Anda di halaman 1dari 5

Naomy Octavinna

260110150059

Protokol Sintesis cDNA khas


1.

Komponen Final Conc./AMT.

10X Amplifikasi Amplifikasi Isotermal 1X

dNTP Mix (10 mM) 0,5 mM

Campuran Primer Acak 6 µM

Inhibitor RNase, Murine 20 unit

WarmStart RTx Reverse Transcriptase 0,25 μl

Volume Total Reaksi 25 μl

2. Campur dengan vortexing.

3. Inkubasi selama 5 menit pada 25 ° C untuk anil dan 10 menit pada 55 ° C untuk sintesis.

4. Heat Inactivate WarmStart RTx Reverse Transcriptase dengan inkubasi pada 80 ° C selama 10
menit

Source: https://www.neb.com/protocols/2014/10/09/typical-cdna-synthesis-protocol
Protokol Protein

1. Pilih koloni tunggal dari lempeng agar LB yang diubah atau ambil 20 μL stok gliserol dan
diinokulasikan ke dalam 5 mL kaldu LB yang mengandung antibiotik yang tepat sesuai
dengan konstruk vektor dan sel inang.
2. Inkubasi kultur pada 37 ° C untuk semalam (14-16 jam) pada 180 rpm dengan pengocokan
terus menerus sebagai kultur starter.
3. Hari berikutnya ambil lima vial budaya dan beri nama sebagai:
o • Kontrol (tidak diinduksi).
o • Diinduksi dengan tidak adanya etanol.
o • Diinduksi di hadapan 1% etanol.
o • Diinduksi di hadapan 2% etanol.
o • Diinduksi di hadapan 3% etanol.
4. Inokulasi lima vial (masing-masing berisi 5 mL medium LB dengan antibiotik yang
tepat) dengan 20 μL kultur starter semalaman.
5. Pada saat inokulasi tambahkan 1%, 2% dan 3% etanol ke medium LB dan tumbuh pada
suhu 37 ° C selama beberapa jam (sekitar 3–4 jam) dengan gemetar kuat, hingga
OD 600 mencapai 0,5–0,6 .

Catatan : Etanol harus digunakan dalam rasio v / v. Kami telah mengoptimalkan


konsentrasi etanol optimal dan diamati bahwa 3% etanol (v / v) memberikan peningkatan
maksimum dalam ekspresi protein. Di hadapan lebih dari> 5% pertumbuhan sel etanol
ditemukan terhambat.
6. Induksi ekspresi protein dengan menambahkan IPTG ke konsentrasi akhir 1,0 mM.
o • Jangan menambahkan IPTG ke budaya yang akan berfungsi sebagai kontrol yang
tidak diinduksi.
o • Konsentrasi IPTG minimal harus dioptimalkan dalam skala kecil budaya sebelum
melanjutkan ke kultur massa.
o • Waktu pertumbuhan TB yang optimal (kaldu Terrific) berbeda dengan LB (Luria
broth) Dalam kasus TB OD 600 harus lebih dari 1,0-1,5 sebelum induksi IPTG.
o • Dalam kasus media induksi otomatis, kontrol harus LB normal bukan media
induksi otomatis.Tidak perlu mengamati OD, karena tidak perlu induksi IPTG.
7. Tumbuhkan biakan selama 4-5 jam tambahan pada 37 ° C dengan getaran terus menerus.
8. Panen 1 mL sel dari masing-masing vial vial dengan sentrifugasi selama 1 menit pada
12.000 rpm.Buang supernatan (sisa media).
9. Hentikan kembali sel-sel dalam 60 μL buffer (Tris atau fosfat atau PBS, pH-8.0), 20 μL
10% SDS & 20 μL dari 5X SDS loading dye dan lisis dengan mencampur atau pipet.
10. Rebus sampel dalam 100 ° C selama 5–10 menit (Vortex sampel di antaranya).
11. Muat sampel dalam gel sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) dan
analisa. Skrining melalui uji coba adalah penting, yang akan memberikan gambaran yang
jelas tentang tingkat kelebihan ekspresi protein di hadapan 1%, 2% dan 3% etanol. Ini juga
akan memberikan kesempatan untuk membandingkan ekspresi protein rekombinan dengan
adanya dan tidak adanya etanol. Analisis SDS-PAGE akan mendukung peningkatan
lipatan ekspresi dengan peningkatan persentase etanol.

Catatan : Penyaringan percontohan dapat dilakukan pada suhu rendah mulai dari 16 ° C hingga
23°C selama 20-22 jam setelah induksi dengan IPTG, tergantung pada tingkat ekspresi dan
skrining kelarutan protein rekombinan. Dalam kasus media induksi otomatis menetaskan biakan
sampai OD 600 mencapai 0,4-0,6.Diamati bahwa beberapa protein memberikan lipatan ekspresi
yang lebih tinggi dalam suhu rendah. Skrining ini juga dapat memberikan gambaran yang jelas
tentang tingkat ekspresi protein, yang dapat membantu untuk kultur massa lebih lanjut. Untuk
kultur massa, siapkan eksperimen sesuai dengan rasio percobaan percobaan yang sama.

Source: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4635407/
3. Protokol mRNA

 Untuk strain di mana tidak mengharapkan kehilangan mRNA umum, gunakan 1 mg RNA
(total). Jika mengharapkan kehilangan mRNA umum (srb4 ts, rpb1 ts) gunakan 2/3 mg RNA
total.

 Ukur OD260 / OD280 dari semua total RNA yang disiapkan secara akurat dan secara paralel
(misalnya dengan mengukur 5 µl pengenceran 5: 100). Penentuan akurat jumlah total RNA
sangat penting untuk normalisasi hasil yang benar ketika normalisasi dengan kontrol
berduri.

 Tempatkan total RNA dengan 5 μl poli-A kontrol per total RNA dalam setiap tabung.

 Untuk total RNA 1 mg: tambahkan buffer ODB (Qiagen Oligotex kit) untuk membuat total
volume 920 µl. Catatan: Pastikan ODB + OLI Buffer benar-benar larut (mungkin perlu
tabung panas sedikit).

 Tambahkan 230 µl buffer OL1 ke setiap tabung.

 Panaskan suspensi Oligotex bead ke 37 ° C + mix (vortex) segera sebelum menambahkan


70 µl ke setiap tabung. Campurkan dengan lembut dengan menepuk-nepuk ke atas dan ke
bawah.

 Tempatkan tabung pada 65°C selama 3 menit. Campur, diamkan pada suhu kamar selama
10 menit dengan pencampuran sesekali.

 Putar 2 menit pada 14.000 g pada suhu kamar. Aspirasi supernatan (tinggalkan ~ 50 µl dalam
tabung).

 Tambahkan 600 µl buffer cuci OW1. Resuspensi beads dengan pipetting dengan lembut.
Putar 2 menit di RT dan aspirasi. Ulangi untuk 3x cuci (1X600 μl OW1, 2X600 µl OW2).
Hilangkan sisa dengan pipet setelah cucian terakhir.

 Resuspensi beads dalam 175 µl DEPC - dH2O. Resuspensi dengan pipet ke atas dan ke
bawah.

 Tempatkan tabung di 65 ° C waterbath selama 1 menit. Putar 1 menit pada 14,000xg RT.
Pindahkan eluat ke tabung segar.

 Ulangi elusi dengan 175 µl DEPC - dH2O. kolam eluat.

 Untuk menghilangkan beads: putar kolam eluat 5 menit pada rpm 14.000xg di RT.
Hilangkan 330 μl (tahu jumlah pasti), pindahkan ke tabung baru.

 Ukur OD260 / OD280 dari 30 μl eluat yang diencerkan dengan 270 µl dH2O.
 Untuk sisanya tambahkan 1/10 volume (30 µl) 3M NaOAc pH 5.2, 1 µl 20 mg / ml glikogen,
675 µl Etanol (-20 ° C).

 Tempatkan 30' pada -80 ° C atau semalaman pada -20 ° C.

 Putar 30' pada rpm 14.000x, 4°C. Hilangkan supernatan dengan pipet.

 Cuci dengan 140 µl 80% Etanol (-20 ° C). Putar, hilangkan dengan pipet

 Resuspensi pelet dengan volume DEPC - dH2O yang tepat untuk memberikan konsentrasi
akhir 0,5 mg / ml.

 Simpan pada -80 ° C.

Source: http://younglab.wi.mit.edu/expression/mRNAprep.html