ISOLASI PROTEIN

Laporan Praktikum
Disusun untuk memenuhi tugas matakuliah Teknik Analisis Biologi Molekuler
yang dibimbing oleh
Dr. Umie Lestari, M.S dan Hendra Susanto, S. Pd, M. Kes, Ph. D

Oleh
Kelompok 3/Off I
Alif Rosyidah El Baroroh 150342606362
Badrul Munir Arrosadi 150342607243
Dewi Sekar Miasih 150342606610

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
JURUSAN BIOLOGI
November 2017
A. TOPIK :Isolasi Protein Jaringan Otot Ikan
B. TUJUAN
Tujuan dalam praktikum ini sebagai berikut:
1. Mengetahuhi cara isolasi protein
2. Mengetahui cara elektroforesis SDS Page dn menghitung berat molekul
protein

C. DASAR TEORI

Protein adalah molekul organik terbanyak yang terdapat dalam sel. Fungsi
protein antara lain memicu kontraksi dalam melakukan gerak dan memicu
terjadinya berbagai proses metabolisme dalam bentuk enzim. Protein dapat pula
berperan membawa informasi dari luar ke dalam sel dan di dalam bagian-bagian
sel sendiri. Selain itu protein juga mengendalikan dapat tidaknya, serta waktu
yang tepat untuk pengungkapan informasi yang terkandung di dalam DNA, yang
diperlukan untuk sintesis protein itu sendiri (voet dan voet , 2011).
Secara kimia, protein adalah heteropolimer dari asam-asam amino yang
terikat satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein jenis apapun dan berasal dari
makhluk apapun tersusun atas 20 asam amino. Jadi sebenarnya perbedaan antara
protein yang satu dengan yang lainnya disebabkan oleh jumlah dan kedudukan
asam-asam amino di dalam tiap-tiap molekul (voet dan voet , 2011)..
Molekul protein berinteraksi dengan molekul air melalui ikatan hidrogen
dan membentuk mantel air. Dikarenakan molekul protein besar, maka di dalam air
protein membentuk larutan koloid. Adanya sejumlah elektrolit dengan konsentrasi
encer sangat meningkatkan kelarutan suatu protein (salting in). Sifat ini, yakni
kelarutan dalam bentuk larutan koloid yang dipermudah oleh mantel air dan
elektrolit encer, dimanfaatkan untuk pemisahan protein. Selain sifat tersebut,
protein juga mempunyai sifat lain yang berperan penting dan menjadi dasar dalam
pemisahan protein yaitu ukuran molekulnya yang berbeda-beda sebagai akibat
dari perbedaan jumlah asam amino penyusun protein serta muatan yang
dikandungnya (voet dan voet , 2011)..
 Sifat-sifat protein tersebut menjadi dasar pemisahan protein yang
digunakan untuk deteksi atau diagnosis molekuler. Pemisahan protein dapat
dilakukan dengan tiga cara, yaitu kromatografi gel, elektroforesis, dan salting out
Kromatografi gel berfungsi sebagai proses pemisahan protein berdasarkan berat
dan ukuran molekul. Cara ini juga sering disebut kromatografi kolom dan size
exclusion chromatography karena menggunakan butirn sintetik yang memiliki
diameter dan ukuran pori-pori tertentu sebagai penyaring molekul. Molekul yang
berukuran kecil akan mudah masuk ke pori-pori dan menjadi lambat berjalan
keluar dari kolom, sedangkan molekul dengan ukuran lebih besar akan lebih sulit
masuk ke pori-pori dan langsung menuju ke luar, sehingga hasil kromatografi
akan menunjukkan urutan pengeluaran molekul mulai dari yang terbesar hingga
yang terkecil (Holil ,2014).
Dasar dari proses elektroforesis adalah fakta bahwa protein adalah
makromolekul yang terdiri dari asam amino yang terikat secara kovalen. Setiap
protein dibedakan dari muatan elektronnya yang berikatan secara kovalen atau
ionik. Hal inilah yang menyebabkan suatu larutan dengan pH tertentu dapat
mengandung protein dengan muatan listrik yang berbeda-beda. Sebab, susunan
dan jumlah asam amino setiap protein tidaklah sama (Holil ,2014)..
Apabila larutan protein diletakkan dalam suatu medan listrik, tiap protein
akan bermigrasi ke kutub yang berlawanan dari muatan yang dikandung protein
tersebut. Protein yang bermuatan negatif akan bergerak ke anode yang adalah
kutub positif. Sementara itu, protein yang tidak bermuatan tidak akan
bergerak.PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan metode analisis
yang digunakan untuk memisahkan komponen campuran protein berdasarkan
ukurannya. Teknik ini berdasarkan prinsip bahwa molekul yang bermuatan akan
bermigrasi pada daerah elektrik ke elektroda yang berlawanan tandanya. Dengan
kata lain teknik ini menggunakan prinsip perbedaan kemampuan migrasi dari
setiap molekul (Holil ,2014)..
Teknik elektroforesis umum tersebut tidak bisa digunakan untuk menentukan
berat molekul dari molekul biologis karena pergerakan zat bergantung pada tidak
hanya ukuran tapi juga muatan. Untuk mengatasi ini, sampel biologis
membutuhkan perlakuan khusus yaitu penyeragaman muatan yang dapat
menyebabkan pergerakan zat bergantung hanya pada ukuran. Untuk protin-protein
yang memiliki ukuran dan bentuk yang berbeda, harus didenaturasi terlebih
dahulu dengan menggunakan bantuan SDS (Sodium Dodecyl Sulphate(Holil
,2014).).

D. ALAT DAN BAHAN

Alat :
1. Mortal pistil
2. Mikrotube 1,5 ml
3. Sentrifuge dingin
4. Mikropipet
5. Plate elektroforesis
6. Vortex
7. Elektroforesis
8. Tip mikropipet
9. Shaker
10. Scaner
11. Sonikator
12. Nanodrop spektrofotometer

Bahan
1. Alumunium foil
2. PBS tween-PMSF
3. Etanol PA
4. Tris HCl
5. Acrilamid-bis 30%
6. Tris Cl 1,5 M pH 6,8
7. dH2O
8. SDS 10 %
9. Temed
10. Aquades
11. APS 10%
 12. Tris Cl 1,5 pH 8,8
13. Sampel crude protein
14. RSB
15. Plastick wrap
16. Larutan destaining

E. PROSEDUR KERJA
1. Isolasi Protein Jaringan otot ikan

Organ otot

Ditimbang seberat 0,5 gr

Diletakkan pada mortal dingin

Ditambahkan pasir kuarsa secukupnya untuk mempermudah

penghancuran, dihaluskan

Ditambahkan PBS tween-PMSF sebanyak 2000 µl

Dipipet dan di masukkan ke dua mikrotube dengan ukuran 1,5 ml

Disonifikasi dengan sonikator selama 10 menit

 Disentrifugasi dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu
25° C

Diambil supernatan dan diletakkan di empat mikrotube baru masing –

masing 500 µl

Ditambahkan maing-masing 500 µl ethanol PA

Dikocok sampai tercampur

Didiamkan dalam freezer selama 24 jam

Disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 °C selama 15 menit

Dibuang etanolnya dan pelet dibirakan dengan kondisi tutup mikrotube

terbuka pada suhu ruang

Diletakkan pada wadah dengan posisi mikrotube terbuka serta ditutup

dengan alumunium foil wadah tersebut
 Dimasukkan dalam kulkas dengan suhu 4 °C selama 24 jam

Dikeluarkan dari kulkas

Ditambahkan Tris-HCL pH 6,8 sebanyak 100 µl

Dikocok sampai tercampur

Disimpan didalam frezer

Supernatan dalam tabung, supernatan dalam tabung kemudian dapat diukur

kemurniannya dengan nanodrop spektrofotometer
 2. Elektrroforesis SDS-PAGE Crude Protein Jaringan Otot ikan
a. Pembuatan separating Gel 12,5%

Mencampur bahan 2793 µl Acrimaid-Bis 30%, 2250 µl Tris-Cl 1,5 M

pH 8,8, 2046 µl dH2O, 112,5 µl SDS 10%

Di vortex hingga homogen

Ditambahkan APS 10 % 112,5 % dan temed 5 µl ke dalam mikrotube

menggunakan mikropipet

Campuran kemudian dikocok sebentar dengan mikropipet lalu

dimasukkan kedalam plate elektroforesis hingga batas

Untuk meratakan gel diberi akuades untuk membentuk permukaan yang lurus

Ditunggu 10-30 menit hingga gel mengeras

Dikeluarkan akuades dengan cara dimiringkan dan dihisap

menggunakan tissue
b. Pembuatan Stacking Gel 3%

Dicampurkan 552 µl Acrilamide-Bis 30 %, 672 µl Tris CL 1,5 M pH

8.8, 300 µl dH2O, dan 45 µl SDS 10 % ke dalam mikrotube
menggunakan mikropipet.

Di vortex hingga homogen

APS 10 % 45 µl dan temed 5 µl ditambahkan kedalam mikrotube

menggunakan mikropipet

Campuran tersebut dikocok sebentar dengan mikropipet lalu

dimasukkan ke dalam plate elektroforesis hingga batas

Sisir elektroforesis dipasang diatas bagian dari stacking gel

Ditunggu 10-30 menit hingga gel mengeras

Dilepaskan sisiran dengan hati-hati dan dikeluarkan akuades dengan

cara dimiringkan dan dihisap menggunakan tissue

Sampel crude protein dapat dimasukkan kedalam sumuran yang telah

terbentuk
 c. Running Gel Elektroforesis

Preparasi sampel dengan cara 10 µl sampel dimasukkan ke dalam

mikrotube dan menambahkan 10 µl larutan RSB non reducing pada
mikrotube dan diberikan lubang 3 tususk dan ditutup dengan plastik
wrap

Sampel dipanaskan dalam akuades yang sudah mendidih selama 5 menit

Sampel dipanaskan dalam akuades yang sudah mendidih selama 5 menit

Crude yang sudah dingin dapat dimasukkan ke dalam sumuran dengan

volme 10 µl setap sumuran

Dielektroforesis dengan voltase 130V 60 mA (2 plate) higga tracking dye 0,5

cm diatas dasar

d. Pewanaan Gel dengan Commasie Brilian Blue R250

Gel hasil elrktroforesis direndam dengan larutan staining hingga terendam

Shaker gel selama 30 menit

Gel direndam larutan destaining lalu di shaker selama semalam

Visualisasi dengan scaner untuk melihat hasil pita.

F. HASIL DAN ANALISIS

Sebelum dilakukan elektroforsis terlebih dahulu sampel di periksa

kemurniannya dengan nanodropspektrofotometer sehingga menghasilkan nilai
kemurnian pada grafik dibawah:

Keterangan :
Unit : mg/ml
Protein conc : 14,886
A280 : 14886
260/280 : 1,26
Sampel type : 1 Abs ; 1 mg/ml
Gel hasil elektroforesis
Perhitungan Berat Molekul Protein

1) Ditentukan nilai b dan a (a1- a9) pada marker, yakni dengan menggunakan
penggaris, diukur mulai dari ujung sumuran sampai dengan RSB untuk
mendapatkan nilai b. Lalu untuk mendapatkan nilai a yakni diukur dari
ujung sumuran sampai dengan pita pertama. Lalu jarak dari sumuran ke
pita kedua merupakan nilai a2 dan seterusnya sampai a9

2) setelah diketahhui nilai b dan a kemudian di masukkan nilainya kedalam

tabel Ms excel dan menurut literatur berat molekul marker protein
diketahui sebagai berikut :
marker Sampel 1 Sampel 2

RSB
3) Gel hasil elektroforesis yang telah di scan selanjutnya dihitung berat
molekulnya dengan bantuan protein standart sebagai marker untuk
menghitung Rf (ratardakan factor) dari masing-masing pita dengan rumus
:

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑎𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝑏𝑎𝑤𝑎ℎ

Rf: 𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑎𝑖 𝑅𝑆𝐵
4) Dilanjutkan ke spss untuk pembuatan kurva berat molekul standart yang
digunakan yakni data Rf dan log BM pada variabel view seperti gambar
berikut:

5) Di klik pada data view, sehingga muncul tampilan seperti gambar berikut :
6) Di klik tab analyze lalu dipilih regresion dan dipilih lagi untuk curve
estimation seperti yang namapk pada gambar:

7) Pada kolom dependent dipilih log BM, sedangkan untuk variabel dipilih
Rf lalu di klik ok
8) Didapatkan kuva linear seperti yang nampak pada gambar , pada tabel
coeficients terdapat nilai Rf yang digunakan sebagai nilai a dan (constant)
sebgai nilai b lalu dimasukkan kedalam persamaan y = ax + b

9) Persamaan yang telah diperoleh digunakan untuk menccari berat molekul

pada sampel yang di uji
 *Setelah dilakukan langkah seperti diatas didapatkan hasil a, b, dan Rf
pada marker sebgai berikut :

perhitungan berat molekul protein marker

no a b rf berat molekul (BM) log BM
1 0,5 6,5 0,076 198 2.29666519
2 1,5 6,5 0,230 62 1.792391689
3 2 6,5 0,307 49 1.69019608
4 2,8 6,5 0,430 38 1.579783597
5 3,4 6,5 0,523 28 1.447158031
6 4 6,5 0,615 18 1.255272505
7 4,2 6,5 0,646 14 1.146128036
8 5,9 6,5 0,907 6 0.77815125
9 6,3 6,5 0,969 3 0.477121255
Sehingga dalam analisis spss didapatkan hasil sebagi berikut :

Coefficients

Unstandardized Standardized
Coefficients Coefficients

B Std. Error Beta t Sig.

Rf -1.815 .107 -.988 -16.949 .000

(Constant) 2.333 .064 36.724 .000
Kemudian kurva regresi yang terbentuk sebagai berikut:
Didaptkan persamaan :

Y = ax +b

Y = - 1864 x + 2,258

Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel (jaringan otot ikan ) dimana
nilai Rf yakni sama dengan x, lalu nilai X yang didapatkan disubtitusikan kedalam
persamaan yang telah didapatkan dari perhitungan yakni Y = - 1864 x + 2,258.
Setelah nilai disubtitusikan maka akan didapatkan nilai y , yakni sama dengan log
BM. Untuk mengetahui BM (berat molekul) maka nilai log BM di anti log
sehingga didapatkan hasil pada tabel sebagi berikut :

PERHITUNGAN BERAT MOLEKUL PROTEIN SAMPEL

No a b Rf (x) BM (AntilogBM) logBM (y)
1 1.4 6.5 0.215384615 87.51387678 1.942076923
2 2.6 6.5 0.4 40.45758917 1.607
3 3.2 6.5 0.492307692 27.50815979 1.439461538
4 3.5 6.5 0.538461538 22.6825725 1.355692308
5 4.1 6.5 0.630769231 15.42246688 1.188153846
6 4.4 6.5 0.676923077 12.71699836 1.104384615
7 4.9 6.5 0.753846154 9.220813345 0.964769231
8 5.1 6.5 0.784615385 8.108174316 0.908923077
9 5.2 6.5 0.8 7.603262769 0.881
10 5.5 6.5 0.846153846 6.269469143 0.797230769
11 5.8 6.5 0.892307692 5.16965473 0.713461538
12 6 6.5 0.923076923 4.545852967 0.657615385
G. PEMBAHASAN
Isolasi Protein

Protein adalah biopolimer yang terdiri dari banyak satuan asam Amino yg
dihubungkan oleh ikatan peptide. Beberapa protein merupakan komponen utama
dalam jaringan struktur (otot, rambut, kuku, kulit).Kata protein berasal dari bahasa
Mesir “proteus” yang terjemahan kasarnya berarti “yang utama”.Protein adalah
sumber asam-asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N ada pula
yang mengandung unsur S dan P.Protein tersusun dari beberapa asam amino yang
saling berikatan (mempunyai lebih dari 100 asam amino disebut protein) (Amin et
al. 2014).

Kebanyakan peptides dan protein yang diisolasi dari sel dan jaringan
tersusun antara 2 hingga 2000 asam amino. Diasumsikan rata-rata bobot molekul
dari semua amino adalah 110, bobot molekular kebanyakan peptide dan rantai
protein berkisar dari 220 hingga 220.000, walaupun banyak yang lebih besar telah
ditemukan. Tidak peduli berapa banyak asam amino dihubungkan oleh ikatan
peptide, selalu terdapat dua ujung rantai yang berbeda: suatu ujung amino
terminal (atau N-terminus) dan suatu ujung karboksil terminal (atau C-
terminus(Amin et al. 2014)).

Denaturasi adalah rusaknya struktur protein tetapi tidak sampai merusak

struktur primer (ikatan peptida). Setiap perubahan terhadap struktur
sekunder/tertier protein.Molekul protein dapat pula mengendap yangdisebut
dengan peristiwa koagulasi.Denaturasi belum tentu mengakibatkan
koagulasi.Potein dapat saja mengendap, tetapi dapat kembali ke keadaan semula
disebut denganflokulasi. Pada proses elektroforesis denaturasi diperlukan untuk
memecah polimer menjadi monomer-monomer dalam bentuk pita-pita protein.
Faktor-faktor yang mempengaruhi:

1. suhu yang tinggi

2. keasaman (perubahan pH yg ekstrim)
3. zat kimia tertentu (urea, deterjen)
4. karena pengaruh mekanik (guncangan)
5. penyinaran/ radiasi UV
6. konsentrasi ion hidrogen yg tinggi
7. garam-garam dari logam berat : Ag2+, Hg2+, Pb2+
8. pelarut organik: aseton, alkohol (Amin et al. 2014)

Protein yang tersusun dari rantai asam amino akan memiliki berbagai
macam struktur yang khas pada masing-masing protein. Karena protein disusun
oleh asam amino yang berbeda secara kimiawinya, maka suatu protein akan
terangkai melalui ikatan peptida dan bahkan terkadang dihubungkan oleh ikatan
sulfida. Adapun struktur protein meliputi struktur :

Gambar 1 . Struktur primer dari protein (Campbell et al., 2009).

Struktur primer merupakan struktur yang sederhana dengan urutan-urutan

asam amino yang tersusun secara linear yang mirip seperti tatanan huruf dalam
sebuah kata dan tidak terjadi percabangan rantai (Gambar 1). Struktur primer
terbentuk melalui ikatan antara gugus α–amino dengan gugus α–karboksil
(Gambar 3). Ikatan tersebut dinamakan ikatan peptida atau ikatan amida. Struktur
ini dapat menentukan urutan suatu asam amino dari suatu polipeptida (Voet &
Judith, 2009).
 Struktur sekunder merupakan kombinasi antara struktur primer yang linear
distabilkan oleh ikatan hidrogen antara gugus =CO dan =NH di sepanjang tulang
belakang polipeptida. Salah satu contoh struktur sekunder adalah α-heliks dan β-
pleated.Struktur ini memiliki segmen-segmen dalam polipeptida yang terlilit atau
terlipat secara berulang. (Campbell et al., 2009).

Gambar 2. Struktur sekunder α-heliks (Murray et al, 2009).

Struktur α-heliks terbentuk antara masing-masing atom oksigen karbonil

pada suatu ikatan peptida dengan hidrogen yang melekat ke gugus amida pada
suatu ikatan peptida empat residu asam amino di sepanjang rantai polipeptida
(Murray et al, 2009).
Struktur tersier dari suatu protein adalah lapisan yang tumpang tindih di
atas pola struktur sekunder yang terdiri atas pemutarbalikan tak beraturan dari
ikatan antara rantai samping (gugus R) berbagai asam amino (Gambar 3). Struktur
ini merupakan konformasi tiga dimensi yang mengacu pada hubungan spasial
antar struktur sekunder. Struktur ini distabilkan oleh empat macam ikatan, yakni
ikatan hidrogen, ikatan ionik, ikatan kovalen, dan ikatan hidrofobik. Dalam
struktur ini, ikatan hidrofobik sangat penting bagi protein. Asam amino yang
memiliki sifat hidrofobik akan berikatan di bagian dalam protein globuler yang
tidak berikatan dengan air, sementara asam amino yang bersifat hodrofilik secara
umum akan berada di sisi permukaan luar yang berikatan dengan air di
sekelilingnya (Murray et al, 2009).

Gambar 3. Bentuk struktur tersier dari protein denitrificans cytochrome C550

pada bakteri Paracoccus denitrificans (harvey, 2000).

Struktur kuarterner adalah gambaran dari pengaturan sub-unit atau

promoter protein dalam ruang. Struktur ini memiliki dua atau lebih dari sub-unit
protein dengan struktur tersier yang akan membentuk protein kompleks yang
fungsional. ikatan yang berperan dalam struktur ini adalah ikatan nonkovalen,
yakni interaksi elektrostatis, hidrogen, dan hidrofobik. Protein dengan struktur
kuarterner sering disebut juga dengan protein multimerik. Jika protein yang
tersusun dari dua sub-unit disebut dengan protein dimerik dan jika tersusun dari
empat sub-unit disebut dengan protein tetramerik (Gambar 4) (Murray et al,
2009).
 Gambar 4. Beberapa contoh bentuk struktur kuartener.

Protein adalah salah satu komponen penyusun sel yang berperan dalam
membangun sel, menggantikan sel yang rusak, menjadi penyusun enzim, hormon,
dan lain-lain. Berdasarkan komponen penyusunnya maka protein tersusun atas
banyak asam amino hasil proses translasi yang dilakukan oleh sel. Oleh karena
protein merupakan makromolekul yang ada di dalam sel dan memiliki gugus asam
(COOH) dan dapat juga memiliki gugus basa (NH2), serta protein mudah rusak
maka ekstraksi protein harus memperhatikan agar struktur protein tidak rusak
(mengalami denaturasi) dengan cara melakukan proses isolasi pada suhu rendah
(0-4ºC) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung pada jenis protein yang
dianalisis) (Holil 2014).
Langkah pertama dalam isolasi protein, atau biologis lainnya molekul,
adalah untuk membuatnya menjadi solut. Dalam beberapa kasus, seperti protein
serum darah, alam sudah dilakukan begitu. Namun, protein biasanya harus
dibebaskan dari sel yang berisi itu. Metode pilihan untuk prosedur ini tergantung
pada karakteristik mekanik dari jaringan sumber serta lokasi protein yang
dibutuhkan di dalam sel (Voet, dan Voet, 2011).
Proses isolasi protein secara umum sama dengan isolasi pada DNA
maupun RNA yaitu terdiri dari beberapa tahap yang meliputi tahap memisahkan
sel dari jaringan, tahap menghancurkan membran/dinding sel, tahap memisahkan
organel dari molekul penyusunnya serta tahap memisahkan protein dari molekul
penyusun yang lain. Jika protein diisolasi dari darah maka dapat menggunakan
jaringan, plasma atau serum yang ada dalam darah. Oleh karena itu darah terlebih
dahulu harus dipisahkan dari sel darah melalui proses sentrifugasi (Holil 2014).
Penghancuran se dapat dilakukan dengan cara kimiawi dan mekanik ,Ini
mungkin termasuk beberapa siklus Pembekuan dan pencairan, penggilingan
dengan pasir, alumina, atau manik-manik kaca, atau penggunaan blender
berkecepatan tinggi (serupa ke alat dapur yang sudah dikenal), homogenizer
(sebuah alat untuk menghancurkan jaringan antara piston yang erat dan lengan
yang bisa digerakkan secara manual atau mekanis), a Pers Prancis (perangkat
yang menggunting sel terbuka dengan menyemprotkan mereka pada tekanan
tinggi melalui lubang kecil), atau sonikator (yang memecahkan sel terbuka
melalui getaran ultrasonik. Begitu sel-sel telah terbuka, disentrifugasi untuk
menghilangkan partikulat puing sel, sehingga meninggalkan protein yang diminati
solusi supernatan Jika protein yang dibutuhkan adalah komponen rakitan
subselular seperti membran atau mitokondria, cukup besar Pemurnian protein
dapat dilakukan dengan pemisahan pertama rakitan subselular dari sisa materi
seluler Hal ini biasanya dilakukan dengan diferensial sentrifugasi, Jika protein
yang diminati terletak di sitosol sel, pembebasannya hanya membutuhkan
pemecahan terbuka (lisis) sel(Voet, dan Voet, 2011).
Dalam metode yang paling sederhana dan paling lembut untuk
melakukannya, yang dikenal sebagai lisis osmotik, sel-sel ditangguhkan solusi
hipotonik; yaitu solusi di mana total Konsentrasi molar zat terlarut kurang dari
yang ada di dalam sel dalam keadaan fisiologis normalnya. Dibawah pengaruh
Kekuatan osmotik, air berdifusi menjadi lebih terkonsentrasi larutan intraselular,
sehingga menyebabkan sel membengkak dan ledakan. Metode ini bekerja dengan
baik dengan sel hewan, namun dengan Sel yang memiliki dinding sel, seperti
bakteri atau sel tumbuhan, memang begitu biasanya tidak efektif. Penggunaan
enzim, seperti lisozim, yang secara kimia menurunkan dinding sel bakteri (Voet,
dan Voet, 2011).
 Begitu protein telah dikeluarkan dari lingkungan alami, itu menjadi
terkena banyak agen yang bisa ireversibel merusaknya Pengaruh ini harus
dikontrol dengan hati-hati pada semua tahap proses pemurnian atau hasil dari
Protein yang dikehendaki bisa sangat berkurang atau bahkan dihilangkan.
Integritas struktural banyak protein sensitif terhadapnya pH sebagai konsekuensi
dari banyak kelompok asam basa. Untuk mencegah kerusakan bahan biologis
karena variasi dalam pH, mereka secara rutin dilarutkan dalam larutan penyangga
efektif dalam kisaran pH di mana bahan stabil. Protein mudah didenaturasi dengan
suhu tinggi. Meskipun Stabilitas termal protein sangat bervariasi, banyak dari
mereka perlahan denatur di atas 25 ° C. Oleh karena itu, pemurnian protein
biasanya dilakukan pada suhu dekat 0 ° C. Namun, ada banyak protein yang
dibutuhkan suhu yang lebih rendah, beberapa bahkan lebih rendah dari -100 ° C,
untuk stabilitas Sebaliknya, beberapa protein labil tidak stabil di bawah suhu
karakteristik (Voet, dan Voet, 2011).
Sel mengandung protease (enzim yang mengkatalisis hidrolitik
pembelahan ikatan peptida) dan degradatif lainnya enzim yang, pada lisis sel,
dibebaskan menjadi di larutan. Enzim degradasi sering dapat dianggap tidak aktif
pada pH dan suhu itu tidak berbahaya bagi protein yang diminati. Kalau tidak,
Enzim ini seringkali dapat dihambat secara khusus oleh agen kimia tanpa
mempengaruhi protein yang diinginkan. Tentu saja, karena pemurnian protein
berkembang, lebih banyak lagi dan lebih banyak enzim degradatif ini dieliminasi
(Voet, dan Voet, 2011).
Banyak protein didenaturasi dengan kontak dengan antarmuka air-air, dan,
pada konsentrasi rendah, signifikan Fraksi protein yang ada mungkin hilang
akibat adsorpsi permukaan. Oleh karena itu, larutan protein harus ditangani
sedemikian rupa untuk meminimalkan buih dan harus dijaga tetap terkonsentrasi.
Tentu saja ada faktor lain yang menjadi protein mungkin sensitif, termasuk
oksidasi sistein residu untuk membentuk ikatan disulfida; kontaminan logam
berat, yang mungkin secara ireversibel mengikat protein; dan konsentrasi garam
dan polaritas larutan, yang harus disimpan dalam kisaran stabilitas protein.
Akhirnya, Banyak mikroorganisme menganggap protein menjadi lezatLarutan
protein harus disimpan dalam kondisi itu menghambat pertumbuhan
mikroorganisme [misalnya, di kulkas dan / atau dengan sejumlah kecil zat beracun
yang terjadi tidak bereaksi dengan protein, seperti sodium azide (NaN3)] (Voet,
dan Voet, 2011).
Protein hasil isolasi dengan menggunakan buffer ekstrak dan reagen lain
perlu diukur kadar protein yang terkandung di dalamnya. Pengukuran kadar
protein dilakukan dengan tujuan untuk mengetahui kandungan protein yang
terdapat dalam sampel yang diisolasi. Selain itu pengukuran dilakukan juga
dengan tujuan untuk mengecek proses isolasi yang dilakukan apakah berhasil atau
tidak. (Holil 2014)

Menghitung Berat Molekul Protein Hasil Elektroforesis SDS page

Protein adalah heterobiopolimer yang terdiri dari asam amino melalui
ikatan peptida. Protein-protein ini dibedakan berdasarkan muatan elektronnya
yang berikatan secara ionik atau kovalen. Hal inilah yang menyebabkan suatu
larutan protein memiliki muatan listrik yang berbeda-beda. Selain itu, dapat juga
dibedakan berdasarkan berat molekulnya (Seidman, danMoore. 2000)
Pada teknik pemisahan protein dengan metode elektroforesis, protein
serum dipisahkan berdasarkan muatan listriknya. Apabila larutan protein
diletakkan dalam suatu medan listrik, tiap protein akan bermigrasi ke kutub yang
berlawanan dari muatan yang dikandung protein tersebut. Protein yang bermuatan
negatif akan bergerak ke anode yang adalah kutub positif. Sementara itu, protein
yang tidak bermuatan tidak akan bergerak (Seidman, danMoore. 2000).
Salah satu metode PAGE yang umumnya digunakan untuk analisa
campuran protein secara kualitatif adalah SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate
Polyacrilamide Gel Electroforesis). Prinsip penggunaan metode ini adalah
migrasi komponen akril amida dengan N.N` bisakrilamida. Kisi – kisi tersebut
berfungsi sebagai saringan molekul sehingga konsentrasi atau rasio akrilamid
dengan bisakrilamid dapat diatur untuk mengoptimalkan kondisi migrasi
komponen protein. Metode ini sering digunakan untuk menentukan berat molekul
suatu protein disamping untk memonitor pemurnian protein (Wilson dan Walker,
2000).
 SDS merupakan detergen anionic yang berfungsi mendenaturasikan protein,
memberikan muatan negative pada protein dan molekul hidrofobik. Hal tersebut
akan menyebabkan protein kehilangan struktur secondary, tertiary atau
quaternary nya. Protein dengan SDS akan bermuatan negatif dan ketika
dimasukkan ke dalam tempat elektrik, protein tersebut akan bermigrasi ke
elektroda yang bermuatan positif dan terpisahkan berdasarkan ukuran.SDS-PAGE
menggunakan gel berupa gel poliakrilamid yang bersifat neurotoksik. Gel
poliakrilamid terbentk dari hasil polimerasi monomer akrilamid dan bisakrilamid.
Polimerasi tersebut dapat diinisiasi oleh ammonium persulsat (APS) yang dapat
membentuk radikal bebas (Seidman, dan Moore. 2000).

Gambar 1. Struktur Protein Setelah diberi SDS ((Martin,1996)

Sistem buffer terdiri dari continous system dan discontinuous system .

Continous systemmenggunakan satu jenis gel yaitu menggunakan resolving gel,
sementara discontinous system menggunakan dua jenis gel berupa resolving
gel dan stacking gel. Stacking gel berfungsi untuk menahan sementara agar
sampel bermigrasi pada waktu yang bersamaan. Resolving gel berfungsi untuk
memisahkan molekul-molekul yang ada berdasarkan berat molekulnya (Voet dan
Voet, 2011).
 Pewarnaan gel pada teknik SDS-PAGE terdiri dari commasie briliant blue
staining dan silver salt staining. Commasie briliant blue straining adalah
pewarna tekstil trifenilmetana, dan lebih sering digunakan di dalam teknik SDS
PAGE. Commasie briliant blue straining banyak beberapa kelebihan yaitu harga
yang relatif murah, mengikat protein secara spesifik, bekerja cepat. Silver salt
staining memiliki kelebihan yaitu hasilnya lebih akurat jika
dibandingkan coomassie blue staining. Kekurangan silver salt staining yaitu harga
yang lebih mahal dan membutuhkan waktu yang lebih lama (Voet, D dan Voet,
2011).Fungsi pewarna adalah untuk membantu memonitor jalannya elektroforesis.
Berat molekul protein dapat diketahui dengan membandingkan Rf protein dengan
protein standar yang berat molekulnya telah diketahui (Wilson dan Walker,2000).
Penggunaan poliakrilamida mempunyai keunggulan dibandingkan dengan
gel lainnya, karena tidak bereaksi dengan sampel dan tidak membentuk matriks
dengan sampel, sehingga tidak menghambat pergerakan sampel yang
memungkinkan pemisahan protein secara sempurna. Selain itu, gel poliakrilamida
ini mempunyai daya pemisahan yang cukup tinggi. Penggunaan SDS berfungsi
untuk mendenaturasi protein karena SDS bersifat sebagai deterjen yang
mengakibat ikatan dalam protein terputus membentuk protein yang dapat terelusi
dalam gel begitu juga mercaptoetanol (Voet, D dan Voet, 2011).

Komponen penting yang membentuk gel poliakrilamida adalah akrilamida,

bis akrilamida, ammonium persulfate dan TEMED (N,N,N’,N’
tetrametilendiamin). Akrilamida sebagai senyawa utama yang menyusun gel
adalah merupakan senyawa karsinogenik. Ammonium persulfate berfungsi
sebagai inisiator yang mengaktifkan akrilamida agar bereaksi dengan molekul
akrilamida yang lainnya membentuk rantai polimer yang panjang. TEMED
berfungsi sebagai katalisator reaksi polimerisasi akrilamid menjadi gel
poliakrilamid sehingga dapat digunakan dalam pemisahan protein. Bis‐akrilamida
berfungsi sebagai cross‐linking agent yang membentuk kisi‐kisi bersama polimer
akrilamida. Kisi‐kisi tersebut berfungsi sebagai saringan molekul protein.
Perbandingan antara akrilamida dengan bis akrilamida dapat diatur sesuai dengan
berat molekul protein yang dipisahkan (Voet, D dan Voet, 2011).
.
Semakin rendah berat molekul protein yang dipisahkan, maka semakin tinggi
konsentrasi akrilamida yang digunakan agar kisi‐kisi yang terbentuk semakin
rapat. Dalam preparasi gel, konsentrasi gel yang akan dibuat disesuaikan dengan
berat molekulnya semakin berat maka persenan gel yang dibuat semakin kecil.
APS dan TEMED merupakan katalisator dan harus diberikan terakhir dalam
pencampuran pada tahap preparasi gel. Konsentrasi katalis sangat penting.
Anyaman gel yang tidak baik dapat diakibatkan konsentrasi katalis yang tidak
akurat. Pemberian APS dan TEMED dilakukan ketika akan dimasukkan ke dalam
loyang atau gel caster. PAda campuran stacking gel jangan dulu diberikan APS
dan TEMED sebelum separating gel karena akan cepat mengeras atau sudah
terlebih dahulu membentuk gel. Jika demikian, akan sulit untuk memasukkan
campuran stacking gel tersebut ke dalam Loyang. Stacking gel dimasukkan
apabila sisa separating gel pada baker glass sudah mulai membentuk gel. Itu
tandanya campuran separating gel yang dimasukkan ke dalam loyang sudah mulai
mengeras (Holil, 2014).
Pada tahap preprasi sampel, campuran RSB atau b-mercaptoetanol
digunakan untuk memotong ikatan disulfide agar mudah bermigrasi dan
menunjukkan bentuk migrasi yang linier pada gel. Sedangkan pemanasan
dilakukan dengan tujuan mengoptimalkan pengkatalisnya agar benar-benar linier.
Pewarnaan bisa dilakukan dengan berbagai staining atau pewarnaan. Pewarna
silverstain digunakan jika berat protein kurang dari 4 nanogram. Protein
glikoprotein tidak bisa menggunakan pewarnaan kromasin. Pewarna yang
digunakan untuk protein gikoprotein adalah PAS. Gel yang didalam chamber
disiram dengan larutan biru kemudian diberi destaining. Destaining digunakan
untuk memberikan latar putih agar kromasi yang diserap protein dapat terlihat.
Ketika dialiri listrik, proteinnya luruh (Holil, 2014).
Apabila diperhatikan posisi pita dari sampel dan pita-pita dari marker pada
gel, akan terlihat bahwa pita sampel membentuk garis lurus dengan marker. Hal
ini menunjukkan bahwa sampel tersebut memiliki berat molekul yang sama
karena sampel yang digunakan sama, yaitu enzim pepsin. Molekul dengan berat
yang sama akan bergerak menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis
lurus (Suranto, 2006).
Pita-pita bisa terbentuk atau nampak disebabkan karena adanya sejumlah
partikel sampel yang tersangkut pada titik-titik tertentu dalam gel akibat adanya
muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju katoda. Partikel yang memiliki
berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga membentuk
beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat
molekulnya (Hames, 2004). Molekul dengan berat yang sama akan bergerak
menempuh jarak yang sama sehingga membentuk garis lurus (Bollag, 2009).
Setelah dilakukan analiis kuantifitas protein didapatkan hasil kemurnian
sebesar 1,26 mg/dl. Kemudian dilakukan elektroforesis pada sampel tersebut. Gel
hasil elektroforesis yang telah di scan selanjutnya dihitung berat molekulnya
dengan bantuan protein standart sebagai marker untuk menghitung Rf (ratardakan
factor) dari masing-masing pita dengan rumus :

𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑎𝑖 𝑝𝑎𝑑𝑎 𝑝𝑖𝑡𝑎 𝑏𝑎𝑤𝑎ℎ

Rf:
𝑗𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑝𝑒𝑟𝑔𝑒𝑟𝑎𝑘𝑎𝑛 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑎𝑖 𝑅𝑆𝐵

Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel (jaringan otot ikan ) dimana nilai Rf
yakni sama dengan x, lalu nilai X yang didapatkan disubtitusikan kedalam
persamaan yang telah didapatkan dari perhitungan yakni Y = - 1864 x + 2,258.
Setelah nilai disubtitusikan maka akan didapatkan nilai y , yakni sama dengan log
BM. Untuk mengetahui BM (berat molekul) maka nilai log BM di anti log.
H. SIMPULAN

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan :

1. Untuk mengisolasi protein terlebh dahulu dilakukan pelisisan membran

dengan cara mekanik dan kimia, kemudian di sentrifugasi dan
ditambahkan etanol PA, kemudian disentrifugasi kembali dan diuapkan,
setelah diuapkan ditambahkna Tris HCl , di homogenkan kemudian
disimpan dalam kulkas dalam bentuk supernatan dalam tabung
2. SDS‐PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrilamide Gel Electroforesis).
digunakan untuk menentukan berat molekul suatu protein disamping untk
memonitor pemurnian protein. Setelah itu dihitung a,b dan Rf dari sampel
(jaringan otot ikan ) dimana nilai Rf yakni sama dengan x, lalu nilai X
yang didapatkan disubtitusikan kedalam persamaan maka akan didapatkan
nilai y , yakni sama dengan log BM. Untuk mengetahui BM (berat
molekul) maka nilai log BM di anti log
 Daftar Rujukan

Amin, M., Lukiati, B., Maslikah, A., I., dan balqis. 2014. Bahan Ajar Biokimia.
Malang : Universitas Negeri Malang (tidak diterbitkan)

Bollag, D.M. and Edelstein, S.J. 2009. Protein Methods. New York: A John
Wiley and Sons Inc

Campbell, Neil A., dkk2009. Biologi Edisi Kedelapan Jilid 1 . Jakarta: Erlangga

Hames, B.D & Rickwood. 2004. A Practical Approach: Gel elektrophoresis

protein. Huntington: Robert E Krieger Publishing Compan

Harvey, D..(2000). Modern Analytical Chemistry. McGraw-. Hill : New York.

Holil, K. 2014. Petunjuk Praktikum Analisis Biologi Molekuler. Malang :UIN
MALIKI Malang

Martin, R. 1996. Gel electroforesis: Nucleid acids. Bros Scientific Publishers

Ltd. : Oxford

Murray, R., K., Granner, D., K. Dan Rodwell, V., W. 2009. Biokimia Harper.
Jakarta : EGC

Seidman, L.A. & C.J. Moore. 2000. Basic laboratory for biotechnology:
Textbook and laboratory reference. Prentice Hall, Inc. : New Jersey

Suranto. 2006. Electrophoresis Studies of Ranunculus Triplodantus Population.

Biodiversitas. 1(1) 1-7

Voet, D and Voet, J., G. 2011.Biochemistry 4 th. USA : JOHN WILEY & SONS
, INC.

Wilson K. 1994. Protein and enzyme techniques In Practical Biochemistry, (ed.

Wilson K and Walker JM), Cambridge University Press. p.161‐226.
Lampiran

No Nama bahan Komposisi Fungsi

1. PBS tween NaCl 8,74 gr Sebagai ringer dan
Na2HPO4 1,7799 gr pelisis membran
Aquades hingga 1000 sel
ml
HCl
NaOH
Tween 50 µl

2. SDS Memebrikan
ikatan negatif
pada protein
sehingga
membentuk linear
3. Tris HCl Sebagai larutan
penyangga
4. Acrilamid-bis 30% Menghasilkan
Separating Gel Tris Cl 1,5 M pH 6,8 profil pita protein
dH2O dengan berat
SDS 10 % molekul 6-200
Temed kDa
Aquades
APS 10%
5. Stacking Gel Tris Cl 1,5 pH 8,8 Mengelompokkan
Acrilamid-bis 30% protein dengan
dH2O berat molekul
SDS 10 % yang berbeda
Temed
Aquades
 APS 10%
6. APS Iniasiator
akrilamida agar
bereaksi dengan
akrilamida yang
lain membentuk
poliakrilamida
7. Bis-akrilamida Sebagai cross
linking agen yang
membentuk kisi-
kisi bersama
polimer
akrilamida
8. Temed Katalisator reaksi
polimerisai
akrilamid mnjadi
apoliakrilamid
9. Aquades Melepas gel
akrilamid
10. Protein standar Mengidentifikasi
(marker) berat molekul dari
campuran
polypeptida
proteinyang
digunakan
memiiki rentang
berat molekul 15
kDa-250 kDa
11. Bromo Fenol Blue Sebagai pewarna
molekul protein
12. RSB -0,3 M Tris HCL pH 4,8 Membantu
-Gliserol 25 % memecah ikatan
 -SDS 10 % protein
-β Mercaptoetanol

13 Larutan destaining -Asam asetat glasial Sebagai pelarut

- metanol absolut pewarna yang
-aquades berlebihan pada
larutan staining
Larutan Staining - Metanol absolut Memberikan
- Asam asetat warna pada pita-
glasial pita protein
- Comasi briliant
Blue
- Aquades
Running Buffer - Glisine 14,4 gr Memberikan ion
- Trise Base 3,03 untuk
- SDS 1 gr konduktivitas
- Aquades
- HCl
- NaOh
-

PMSF -trise base 0,1211 gr Protein agar tiidak

- EDTA 0,0074 terhidrolisis oleh
- NaCl 0,8775 protease
-PMSF 0,009
-NP4O 0,125
-Deionazed water
hingga 100 ml
Air Deion Pelarut yang
mengandung ion
EDTA Sebagai
penghancur sel
 dan mengikat ion
magnesium yang
diperlukan oleh
sel untuk menjaga
membran sel
secara keseluruhan
NaCl Sebagai bahan
penetral pada gula
phospat
Gliserol Sebagai pemberat
molekul protein
-β Mercaptoetanol Sebagai pemotong
ikatan protein
PBS Sebgai ringer
Etanol absolut Mengurangi
kelauran protein
dalam buffer
untuk proses
purifikasi protein
N
NAMA GAMBAR FUNGSI
O

- Alat yang digunakan untuk

Heater mencampurkan larutan bahan
and dengan menggunakan magnetic
Stirer stirer.
1.
Thermoly - Fungsinya untuk memanaskan
ne (boiling) air atau sampel dalam
cimarec*2 proses disosiasi protein dalam
Reducing Sample Buffer.

- Tip mikropipet EPENDORF

bewarna putih bening yang
Tip dipasangkan pada mikropipet
2. Mikropip dengan kapasitas 0,5-10 µl,
et - Tip mikropipet EPENDORF
bewarna kuning yang
dipasangkan pada mikropipet
dengan kapasitas 10-100 µl,

Vortex - Alat yang digunakan untuk

3. Maxi Mix menghomogenisasikan
II (mencampurkan) suatu larutan.
 - Fungsi untuk menjaga sampel
SENTRI
tetap dingin selama sentrifugasi.
FUS
- Sentrifus ini berkecepatan tinggi,
6. DINGIN
dengan kecepatan maksimum
TIPE
18000 rpm, dengan kisaran
18R
temperatur −20𝑜 C- 40𝑜 C

- Thermo Scientific ™ NanoDrop

2000 dan 2000c adalah spektrum
spektrum penuh, spektrofotometer
UV
- Vis yang digunakan untuk
Thermo
mengukur dan menilai kemurnian
Scientific
9. DNA, RNA, Protein dan banyak
Nanodro
lagi. NanoDrop 2000 dan 2000c
p 2000
adalah satu-satunya
spektrofotometer mikrovolume
dengan teknologi retensi sampel
yang dipatenkan yang mengukur
volume sampel sekecil 0.5μL.
- Digunakanuntukmemisahkan pita-
pita protein
berdasarkanberatmolekul
Elektrofo
12 (dalamsatuan Dalton/kDa) pada
resis
. gel poliakrilamid.
Vertikal
- Elektroforesis vertikal yaitu
Poliakrilamida (PAA), digunakan
untuk analisis protein.

- Digunakanuntukmencampurkanba
handengankecepatandanwaktu
yang dibutuhkan.
- Dalamelektroforesis protein
alatinidigunakandalampewarnaan
gel
13
poliakrilamiddalamlarutanpewarn
.
Shaker acommasie brilliant blue.
Spring - Jenis shaker yang satu ini
Shaking dilengkapi dengan sebuah papan
Plate meja horizontal sebagai alas untuk
MMS- meletakan berbagai wadah berisi
TRAY L cairan yang akan dihomogenkan.
Dengan permukaan yang datar,
 larutan yang akan dihomogenkan
harus diletakan dalam wadah
dengan alas datar seperti
erlenmeyer, gelas kimia atau
kumpulan tabung reaksi yang
berada dalam sebuah wadah
dengan alas datar.
- Mikropipet adalah alat untuk
memindahkan cairan yang
bervolume cukup kecil, biasanya
kurang dari 1000 μl. Banyak
pilihan kapasitas dalam
mikropipet, misalnya mikropipet
yang dapat diatur volume
pengambilannya (adjustable
volume pipette) antara 1μl sampai
20 μl, atau mikropipet yang tidak
14 Mikropip
bisa diatur volumenya, hanya
. et
tersedia satu pilihan volume (fixed
volume pipette) misalnya
mikropipet 5 μl.
- Mikropipet EPPENDORF
autoclavabledengankapasitas 0,5-
10 µl, mikropipet ACURA 825
autoclavabledengankapasitas 100-
1000 µl.
- Alatinidigunakanuntukmengambil
larutandalam volume kecil.

- Menghasilkan getarn ultrasonik

Sonikator pada media air untuk
memecahkan sel secara fisik