PENAPISAN BAKTERI RIZOSFER YANG BERPERAN DALAM

MENINGKATKAN PERTUMBUHAN TANAMAN

Oleh :

LAPORAN PRAKTIKUM BAKTERIOLOGI

KEMENTERIAN RISET, TEKNOLOGI, DAN PENDIDIKAN TINGGI

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS BIOLOGI
PURWOKERTO
2017
I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
 Tanah rizosfer adalah tanah yang menempel pada perakaran tanaman yang
banyak terdapat bakteri, jamur, Actinomycetes dibanding tanah non rizosfer. Banyak
kandungan yang terdapat pada tanah tersebut yang merupakan sumber penting
sebagai antibiotik (Rao, 1994). Rizosfer merupakan daerah yang ideal untuk
pertumbuhan dan perkembangan mikroba antagonis. Nutrisi yang disekresikan
tanaman ke dalam rizosfer banyak dipengaruhi oleh faktor lingkungan dan
selanjutnya mempengaruhi kelimpahan dan keragaman mikrob di daerah tersebut.
Keadaan ini didukung oleh fungsinya, yaitu sebagai penyedia nutrisi dan juga
sebagai tempat tumbuh dan berkembangnya mikroorganisme (Tarigan et al., 2011).
Bakteri Rhizobium atau Rhizobacteria adalah salah satu contoh kelompok
bakteri yang berkemampuan sebagai penyedia hara bagi tanaman. Bila bersimbiosis
dengan tanaman legum, kelompok bakteri ini akan menginfeksi akar tanaman dan
membentuk bintil akar di dalamnya. Rhizobacteria hanya dapat memfiksasi nitrogen
atmosfer bila berada di dalam bintil akar dari mitra legumnya. Peranan
Rhizobacteria terhadap pertumbuhan tanaman khususnya berkaitan dengan masalah
ketersediaan nitrogen bagi tanaman inangnya (Rao, 1994).
Salah satu upaya untuk melawan mikroba tersebut adalah dengan
menggunakan mikroba lain yang mempunyai sifat antagonis (antimikroba) sebagai
pengganggu atau penghambat metabolisme mikroba lainnya. Uji Antagonisme
dilakukan untuk menghambat mikroba pathogen. Mikroba antagonis yang memiliki
kemampuan antimikroba tersebut dapat menghasilkan senyawa antimikroba.
Senyawa antimikroba tersebut dapat digolongkan sebagai antibakteri atau antifungi.
Uji Antagonisme pada bakteri dilakukan pada media NA, sedangkan untuk
menghambat janur uji dilakukan pada media SCN. Beberapa mikroorganisme tanah
seperti rhizobium, Azospirillum, dan Azootobacter, mikoriza, bakteri pelarut fosfat,
mikoriza perombak selulosa dan Effective Microorganism (EM) bila dimanfaatkan
secara tepat dalam sistem pertanian organik akan membawa pengaruh yang positif
baik bagi ketersediaan hara yang dibutuhkan tanaman (Pelczar, 1993).
Actinomycetes merupakan jenis mikroorganisme yang sangat berpotensi sebagai
penghasil metabolit sekunder yang memiliki aktivitas biologi sebagai antimikroba
(Kumala et al., 2015).
Uji BPN (Bakteri Penambat Nitrogen) dari isolate Azospirillum sp. yang
diinokulasi tusuk pada medium semi solid Nitrogen free Bromothymol Blue (NfB)
yang mana medium tersebut tidak mengandung nitrogen sama sekali. Untuk
menambat nitrogen, bakteri ini menggunakan enzim nitrogenase, dimana enzim ini
akan menambat gas nitrogen di udara dan merubahnya menjadi gas amoniak. Gen
yang mengatur proses penambatan ini adalah gen nif (Singkatan nitrogen–fixation).
Gen – gen nif ini berbentuk suatu rantai tidak terpencar kedalam sejumlah DNA
yang sangat besar yang menyusun kromosom bakteri, tetapi semuanya terkelompok
dalam suatu daerah. Hal ini memudahkan untuk memotong bagian untaian DNA
yang sesuai dari kromoson Rhizobium dan menyisipkanya ke dalam mikroorganisme
lain (Taiz & Zeiger, 1991). Meskipun pupuk kimia bermanfaat dalam meningkatkan
hasil panen namun pada saat bersamaan juga berbahaya bagi lingkungan. Jadi, ada
kebutuhan untuk menerapkan teknik manajemen yang tepat untuk mengatasi potensi
bahaya lingkungan yang disebabkan oleh pupuk ini. Salah satu solusi yang mungkin
untuk menurunkan risiko akumulasi pupuk kimia di lingkungan adalah
menggabungkan pupuk kimia dengan biofertilizers. Saat ini, mikroorganisme
bermanfaat digunakan untuk meringankan kondisi gersang seperti masalah tekanan
air dan salinitas tanah. Semua mikroorganisme adalah yang paling melimpah dan
efisien untuk menghadapi tantangan ini. Bakteri menyimpan dan memasok nitrogen
dengan memperbaiki nitrogen bebas di sistem akar dan sebagai gantinya mereka
menggunakan sumber karbon dan senyawa yang berbeda dari tanaman melalui
eksudasi (Rueda et al., 2016).
Bakteri pelarut fosfat (BPF) merupakan kelompok mikroorganisme tanah
yang berkemampuan melarutkan P yang terfiksasi dalam tanah dan mengubahnya
menjadi bentuk yang tersedia sehingga dapat diserap tanaman. Mikroorganisme
pelarut fosfat ini dapat berupa bakteri (Pseudomonas, Bacillus, Escheria,
Actinomycetes, dan lain lain). Sekitar sepersepuluh sampai setengah jumlah bakteri
yang diisolasi dari tanah mampu melarutkan fosfat, jumlah bakteri tersebut berkisar
105 – 107 per gram tanah adan banyak dijumpai di daearah perakaran tanaman. Uji
BPF dilakukan dengan menggunakan medium Pikovskaya pada cawan petri yang
setelah diinkubasi terdapat zona jernih (Rodriquezz & Fraga, 1999). Selanjutnya
dilakukan pewarnaan Gram ini bertujuan untuk melihat bakteri bersifat Gram positif
atau negatif dan bentuknya. Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu
metode empiris untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar,
yakni Gram positif dan Gram negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel.
Bakteri Gram positif ditandai dengan sel yang berwarna ungu, sedangkan bakteri
Gram negatif ditandai dengan warna sel yang merah. Pewarnaan Gram yang
dilakukan pada uji BPF dengan isolat Azospirillum sp. dilakukan dua kali, yaitu
inkubasi 2 x 24 jam dan 5 x 24 jam (Pelczar, 1993).
HCN adalah suatu racun kuat yang menyebabkan asfiksia. Asam ini akan
mengganggu oksidasi (pengakutan O2) ke jaringan dengan jalan mengikat enzim
sitokrom oksidasi. Oleh karena adanya ikatan ini, O2 tidak dapat digunakan oleh
jaringan sehingga organ yang sensitif terhadap kekurangan O2 akan sangat menderita
terutama jaringan otak. Akibatnya akan terlihat pada permukaan suatu tingkat
stimulasi daripada susunan saraf pusat yang disusul oleh tingkat depresi dan akhirnya
timbul kejang oleh hypoxia dan kematian oleh kegagalan pernafasan. Kadang-
kadang dapat timbul detak jantung yang ireguler (Darmawan, 1987). Medium yang
digunakan dalam uji, yaitu Nutrient Agar (NA) yang dicampur glycine. Setelah
diberi isolat, dimasukkan kertas Whatmann untuk mengetahui kandungan HCN
(Hartini, 2008).
Isolat Azospirillum sp. yang diuji kemampuannya dalam menghasilkan
hormon IAA yang diinokulasikan pada medium TSA 50% lalu diinkubasi 2 x 24 jam
pada suhu ruang. Selanjutnya ditambah dengan 2 ml reagen Salkowski (1 ml dari135
mg/ml FeCl3 dan 50 ml dari 35% HClO4). Kemudian disimpan di ruang gelap selama
30 menit. Interpretasi positif dengan terbentuknya IAA yang disintesis oleh bakteri
secara kualitatif dideteksi berdasarkan perubahan warna supernatan kultur menjadi
merah muda sampai merah setelah ditambah dengan reagen Salkowski (Glickman &
Dessaux, 1995).

B. Tujuan

Tujuan dari praktikum Isolasi dan Karakterisasi Mikroorganisme, antara lain

mahasiswa mengetahui cara penapisan isolat bakteri rizosfer yang mampu menambat
nitrogen bebas dari udara, melarutkan phospat organik, memproduksi HCN, dan
hormon IAA yang berperan dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Antagonis Uji BPF

Kel Fusariu Sclerotiu E.col S. 2x24 5x24 2x24 5x24
m sp. m sp. i aureu Uji Uji Uji jam jam jam jam
s HCN IAA BPN

1 + - - + + - + batang Bentuk Gram Gram

V (-) (+)

2 + - + + + - - Basil Basil Gram Gram

(-) (-)

3 + - - - + - - Basil Basil Gram Gram

(-) (+)

4 + - - + + - - Basil Basil Gram Gram

bengkok bengkok (-) (-)

5 + - - - + - - Batang Spiral Gram Gram

(-) (-)

6 + - - - + - - Batang Bulat Gram Gram

bengkok (+) (-)

7 + + + + + - - Batang Batang Gram Gram

(-) (-)

Tabel 3.1 Data Pengamatan Rombongan II

Gambar 3.1 Uji Antagonisme Dalam Gambar 3.2 Uji Antagonisme Dalam
Menghambat Bakteri Escherichia coli dan Menghambat Jamur Fusarium sp. dan
Staphylococcus aureus pada Media NA Sklerotium sp. pada Media SCN

Berdasarkan praktikum yang dilakukan, telah dilakukan uji antagonisme

menggunakan Actinomycetes untuk menghambat mikroba patogen. Uji ini dilakukan
pada tiga media yang berbeda, yaitu media PDA (Potato Dextrose Agar), SCN, dan
NA (Nutrient Agar). Hasil yang didapat adalah pada medium NA positif, terlihat
bakteri Escherichia coli dan Staphylococcus aureus tumbuh menghindari
Actinomycetes. Hasil pada medium SCN juga positif, karena terdapat zona jernih di
sekitar jamur Fusarium sp. dan Sklerotium sp.. Sedangkan pada medium PDA terjadi
kontaminasi. Menurut Kumala et al. (2015), Actinomycetes merupakan jenis
mikroorganisme yang sangat berpotensi sebagai penghasil metabolit sekunder yang
memiliki aktivitas biologi sebagai antimikroba. Actinomycetes merupakan kelompok
mikroba yang paling banyak menghasilkan senyawa bioaktif antibiotika, antifungi
dan antibakteri. Zona penghambatan pertumbuhan bakteri uji disebabkan oleh
metabolit sekunder yang dihasilkan oleh ekstrak isolat bakteri Actinomycetes.
Ekstrak bakteri Actinomycetes selalu membentuk zona bening pada setiap uji
aktivitas antibakteri.

Gambar 3.3 Hasil Uji HCN pada Gambar 3.4 Hasil Uji IAA
Media NA + Glycine pada Media TSA 50%

Berdasarkan hasil, didapati bahwa uji HCN yang dilakukan adalah positif,
karena kertas Whatmann yang diletakkan berubah warna menjadi coklat tua. Hasil
yang didapat pada uji IAA adalah negatif, karena medium tidak mengalami
perubahan warna menjadi merah muda. Dikatakan positif jika medium berubah
warna menajdi merah muda. Hal ini sesuai dengan Glickman & Dessaux (1995)
medium ditambah dengan 2 ml reagen Salkowski (1 ml dari135 mg/ml FeCl3 dan 50
ml dari 35% HClO4), kemudian disimpan di ruang gelap selama 30 menit.
Interpretasi positif dengan terbentuknya IAA yang disintesis oleh bakteri secara
kualitatif dideteksi berdasarkan perubahan warna supernatan kultur menjadi merah
muda sampai merah setelah ditambah dengan reagen Salkowski.
 Gambar 3.5 Hasil Uji BPN (Bakteri Penambat Nitrogen) pada
medium Nitrogen free Bromothymol Blue (NfB)

Hasil yang diperoleh dari praktikum acara penapisan bakteri rizosfer dalam
meningkatkan pertumbuhan tanaman kali ini adalah pada isolat Azospirillum sp. yang
telah diinokulasikan pada medium NfB menunjukkan tidak adanya pelikel yang
terbentuk setelah diinkubasi selama 2 x24 jam. Hal ini menunjukkan tidak adanya
aktivitas bakteri Azospirillum sp. dalam menambat nitrogen di dalam medium NfB
(Nitrogen free Bromothymol Blue). Hal ini tidak sesuai dengan Werner (1992) bahwa
bakteri penambat N2 di daerah perakaran seperti Azospirillum sp, telah terbukti
mampu meningkatkan secara nyata penambatan N2.

Gambar 3.6 Hasil Uji BPF pada Medium

Pikovskaya Dengan Isolat Azospirillum sp.

Gambar 3.7 Hasil Pewarnaan Gram Gambar 3.8 Hasil Pewarnaan Gram
Isolat Azospirillum sp. Inkubasi 2 x 24 Isolat Azospirillum sp. Inkubasi 5 x 24
jam jam
 Hasil yang didapat pada uji BPF yang telah diinokulasikan bakteri
Azospirillum sp. dan diinkubasi 2 x 24 jam di dalam medium Pikovskaya
menunjukkan terbentuknya zona jernih di sekeliling koloni dan memiliki sel yang
berbentuk basil (batang) dan menunjukan Gram negatif. Begitu pula hasil pewarnaan
Gram pada inkubasi 5 x 24 jam, sel berbentuk basil (batang) dan menunjukan Gram
negatif. Hal ini sesuai dengan pernyataan Kuswanti et al. (2014), kemampuan
mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan fosfat yang terikat dapat diketahui dengan
membiakkan biakan murninya pada media agar Pikovskaya yang berwarna putih
keruh, karena mengandung P tidak larut seperti kalsium fosfat Ca3(PO4)2. Saat akhir
masa inkubasi (48 - 72 jam) pertumbuhan mikroba pelarut fosfat dicirikan dengan
adanya zona bening di sekitar koloni mikroba yang tumbuh. Sedangkan mikroba
lainnya tidak menunjukkan ciri tersebut. Mikroba pelarut fosfat yang unggul dapat
diseleksi dari uji tersebut, yaitu yang menghasilkan diameter zona bening yang
paling besar dibandingkan koloni mikroba lainnya. Kemampuan pelarutan fosfat
terikat secara kuantitatif dapat pula diukur dengan menumbuhkan biakan murni
mikroba pelarut fosfat pada media cair Pikovskaya. Menurut Rueda et al. (2016),
Azospirillum sp. merupakan bakteri Gram negatif berbentuk basil, memiliki warna
cream pada koloni, dan berukuran besar juga pendek.
 IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Kesimpulan yang dapat ditarik dari hasil dan pembahasan, yaitu uji
antagonisme Azospirillum sp terhadap jamur Fusarium sp. dan Sclerotium sp pada
media SCN adalah positif, sedangkan terhadap bakteri Staphylococcus aureus dan
Escherichia coli pada medium NA didapatkan hasil positif, hal ini karena
Actinomycetes dapat menghambat pertumbuhan jamur maupun bakteri pathogen
karna mengeluarkan eksudat yang menjadi antibiotik. Uji HCN menghasilkan
perubahan warna pada kertas Whatmann yang dinyatakan positif, serta uji IAA
mendapatkan hasil negatif karena tidak terjadi perubahan warna pada medium
menjadi merah muda. Uji BPN didapatkan hasil negati, yang seharusnya isolat
Azospirillum sp. mampu membentuk pelikel pada sub permukaan medium. Uji BPF
menghasilkan zona jernih dan bakteri berbentuk batang dan merupakan Gram
negatif..
B. Saran

Saran yang dapat diberikan untuk acara praktikum kali ini sebaiknya dapat
bekerja aseptis agar hasil yang didapatkan sesuai dan tidak terjadi kontaminasi.
 DAFTAR REFERENSI

Glickman, E., & Dessaux, Y. 1995. A Critical Evaluation of The Spesificity of

Salkowski Reagent For Indole Compounds Produced By Phytopathogenic
Bacteria. Appl. Environment Microbiology, 61: pp.793-796.
Hartini. 2008. Inaktivasi Enzimatis pada Produksi Linamarin Dari Daun Singkong
Sebagai Senyawa Plastik. Momentum, 4(2): pp.1-6.
Kumala, T., Afghani, J., & Puji, A. 2015. Uji Aktivitas Antibakteri Isolat
Actinomycetes 9isp1 Dari Spons Asal Perairan Pulau Randayan. JKK, 4(2):
pp.30-36.
Kuswinanti, T., Baharuddin., & Sri, S. 2014. Efektivitas Isolat Bakteri dari Rizosfer
dan Bahan Organik Terhadap Ralstonia solanacearum dan Fusarium
oxysporum pada Tanaman Kentang. Jurnal Fitopatologi Indonesia, 10(2):
pp.68-72.
Pelczar. 1993. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press.
Rao, N. S. S. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Jakarta: UI
Press.
Rodríguez, H., & Fraga, R. 2000. Phosphate Solubilizing Bacteria And Their Role In
Plant Growth Promotion. Havana: Department of Microbiology.
Rueda, D., Gabriel, V., Norman, S., Bryan, R., Bangeppagari, M., Rajesh, R. K., &
Mariadoss, S. 2016. Effect Of Azospirillum Spp. and Azotobacter Spp. On The
Growth and Yield Of Strawberry (Fragaria Vesca) In Hydroponic System
Under Different Nitrogen Levels. Journal of Applied Pharmaceutical Science,
6(1): pp.48-54.

Taiz, L., & Zeiger, E. 1991. Plant Physiology. California: The Benjamin/Cumming.
Tarigan, Ratna Sari., & It, J. E. 2011. Seleksi Bakteri Penambat Nitrogen dan
Penghasil Hormon IAA (Indole Acetic Acid) Dari Rizosfer Tanah Perkebunan
Kedelai (Glycine Max L.). J Ilmu Tanah Ling. 10: pp.42-48