP26B1 a degradan RA y modulan los niveles de señalización con AR. Consistente con esto, WT

CYP26B1 disminuye la expresión de objetivos directos e indirectos de la señalización de RA e inhibe

RA-mediada diferenciación neural. En contraste, el-NTD específica CYP26B1 variantes muestran significativamente

función atenuada en estos ensayos. Estas actividades AR mediada son relevantes para el proceso de

cierre del tubo neural y por lo tanto, se aconseja que el deterioro en el balance de la señalización de RA debido a

CYP26B1 variantes pueden contribuir al riesgo de defectos del tubo neural.

En nuestra cohorte, todas las variantes encontradas eran heterocigóticos genéticamente, con la variante presente en un solo

un alelo. A partir de nuestros datos de secuenciación de seis genes relacionados con la AR, CYP26B1 fue más cargado de

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mutaciones perjudiciales NTD-específicos. Todos los tres enzimas CYP26 se expresan de forma dinámica en ratones de

gastrulación través del tiempo de cierre del tubo neural. Estos genes son críticos en la modulación de RA

señalización durante la formación del tubo neural como la pérdida de los tres resultados de genes en la duplicación de la neural

tubo en Cyp26a1b1c1 - / - embriones y este defecto es más pronunciada que en Cyp26a1c1 - / - embriones

(Uehara, Yashiro, Takaoka, Yamamoto, y Hamada, 2009), lo que implica que Cyp26b1 separado contribuye

a la formación del tubo neural temprano. Por otra parte, Cyp26b1 es el más altamente expresados de la

CYP26 isoformas en el cerebro posterior, aunque Cyp26b1 - / - mutantes no muestran un defecto significativo

en el patrón cerebro posterior en ratones (Maclean et al., 2009).

Nuestros experimentos funcionales de las variantes raras en el CYP26B1 gen que se encuentra en nuestra cohorte NTD

indican que son pérdida parcial o completa de los alelos de función. Postulamos esto conduce a una insuficiente

regulación de la transcripción RA-mediada y la diferenciación de células madre neuronales debido a un fallo de la AR

la degradación, lo que conduce a suprafisiológicas acumulación RA. El exceso de RA puede provocar defectos del tubo neural en ratas y

ratón, que van desde caudal aperta espina bífida, a encefalocele y una combinación de estos defectos del tubo neural

(Alles y Sulik, 1990;. W. Cai et al, 2007). En nuestra cohorte actual, 3 de 9 individuos que portan CYP26B1

missense variantes raras muestran inferior espina bífida, 3 individuos fueron afectados con encefalocele,

y 1 fue afectada con la combinación de la espina bífida y encefalocele: consistente con la

fenotipos de roedores. Cabe destacar que dos individuos exhibieron cranio, destacando la posibilidad

que la RA supraphysiological podría estar asociado con un fenotipo cranio, aunque hay

hay evidencia de que el exceso de RA induce este fenotipo en modelos animales. Por el contrario, la falta de RA

síntesis provoca cranio en ratones (Niederreither, Subbarayan, Dolle, y Chambon, 1999),

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haciendo hincapié en la importancia de los niveles adecuados de la AR en la convergencia y la extensión de la placa neural

durante el cierre del tubo neural temprano. Se ha propuesto que supraphysiological AR conduce a bífida

espina debido a la muerte celular excesiva en el intestino grueso y el mesénquima ventral al neuroepitelio de

neuroporo posterior, y una disparidad en el crecimiento entre las regiones ventral y dorsal de la cola

brote hace que el relativamente más rápido creciente región dorsal a Evert, impidiendo el cierre de la caudal

tubo neural (Alles y Sulik, 1990). Nuestros datos muestran que las construcciones de sentido erróneo NTD-específicas no pueden

apropiadamente disminuir la expresión de casp3 ( Figura 3G), consistente con la idea de que la apoptosis

puede ser aumentado cuando los niveles de RA están en exceso. Adicionalmente, Hoxb1 es un importante RA-sensible

(Colleoni et al., 2011) regulador de cerebro posterior lumen morfogénesis (Zigman et al., 2014) y la

construcciones mutantes-NTD específica no son capaces de modular Hoxb1 expresión (Figura 3F) y este

podría contribuir a posibles fenotipos CYP26B1.

Nuestros datos de secuenciación NTD humana también identificó un número significativo de NTD-específica rara

variantes en regiones aguas arriba de Cyp26A1, CRABP1 y ALDH1A2 ( Figura 1C-1E y en la Tabla 2).

Cyp26a1 - / - embriones de ratón exhiben exencefalia y caudal espina bífida (Abu-Abed et al., 2001). los

región aguas arriba de cyp26a1 está altamente conservada y tiene elementos raros DR5 que están atados por

receptores RAR para regular la transcripción (Loudig et al., 2000). Del mismo modo, en la región aguas arriba de

CRABP1 hay un elemento RARE DR2 (Figura 1E) y defectos del tubo neural en los seres humanos se han asociado con

ectópica de ocupación CRABP1 promotores de los receptores de RXR y alteraciones histonas (Li et al., 2015).

Aldh1a2 embriones de ratón nulos exhiben cranio (Niederreither et al., 1999). En vista de nuestra

hallazgos que variantes raras NTD-específicas se encuentran 130 a 1664 pb aguas arriba del RARE para estos

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tres genes, que postulan que estos alelos variantes impacto de la unión de los receptores de RA y / o la

regulación de la transcripción de estos genes clave. Además, el factor de transcripción de unión predicciones

sugerir el posible impacto de variantes-NTD específica en la expresión de estos genes (Figura 1D-1f).

En resumen, nuestros datos proporcionan un conjunto de datos de nuevas variantes raras en los genes relacionados con retinoides que son

genéticamente correlacionado con defectos del tubo neural. Nuestros resultados experimentales ponen de relieve la pérdida de la función

características de estas mutaciones raras que codifican para la enzima de degradación RA CYP26B1. Nuestra

hallazgos junto con los estudios de asociación genética por otros (Deak et al, 2005;. Rat et al, 2006;. Tran

et al., 2011) destacan esta vía funcional en la contribución genética de mutaciones raras a humanos

DTN.

EXPRESIONES DE GRATITUD

Estamos muy agradecidos a Sofía Pezoa por sus comentarios sobre el manuscrito.

DECLARACIÓN DE DIVULGACIÓN

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

REFFERENCES

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Figuras legendarias

Figura 1: genes relacionados retinoides albergan variantes raras en seres humanos con defectos del tubo neural

A) Un diagrama esquemático de la síntesis y degradación del ácido retinoico de la vitamina A con las enzimas implicadas en el metabolismo de

retinoides y la unión indicados en fuente azul. Los genes secuenciados en el presente estudio se indican mediante subrayado de las proteínas

codificadas. B) No se encontraron variantes raras en todos los genes secuenciados en la presente cohorte de NTD casos respecto a los controles.

PAG se obtuvo valor a través de la prueba exacta y corrección tasa de falso descubrimiento (FDR) Fisher. C) Ilustración para cada símbolo en DF. DF)

Esquemas muestran las posiciones genómicas de variantes raras se encuentran en regiones aguas arriba de Cyp26A1, CRABP1, y ALDH1A2 genes

relativos a la respuesta-elemento de ácido retinoico (RARE) y predijo factor de transcripción sitios de unión.

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 FIGURA 2: variantes raras se encuentran en el CYP26B1 gen en el caso NTD: control de cohorte

UN) CYP26B1 se encuentra en el cromosoma 2 en la región genómica p13.2. SEGUNDO) CYP26B1 contiene 5-6 exones dependiendo de splicing

alternativo. Todas las variantes raras-cohortes específicas que se encuentran en el presente estudio se visualizaron en el genoma navegador UCSC

(GRCh37 / hg19). fuente verde indica variantes raras identificadas en los controles, la fuente roja indica variantes raras NTD-específicos. C)

Esquema de la proteína CYP26B1 que muestra dominios funcionales y la posición de variantes raras encuentran en las regiones exónicas

indicados por óvalo rojo para las variantes NTD-específicos o óvalo verde para el único individuo control. secuenciación D) Sanger traza para

confirmar los potenciales variantes raras dañinos encontrados en el CYP26B1

gen en NTD individuos. E) Análisis de Conservación por Clustal omega y la ubicación de las variantes NTD-específicos. F) predijo efecto de

las variantes raras relativos a la función de proteínas y la carga de aminoácidos.

FIGURA 3: CYP26B1 NTD-variantes función atenúan según la evaluación de la modulación de la transcripción génica

mediada por RA

AH) se realizaron ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real para probar los niveles de mRNA de los genes que son aguas abajo

de la señalización de la AR y que participan en el desarrollo neural. células NE-4C se transfectaron con CYP26B1 WT o

plásmidos mutantes y se trató durante 24 horas con AR. GAPDH

gen se utilizó como control de carga. El nivel de expresión está indicado como cambio veces en relación con vector

WT, que se establecen en 1. Todos los experimentos eran de tres réplicas biológicas. ***: P < 0,0001; **: P < 0,01; *: P < 0,05;

estudiante de t- prueba.
FIGURA 4: CYP26B1 variantes interrumpen modulación de la diferenciación neural

La cuantificación de los resultados de la tinción de inmunofluorescencia de marcadores neuronales Tuj1 (A), las células Map2 (B) o Tbr2 (C)

células positivas 7-8 días después del tratamiento RA de células NE-4C (en blanco), o NE-4C transitoriamente transfectadas con el vector

(Vector), de tipo salvaje CYP26B1 ( WT), o diferentes

CYP26B1 variantes. El porcentaje de células inmunopositivas relativos a todas las células (Hoechst marcado) en un campo de

visión se anotó y luego comparación con las células transfectadas con WT

CYP26B1. ***: P < 0,0001; **: P < 0,01; estudiante de t- prueba. D) las imágenes típicas de la tinción de inmunofluorescencia

utilizado para los cálculos en AC. Para cada genotipo y el marcador neuronal, se realizaron de tres a cuatro repeticiones.
 Tabla 1: variantes raras en las regiones exonic en la presente cohorte NTD

Gene tipo de variante del genoma

cDNA Proteína TAMIZAR A PolyPhen Años Sexo El fenotipo clínico

posición
cambio cambio Puntuación Puntuación

cyp26A1 Silencio chr10: 94836414 1113A> G Pro371 = 13GW F encefalocele frontal; espina cervical

bífida aperta

cyp26A1 Silencio chr10: 94836369 1068C> T Ile356 = 20 GW F Lumbosacra occulta espina bífida;

hidrocefalia

cyp26A1 Silencio chr10: 94836369 1068C> T Ile356 = 28GW M Lumbosacra aperta espina bífida;

hidrocefalia

CYP26B1 Silencio de chr2: 72360332 966G> C Leu322 = 33GW M Torácica Lumbar espina bífida sacra; izquierda

equinovaro

CYP26B1 missense de chr2: 72362036 715G> A Ala239Thr 0.01 0.98 22 GW F Lumbar espina bífida quística;

hidrocefalia; equinovaro dobles

CYP26B1 missense de chr2: 72362036 715G> A Ala239Thr 0.01 0.98 20 GW M encefalocele occipital; falta de

lóbulo pulmonar; TEA

CYP26B1 missense de chr2: 72362036 715G> A Ala239Thr 0.01 0.98 28GW M Lumbosacra aperta espina bífida; falta de

Riñón izquierdo; poliquística del riñón derecho

CYP26B1 missense de chr2: 72362039 712C> G Gln238Glu 0.01 0.08 24GW M encefalocele frontal; ASD;

hidrocefalia

CYP26B1 Empalme / MIS

de chr2: 72362274 704G> A Arg235Gln 0.01 0,76 37GW F encefalocele occipital; cervical

sentido
torácica aperta espina bífida; cuello corto

CYP26B1 missense de chr2: 72362389 589C> A Leu197Met 0 0.99 16GW M Torácica lumbar espina bífida aperta;

hidrocefalia; falta de pulmonar derecha

lóbulo; miembros inferiores demasiado largos; derecho

equinovaro
CYP26B1 missense de chr2: 72362389 589C> A Leu197Met 0 0.99 31GW M Craneorraquisquisis; cuello corto; suprarrenal

fusión glándula; dextrocardia

CYP26B1 missense de chr2: 72362389 589C> A Leu197Met 0 0.99 T T encefalocele

CYP26B1 missense de chr2: 72362395 583C> T Arg195Trp 0 1 24GW F Craneorraquisquisis; cuello corto; falta de

a la izquierda del miembro superior; thoracocyllosis; falta de

lóbulo pulmonar; turno renal

CYP26B1 Silencio de chr2: 72362471 507g> C Leu169 = T T Espina bífida

CYP26B1 Silencio de chr2: 72371316 231G> A = Arg77 T T Espina bífida

CRABP1 missense chr15: 78635856 265G> A Glu89Lys 0.01 0.41 T T La anencefalia

ALDH1A2 missense chr15: 58256102 1067C> G Thr356Ser 0.32 0 20 GW F Lumbosacra occulta espina bífida;

hidrocefalia

ALDH1A2 Empalme / MIS

chr15: 58254374 1087A> G Ile363Val 0.89 0 22 GW F encefalocele occipital

sentido

ASD: defecto septal auricular; F: femenino; M: masculino; GW: semana de gestación. T: Desconocido; CYP26B1 ( NC_000002.11; NM_019885.3; NP_063938.1); cyp26A1 ( NC_000010.10;

NM_000783.3; NP_000774.2); CRABP1 ( NC_000015.9; NM_004378.2; NP_004369.1); ALDH1A2 ( NC_000015.9; NM_003888.3; NP_003879.2). En cambio cDNA, nucleótido

numeración utiliza 1 como la A del codón de iniciación de la traducción ATG en la secuencia de referencia, con el codón de iniciación como codón 1
Tabla 2: variantes raras en regiones de aguas arriba en la presente cohorte NTD

Gene posición genoma Árbitro alt Años Sexo El fenotipo clínico

alelo alelo
(Construir hg19)

cyp26A1 chr10: 94832244 do UN 20 GW METRO Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia

cyp26A1 chr10: 94832244 do UN 18GW METRO La anencefalia; occipital espina bífida cervical

aperta; falta de lóbulo pulmonar; sin cuello

cyp26A1 chr10: 94832265 a 94832266 GT - 24GW METRO La anencefalia; occipital espina bífida cervical

aperta; sin cuello; lóbulo pulmonar derecha falta

cyp26A1 chr10: 94832265 a 94832266 GT - 21GW F encefalocele occipital; bífida torácica cervical

aperta espina; falta de lóbulo pulmonar;

quiste mediastínico

cyp26A1 chr10: 94832265 a 94832266 GT - 15GW METRO encefalocele occipital

cyp26A1 chr10: 94832265 a 94832266 GT - 31GW METRO occulta espina bífida; hidrocefalia; doble

equino; thoracocyllosis; falta de pulmonar

lóbulo

CYP26B1 Chr2: 72375908 GRAMO UN 34GW F Torácica lumbar espinal bífida oculta

RARA Chr17: 38464726 T do 26GW METRO Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia;

equinovaro dobles

RARA Chr17: 38464601 do T 37GW F encefalocele occipital; cuello corto,

ALDH1A2 chr15: 58358723 GRAMO T 20 GW METRO La anencefalia; glándulas suprarrenales dobles

malformación

ALDH1A2 chr15: 58359108 do UN Desconocido Desconocido espina bífida quística

ALDH1A2 chr15: 58358515 do UN 28GW METRO Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia

ALDH1A2 chr15: 58358821 do T 28GW METRO Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia

ALDH1A2 chr15: 58358802 do GRAMO 2 años F espina bífida aperta torácica

ALDH1A2 chr15: 58358401 GRAMO do 2 años F Lumbosacra espina bífida oculta

CRABP1 chr15: 78632491 T UN 20 GW METRO Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia 1

CRABP1 chr15: 78632456 do T 19GW F La anencefalia; occipital espina bífida cervical

aperta; cuello corto

CRABP1 chr15: 78632558 GRAMO UN 24GW F Lumbosacra aperta espina bífida; hidrocefalia

CRABP1 chr15: 78632558 GRAMO UN Desconocido Desconocido La anencefalia; occipital espina bífida cervical

aperta

CRABP2 chr1: 156676423 do UN 39GW METRO Lumbosacra espina bífida quística; hidrocefalia

CRABP2 chr1: 156676091 do T 16GW METRO La anencefalia; occipital bífida torácica cervical

aperta espina; sin cuello; thoracocyllosis; doble

displasia glándula adrenal

F: femenino; M: masculino; GW: la semana gestacional

CYP26B1 ( NC_000002.11; NM_019885.3; NP_063938.1); cyp26A1 ( NC_000010.10; NM_000783.3;

NP_000774.2); CRABP1 ( NC_000015.9; NM_004378.2; NP_004369.1); ALDH1A2 ( NC_000015.9; NM_003888.3;

NP_003879.2); CRABP2 (NC_000001.10; NM_001878.3; NP_001869.1) RARA ( NC_000017.10; NM_000964.3;

NP_000955.1)
Tabla 3: Resumen de las variantes raras albergadas en las regiones exónicas y regiones aguas arriba de los

genes secuenciados implicados en el metabolismo y la señalización relacionada con retinoides

símbolo en exonic en aguas arriba

de genes

NT Controlar PAG valor FDR corrección control de NTD PAG valor de corrección FDR

D
Q valor Q valor

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 cyp26A1 3 0 0.2878 0,8634 6 2 0.7170 1

CYP26B1 12 1 0,0215 0,129 1 0 1 1

CRABP1 1 0 1 1 4 0 0.3037 0.9111

CRABP2 0 0 1 1 2 0 0.5249 1

RARA 0 0 1 1 2 1 1 1

ALDH1A2 2 0 0.5249 1 6 0 0,0871 0.5226

FDR: Falso descubrimiento tasa