Anda di halaman 1dari 16

Plasmin terlibat dalam peradangan melalui protease-

activated reseptor-1 pada pulpa gigi manusia

Abstrak

Plasmin adalah enzim proteolitik yang diproduksi dari plasminogen oleh aktivator plasminogen.
Kami menyelidiki fungsi plasmin pada sel-sel fibroblast pada pulpa gigi manusia. Plasmin
menginduksi peningkatan konsentrasi Ca2 + intraselular ([Ca2 +] i) dalam konsentrasi dengan cara
yang independen. Ekspresi mRNA untuk protease-activated reseptor (PAR-1) telah terdeteksi,
dan PAR-1 mengaktifkan peptida SFLLRN yang menginduksi peningkatan [Ca2 +] i pada sel.
Peningkatan [Ca2 +] yang disebabkan plasmin dihambat pada kemunculan PAR-1 antagonis
SCH79797. Plasmin merangsang ekspresi mRNA interleukin-8 (IL-8) dan pelepasan
prostaglandin E2, yang terlibat dalam peradangan. Efek dari plasmin pada ekspresi pelepasan
mRNA IL-8 dan pelepasan prostaglandin E2 dihambat di hadapan Antagonis PAR-1 SCH79797.
Hasil ini menunjukkan bahwa plasmin mengaktifkan PAR-1 dan terlibat dalam peradangan pada
pulpa gigi manusia.

1. Perkenalan

Plasmin adalah enzim proteolitik yang diproduksi dari plasminogen oleh aktivator plasminogen
(PA). Sudah diketahui bahwa plasmin mencerna benang fibrin dan zat lainnya dalam darah,
seperti fibrinogen, Faktor V dan protrombin, menyebabkan hipokoagulabilitas darah. Selain itu,
plasmin dianggap terlibat dalam penyembuhan luka, remodeling jaringan, angiogenesis dan
proliferasi sel, karena plasmin mampu mengaktifkan matriks laten metaloprotease untuk
degradasi matriks [1,2]. Selanjutnya, plasmin telah menunjukkan dapat mengaktifkan
pensinyalan sel dan fungsinya. Pada trombosit, plasmin mengaktifkan fosfolipase C dan protein
kinase C, sehingga merangsang mobilisasi Ca2 +
dan fosforilasi protein [3]. Dalam monosit
perifer, plasmin telah terbukti menjadi chemoattractant yang poten dan spesifik melalui jalur
yang tergantung GMP siklik [4]. Di sel endotel, plasmin merangsang pelepasan arakidonat [5].
Protease-activated receptors (PARs) termasuk rumpun reseptor - Gprotein- yang ditambahkan
tujuh domain transmembran yang terdiri dari empat anggota: PAR-1, PAR-2, PAR-3 dan PAR-4
[6,7]. PAR-1, PAR-3 dan PAR-4 diaktifkan oleh trombin, sedangkan PAR-2 diketahui diaktifkan
oleh tripsin, triptase dan faktor koagulasi VIIa dan Xa, namun tidak oleh trombin. Peptidase ini
mengaktifkan PAR melalui pembelahan domain ekstraselular N-terminal, yang kemudian
memungkinkan N-terminus baru untuk berinteraksi secara distal dalam molekul yang sama untuk
mengaktifkan jalur- Gprotein- yang ditambahkan sinyal transduksi [6,7]. PARs didistribusikan
secara luas, terutama pada seluruh sistem pencernaan, dan memainkan berbagai peran fisiologis
seperti modulasi eksokrin kelenjar saliva, ekskresi lambung atau pankreas, motilitas otot polos
gastrointestinal, sitoproteksi mukosa lambung, dan penekanan nyeri viseral [8- 11]. Selain itu,
aktivasi PAR telah disarankan untuk menginduksi respon inflamasi pada sel epitel respiratori,
aktivasi PAR-1, PAR-2 dan PAR-4 merangsang pelepasan interleukin (IL) -6, IL-8 dan
prostaglandin E2, sitokin proinflammatori, yang merupakan kemokin proinflamasi dan
encosanoid masing-masing terlibat dalam peradangan[12]. Dalam fibroblas gingiva manusia,
PAR-1 merangsang produksi IL-6 [13].

Pulpa gigi berasal dari jaringan mesenkim dan terdiri dari lapisan odontoblas yang berdekatan
dengan dentin dan jaringan ikat yang imunokompeten dengan saraf dan unsur vaskular. Iritasi
mekanis, kimiawi dan mikroba pada pulpa gigi dapat memberikan respon nyeri dan inflamasi.
Penyakit pada pulpa dikaitkan dengan degradasi jaringan. Aktivitas elastinolitik dan
kolagenolitik telah dilaporkan meningkat pada pulpa gigi manusia dengan keluhan pulpitis
supuratif dan nekrosis [14]. Sitokin telah terbukti merangsang peningkatan produksi matriks
metalloproteinase [15]. Pengamatan ini menunjukkan bahwa proses peradangan di pulpa gigi
mirip dengan jaringan lain.

Seperti halnya peradangan pada jaringan lain [1,2], sistem PA /plasmin dianggap berperan
penting dalam pulpitis, mendorong penyakit pulpa lebih lanjut, karena sitokin proinflamasi
seperti TNF-a dan IL-1a merangsang sintesis jaringan tipe PA (tPA) dan melepaskannya pada sel
pulpa gigi manusia [16,17]. Baru-baru ini, kami juga melaporkan IL-1b menstimulasi ekspresi
mRNA untuk tipe urokinase PA (uPA) dan pelepasan uPA pada sel pulpa gigi manusia [18].
Namun, fungsi plasmin belum dipahami dengan baik. Di Penelitian ini, kami menunjukkan
bahwa plasmin mengaktifkan PAR-1 dan akibatnya merangsang respons inflamasi di sel-sel
pulpa gigi manusia.

2. Material dan metode

2.1. Material

Serum calf fetal (FCS), minimal esensial medium (α-MEM), fungizone dan tripsin diperoleh dari
GIBCO BRL Life Technologies (Tokyo, Jepang). Penisilin G dan kanamisin berasal dari Meiji
Seika (Tokyo, Jepang). Fura-2 / AM dibeli dari Dojindo Labs (Tokyo, Jepang). Plasmin manusia
(rekombinan,>95% murni) dibeli dari Calbiochem (Darmstadt, Jerman). PAR-agonis peptida
SFLLRN, SLIGKV, TFRGAP, GYPGQV diperoleh dari Bachem AG (Bubendorf, Swiss). N3-
Cyclopropyl-7 - {[4- (1-methylethyl) fenil] metil} - 7H-pyrrolo [3,2-f] qinazolin-1,3-diamina
(SCH79797) dibeli dari Tocris Bioscience (Ellisville, MI). Trombin manusia diperoleh dari
Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT). Kit enzim immunoassai prostaglandin E2
berasal dari Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI).

2.2 Kultur Sel

Pada sel pulpa gigi manusia (fibroblas) yang diperoleh dari molar ketiga yang diekstraksi di
bawah kondisi aseptik dari pasien berusia 20 tahun yang melakukan perawatan ortodontik.
Pasien diberikan informed consent sebelum memberikan sampel. Setelah diekstraksi, jaringan
dipotong, ditempatkan pada sajian kultur jaringan 35 mm, dan ditutup dengan penutup kaca yang
disterilkan. α-MEM dilengkapi dengan 10% FCS dan antibiotik (20 U / ml penisilin G,
kanamisin 100 mg / ml, 250 ng / ml fungizone) yang digunakan sebagai kultur. Begitu
pertumbuhan sel dari eksplan telah bertemu, sel-selnya dilepas dengan 0,05% trypsin dalam
buffer garam fosfat dan disubkultur dalam labu kultur. Untuk percobaan, sel dari bagian 6-9
dilapiskan pada medium 2 X 105 sel / ml. Studi ini disetujui oleh komite etik Nihon University
School of Dentistry di Matsudo (No. EC02-078).

2.3 Mengukur konsentrasi Ca2+ intraseluler


Sel-sel pulpa gigi manusia (1 X 105) dibiakkan pada pelat kaca tipis, melingkar, berukuran 13,5
mm dalam α-MEM yang mengandung 10% FCS. Sel Confluent diinkubasi dengan 2 µM fura-2 /
AM dalam α- MEM selama 30 menit pada suhu 37℃. Setelah dimuati fura-2 / AM, piringan
gelas dengan attached cell dicuci dua kali dan dimasukkan ke dalam kuvet kuarsa yang
mengandung larutan Krebs-Ringer-Hepes [120mM NaCl, 5 mM KCl, 1mM MgSO4, 0,96 mM
NaH2PO4, 0,2% glukosa, 0,1% serum bovine albumin, 1mM CaCl2, dan 20mM Hepes (pH 7,4)]
untuk penentuan Ca2 + intraselular. Fluoresensi sel yang dimuati –fura-2 diukur dengan sebuah
spektrofluorometer CAF-110 (Nihon Bunkou, Jepang) dengan excitationat 340 nm dan 380 nm
dan emisi pada 500 nm. [Ca2 +]i dihitung dari rasio intensitas fluoresensi [19].

2.4 RT-PCR

Sel-sel pulpa gigi manusia (1 X 106) dikultur dalam jaringan kultur (10 cm) dalam α-MEM yang
mengandung 10% FCS. Ketika sel-sel itu konfluen, mereka diinkubasi dalam α-MEM
mengandung FCS 1% selama 24 jam. Ketika efek plasmin pada Ekspresi mRNA IL-8 diperiksa,
sel lebih jauh diinkubasi dalam 1% FCS α-MEM selama 1 jam dengan atau tanpa plasmin. Total
RNA seluler diekstraksi dari sel dengan menggunakan RNeasy mini kit (QIAGEN®). Prosedur
untuk isolasi RNA sesuai dengan protokol yang diterapkan pada RNeasy mini kit. Sintesis cDNA
dan amplifikasi oleh RT-PCR dilakukan dengan menggunakan kit One-Step RT-PCR. Untuk
campuran PCR menggunakan, RNA (100 ng) dan primer oligonukleotida (500 nM). Primer PCR
untuk PAR-1, PAR-2, PAR-3, PAR-4, IL- 8 dan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase
(GAPDH) dirancang dengan mengacu pada urutan yang dilaporkan, seperti yang ditunjukkan
pada Tabel 1 [20,21]. Sistem PCR GeneAmp 9600 (PerkinElmer) diprogram untuk sintesis
cDNA, dan prosedurnya melibatkan pra-denaturasi selama 30 menit pada suhu 95℃, diikuti 22
siklus denaturasi termal selama 30 detik pada suhu 94℃, pelepasan primer selama 30 detik pada
suhu 55℃, perpanjangan rantai untuk 30 s pada suhu 72℃, dan perpanjangan akhir selama 10
menit pada suhu 72 ℃. Fragmen PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2,0% dan kemudian
diwarnai dengan etidium bromida.

2.5 Menentukan prostaglandin E2

Sel (5 X 104) dilapisi di piring 24-lubang di α-MEM yang mengandung 10% FCS. Sel pada tahap
konfluen diinkubasi dalam α-MEM yang mengandung FCS 1% selama 24 jam, dan distimulasi
dengan plasmin atau SFLLRN selama 10 menit. Konsentrasi prostaglandin E2 dalam medium
kultur diukur dengan menggunakan EIA Kit sesuai petunjuk pabrik.
Tabel 1 – Primer untuk RT-PCR
Nama gen Primer Ukuran Produk (bp)

2.6 Analisis statistik


Hasilnya disajikan sebagai ± S.E. untuk jumlah percobaan ditunjukkan. Uji Tukey dilakukan
untuk analisis statistik.

3. Hasil
3.1 Plasmin menginduksi mobilisasi Ca2+

Plasmin telah dilaporkan dapat menginduksi mobilisasi Ca2 + di trombosit [3,22] dan sel endotel
kapiler otak [23]. Oleh karena itu, pertama-tama kami memeriksa apakah plasmin menginduksi
mobilisasi Ca2 + di sel-sel pulpa gigi manusia. Seperti Gambar 1A menunjukkan, plasmin (200
nM) menginduksi peningkatan intraseluler Konsentrasi Ca2 +
([Ca2 +]i) pada sel pulpa gigi
manusia yang dimuati fura-2. [Ca2+]i mulai meningkat pada 30 detik setelah stimulasi dengan
plasmin, secara bertahap mencapai tingkat puncak pada 90 detik, dan kemudian menurun ke
tingkat yang mantap. Gambar 1B merangkum
tingkat puncak pada [Ca2 +]i yang disebabkan oleh berbagai konsentrasi plasmin. Kenaikan [Ca2
+
]i yang diinduksi oleh plasmin (10 - 200 nM) pada sel-sel pulpa gigi manusia tergantung
konsentrasi.

3.2 Pengaruh PAR peptida pada mobilisasi Ca2+ pada sel pulpa gigi manusia
Telah dilaporkan bahwa peningkatan [Ca2 +]i oleh plasmin disebabkan oleh aktivasi PAR
[22,23], dan sel pulpa gigi manusia mengekspresikan PAR [24,25]. Karena itu, kami selanjutnya
memeriksa efek PAR-yang mengaktifkan peptida pada mobilisasi Ca2 +
di sel-sel pulpa gigi
manusia. Diketahui bahwa terdapat 4 subtipe PAR yaitu: PAR-1, PAR-2, PAR-3 dan PAR-4
[6,7]. Ketika sel dimuati fura-2 dirangsang dengan PAR yang mengaktifkan peptida, SFLLRN
(100 µM), yang mengaktifkan PAR-1, jelas dapat menginduksi peningkatan pada [Ca2 +]i ,
sedangkan SLIGKV (100 µM), TFRGAP (100 µM) dan GYPGQV (100 µM), yang masing-
masing mengaktifkan PAR-2, PAR-3 dan PAR-4, tidak memiliki atau memiliki efek lemah pada
[Ca2 +]i, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2A. Gambar 2B merangkum respon konsentrasi
pada puncak kurva [Ca2 +]i yang diinduksi oleh PAR- yang mengaktifkan peptida. SFLLRN (1-
100 µM) menyebabkan kenaikan konsentrasi pada [Ca2 +]i , dan respon maksimal diperoleh pada
100 µM, sedangkan peptida yang mengaktifkan PAR-2, PAR-3 dan PAR-4 gagal menginduksi
peningkatan secara meyeluruh pada [Ca2 +]i . Hasil ini menunjukkan bahwa sel-sel pulpa gigi
manusia mengekspresikan PAR 1.

3.3 Analisis RT- PCR pada subtipe PAR di sel pulpa gigi manusia

Untuk mengkonfirmasi ekspresi mRNA untuk PAR pada sel pulpa gigi manusia, analisis RT-
PCR dilakukan dengan menggunakan primer untuk setiap subtipe PAR. Seperti yang ditunjukkan
pada Gambar 3, ketika primer spesifik untuk mRNA PAR-1 digunakan untuk amplifikasi, satu
band dengan ukuran yang diprediksi (514 bp) terdeteksi pada kekuatan yang tinggi. Band dari
produk PCR juga terdeteksi dengan menggunakan primer untuk mRNA PAR-2 dan PAR-4, tapi
lebih lemah dari band mRNA PAR-1. Tidak ada produk PCR yang ditemukan untuk mRNA
PAR-3. Hasil ini menunjukkan bahwa PAR-1 adalah PAR subtipe dominan yang berfungsi pada
sel pulpa gigi manusia.
Gambar 2 – Efek PAR yang mengaktifkan peptida pada [Ca2+] i. (A) Mobilisasi Ca2+yang diinduksi oleh PAR yang mengaktifkan peptida pada fura-2-
dimuat pada sel-sel pulpa gigi manusia. SFLLRN (100 µM), SLIGKV (100 µM), TFRGAP (100 µM) atau GYPGQV (100 µM), PAR-1, PAR-2, PAR-3
dan PAR-4 pengaktif peptida masing-masing ditambahkan ke medium pada saat ditunjukkan oleh panah. Ini Hasilnya mewakili 3-6 percobaan
independen. (B) Efek konsentrasi dari PAR yang mengaktifasi peptida. Sel pulpa gigi manusia yang dimuati Fura-2 dirangsang dengan berbagai
konsentrasi PAR yang mangaktifasi peptida, SFLLRN (lingkaran tertutup), SLIGKV (kotak tertutup), TFRGAP (lingkaran terbuka) dan GYPGQV
(segitiga terbuka). Tingkat kontrol dikurangi dari tingkat puncak yang diinduksi oleh peptida. Nilai merupakan sarana W S.E.M. untuk 3 eksperimen
independen. ** P <0,01.

3.4 Penghambatan plasmin yang menginduksi mobilisasi Ca2+ oleh antagonis PAR-1

Selanjutnya kami menguji efek antagonis PAR-1 pada mobilisasi Ca2+ di sel-sel pulpa gigi
manusia. SCH79797 poten dan antagonis PAR-1 selektif, berlawanan dengan trombin- ligan
yang diikatkan [26]. Sel diperlakukan dengan SCH79797 (20 µM) selama 10 menit, peningkatan
[Ca2 +]i diinduksi oleh PAR-1 yang mengaktifkan peptida SFLLRN (100 µM) atau PAR agonis
α-trombin (20 nM) jelas telah dihambat (Tabel 2). Di sel yang diperlakukan dengan SCH79797,
plasmin (100 nM) juga gagal menginduksi kenaikan [Ca2 +]i, seperti yang ditunjukkan pada
Tabel 2. SCH79797 tidak berpengaruh pada basal [Ca2 +]i (data tidak ditunjukkan). Pengamatan
ini sangat menunjukkan bahwa efek plasmin berhubungan dengan aktivasi PAR-1.
Gambar 3 - Ekspresi mRNA PAR pada sel pulpa gigi manusia. RT-
PCR dilakukan dengan menggunakan primer yang spesifik pada
setiap jenis PAR, seperti yang dijelaskan pada Bagian 2. Produk
PCR menjadi subjek elektroforesis melalui 2% gel agarose dan
kemudian diwarnai dengan etidium bromida. Panel bawah
menunjukkan tingkat mRNA GAPDH sebagai kontrol. Hasil ini
mewakili 3 percobaan independen

3.5 Plasmin menginduksi ekspresi mRNA IL-8 dan pelepasan prostaglandin E2 yang
berhubungan dengan aktivasi PAR-1

Kami selanjutnya memeriksa apakah plasmin terlibat dalam peradangan di pulpa gigi manusia.
Gambar 4 menunjukkan efek plasmin dan SFLLRN pada ekspresi mRNA untuk proinflamasi
kemokin IL-8 pada sel-sel pulpa gigi manusia. Saat sel dirangsang dengan plasmin (100 nM) dan
SFLLRN (100 µM) selama 1 jam, ekspresi IL-8 mRNA sangat meningkat. Namun, pada
kemunculan antagonis PAR-1 SCH79797 (2 µM), ekspresi mRNA IL-8 yang diinduksi plasmin
atau SFLLRN berkurang. Pengamatan ini menunjukkan bahwa plasmin menginduksi ekspresi
mRNA IL-8 yang bergabung pada aktivasi PAR-1 di sel-sel pulpa gigi manusia.
Selanjutnya kami menyelidiki efek aktivasi PAR-1 pada pelepasan prostaglandin E2, merupakan
eicosanoid yang terlibat dalam peradangan, pada sel-sel pulpa gigi manusia. Seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 3, ketika sel dirangsang dengan plasmin (100 nM) atau SFLLRN (100
µM) selama 10 menit, pelepasan prostaglandin E2 jelas meningkat. Namun, seperti plasmin atau
SFLLRN yang menginduksi pelepasan prostaglandin E2 sangat berkurang dengan kehadiran
SCH79797 (2 µM). Hasil ini sangat menunjukkan bahwa plasmin berfungsi sebagai faktor
inflamasi melalui PAR-1 aktivasi pada pulpa gigi manusia.
Tabel 2- efek inhibitor PAR-1 antagonis pada plasmin-, SFLLRN-
dan α- thrombin yang menginduksi peningkatan [Ca2+]i

Setelah pretreatment dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 atau 20 µM)


selama 10 menit, sel-sel dirangsang dengan plasmin (100 nM), PAR-1 yang
mengaktifkan peptida SFLLRN (100 µM) atau PAR agonis α-trombin (20 nM).
Rasio penghambat dinyatakan sebagai persentase dari kontrol (peningkatan
plasmin-, SFLLRN-atau thrombin yang menginduksi [Ca2+]I dengan tidak
adanya antagonis). Nilai merupakan rata-rata ±S.E.M. untuk 3 eksperimen
independen.

** P <0,01

Gambar 4 - Plasmin dan SFLLRN yang menginduksi ekspresi mRNA


IL-8 dengan tidak adanya atau adanya PAR-1 antagonis. Setelah
perawatan tanpa atau dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 µM)
selama 30 menit, Sel pulpa gigi manusia distimulasi dengan 100 nM
plasmin atau 100 µM SFLLRN selama 1 jam, dan kemudian RNA
total mereka dijadikan subjek RT-PCR. Produk PCR dikenai
elektroforesis melalui 2% gel agarose dan kemudian diwarnai
dengan etidium bromida. Panel yang lebih rendah menunjukkan
tingkat mRNA GAPDH sebagai kontrol. Hasil ini mewakili 6
independen percobaan.
Tabel 3- Plasmin- dan SFLLRN- menginduksi pelepasan
Prostagladin E2 pada atau tidaknya PAR-1 antagonis

Setelah perawatan tanpa atau dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 µM) selama 10
menit, sel-sel pulpa gigi manusia dirangsang dengan 100 µM plasmin atau 100 µM
SFLLRN selama 10 menit. Prostaglandin E2 dilepaskan ke medium terkondisi yang
ditentukan dengan menggunakan EIA Kit. Hasilnya mewakili 4 eksperimen independen.

** P <0,01.

4. Diskusi

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa plasmin berfungsi di sel-sel pulpa gigi manusia.
Plasmin dihasilkan dari plasminogen oleh aksi PA. Dua jenis PA, tPA dan uPA, diekspresikan
oleh berbagai jaringan. Meski keduanya mengaktifkan plasminogen, tPA merupakan primer yang
terlibat dalam fibrinolisis karena memiliki afinitas tinggi untuk fibrin dan ekstraselular matriks,
sedangkan uPA mendukung kemotaksis sel inflamasi dan proliferasi melalui interaksi dengan
permukaan reseptor sel yang memiliki afinitas tinggi (uPAR) [27,28]. Di sel-sel pulpa gigi
manusia, telah dilaporkan bahwa TNF-α dan IL-1α menginduksi sintesis tPA dan sekresinya
[16,17] dan IL-1β menginduksi sintesis uPA dan sekresinya [18]. Oleh karena itu, plasmin
kemungkinan diproduksi oleh sekresi PA dari sel yang distimulasi dengan sitokin inflamasi ini.
Pada sel pulpa gigi manusia, plasmin menstimulasi ekspresi IL-8 mRNA dan pelepasan
prostaglandin E2. IL-8 adalah anggota rumpun kemokin dan diproduksi oleh berbagai jenis sel
seperti monosit, makrofag dan fibroblas [29]. Kemokin ini terutama memediasi aktivasi dan
migrasi neutrofil dari darah tepi ke dalam jaringan dan terlibat dalam inisiasi dan amplifikasi
proses inflamasi sebagai respons terhadap berbagai macam patogen [29]. Oleh karena itu, bisa
dibayangkan bahwa IL-8 berperan penting dalam peradangan pada pulpa gigi manusia. Di Di sisi
lain, prostaglandin E2 merupakan anggota dari rumpun eicosanoid dan merupakan mediator
utama peradangan berbagai penyakit [30]. Pulpa gigi manusia yang mengalami inflamasi telah
dilaporkan mengandung kadar prostaglandin yang tinggi, termasuk prostaglandin E2, bila
dibandingkan dengan pulpa yang asimtomatik [31]. Mediator kimia bradikinin dan sitokin
inflamasi TNF-α dan IL-1β merangsang produksi prostaglandin E2 pada sel pulpa gigi manusia
[32,33]. TNF-α dan IL-1β juga menginduksi ekspresi gen siklooksigenase, enzim yang
bertanggung jawab memproduksi prostaglandin, di sel-sel pulpa gigi [34]. Pengamatan ini
menunjukkan bahwa prostaglandin E2 penting dalam proses peradangan pulpa. Oleh karena itu,
efek dari plasmin yang kami tunjukkan dalam penelitian ini menunjukkan bahwa plasmin terlibat
dalam proses peradangan pada pulpa gigi.
Kami juga menunjukkan bahwa efek plasmin pada ekspresi mRNA IL-8 dan pelepasan
prostaglandin E2 yang digabungkan ke aktivasi PAR-1. Sejauh ini, 4 jenis PAR, PAR-1, PAR-2,
PAR-3 dan PAR-4, telah ditemukan dan dikloning [6,7]. Sebelumnya, telah dilaporkan bahwa
mRNA PAR-1 dan PAR-3 terdeteksi terutama di sel-sel fibroblas pulpa manusia [24], sedangkan
penelitian lain menemukan bahwa sel-sel ini hanya mengekspresikan mRNA PAR-2 [25]. Dalam
penelitian ini, mRNA PAR-1 ditemukan untuk diekspresikan secara dominan. Selanjutnya, di
antara PAR yang mengaktivasi peptida, SFLLRN, yang mengaktifkan PAR-1, jelas menginduksi
kenaikan dosis pada [Ca2 +]i. Selain itu, Peningkatan SFLLRN pada [Ca2 +]i dihambat oleh PAR-
1 antagonis SCH79797. Pengamatan ini sangat menunjukkan bahwa PAR-1 diekspresikan dan
berfungsi dalam sel fibroblas pulpa gigi manusia, meski alasan perbedaan ekspresi PAR belum
jelas. Meski sel-sel pulpa gigi yang digunakan dalam percobaan ini kaya fibroblas, sel kultur
mungkin mengandung jenis sel lain seperti sel progenitor odontoblas, karena sel-sel pulpa gigi
yang diisolasi telah dilaporkan akan diinduksi untuk membedakan sel odontoblas dan
menghasilkan struktur dentin-mineral secara in vitro [35,36]. Oleh karena itu, perbedaan ekspresi
PARs tampaknya disebabkan oleh adanya berbagai jenis sel.
PAR-1 telah diketahui akan diaktifkan dengan pembelahan ikatan peptida arginin-41/serine-42
yang berada di dalam exodomain oleh trombin [37]. Plasmin langsung membelah dan
mengaktifkan reseptor yang mirip dengan trombin [38,39]. Hal ini juga menunjukkan bahwa
plasmin menginduksi ekspresi gen dan mitogenesis pada fibroblas [40,41], sekresi elastase pada
makrofag [42], dan migrasi sel ovarium yang mengekspresikan integrin rekombinan pada
hamster cina [43] melalui aktivasi PAR-1. Demikian pula ekspresi mRNA IL-8 yang diinduksi
plasmin dan pelepasan prostaglandin E2 yang dihambat oleh PAR-1 inhibitor, menunjukkan
behwa aktivasi PAR-1 penting untuk efek plasmin pada sel-sel pulpa gigi manusia. Diambil
bersamaan dengan data sebelumnya, hasil ini menunjukkan plasmin terlibat dalam proses
inflamasi melalui aktivasi PAR-1 pada pulpa gigi manusia.

Ucapan terima kasih

Studi ini didukung sebagian oleh Grants- in- Aid untuk penelitian Ilmiah dari JSPS (#
17592001, # 19592212) dan Nihon University Research Grant untuk tahun 2007.

Referensi

[1] Wun TC. Plasminogen activation: biochemistry, physiology, and therapeutics. Crit Rev
Biotechnol 1988;8:131–48.
[2] Carmeliet P, Collen D. Development and disease in proteinase-deficient mice: role of the
plasminogen, matrix metalloproteinase and coagulation system. Thromb Res
1998;91:255–85.
[3] Schafer AI, Maas AK, Ware JA, Johnson PC, Rittenhouse SE, Salzman EW. Platelet protein
phosphorylation, elevation of cytosolic calcium, and inositol phospholipid breakdown in platelet
activation induced by plasmin. J Clin Invest 1986;78:73–9.
[4] Syrovets T, Tippler B, Rieks M, Simmet T. Plasmin is a potent and specific chemoattractant
for human peripheral monocytes acting via a cyclic guanosine monophosphatedependent
pathway. Blood 1997;89:4574–83.
[5] Chang WC, Shi GY, Chow YH, Chang LC, Hau JS, Lin MT, et al. Human plasmin induces a
receptor-mediated arachidonate release coupled with G proteins in endothelial cells. Am J
Physiol 1993;264:C271–81.
[6] Coughlin SR. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 2000;407:258–
64.
[7] Trejo J. Protease-activated receptors: new concepts in regulation of G protein-coupled
receptor signaling and trafficking. J Pharmacol Exp Ther 2003;307:437–42.
[8] Kawabata A, Morimoto N, Nishikawa H, Kuroda R, Oda Y, Kakehi K. Activation of
protease-activated receptor-2 (PAR-2) triggers mucin secretion in the rat sublingual gland.
Biochem Biophys Res Commun 2000;270: 298–302.
[9] Kawabata A, Kinoshita M, Nishikawa H, Kuroda R, Nishida M, Araki H, et al. The protease-
activated receptor-2 agonist induces gastric mucus secretion and mucosal cytoprotection. J Clin
Invest 2001;107:1443–50.

[10] Kawabata A, Kuroda R, Nishida M, Nagata N, Sakaguchi Y, Kawao N, et al. Protease-


activated receptor-2 (PAR-2) in the pancreas and parotid gland: Immunolocalization and
involvement of nitric oxide in the evoked amylase secretion. Life Sci 2002;71:2435–46.
[11] Kawabata A. Gastrointestinal functions of proteinase activated receptors. Life Sci
2003;74:247–54.
[12] Asokananthan N, Graham PT, Fink J, Knight DA, Bakker AJ, McWilliam AS, et al.
Activation of protease-activated receptor (PAR)-1, PAR-2, and PAR-4 stimulates IL-6, IL-8, and
prostaglandin E2 release from human respiratory epithelial cells. J Immunol 2002;168:3577–85.
[13] Tanaka N, Morita T, Nezu A, Tanimura A, Mizoguchi I, Tojyo Y. Signaling mechanisms
involved in proteaseactivated receptor-1-mediated interleukin-6 production by human gingival
fibroblasts. J Pharmacol Exp Ther 2004;311:778–86.
[14] Morand MA, Schilder H, Blondin J, Stone PJ, Franzblau C. Collagenolytic and elastinolytic
activities from diseased human dental pulps. J Endodont 1981;7:156–60.
[15] O’Boskey Jr FJ, Panagakos FS. Cytokines stimulate matrix metalloproteinase production by
human pulp cells during long-term culture. J Endodont 1998;24:7–10.
[16] Ueda I, Matsushima K. Stimulation of plasminogen activator activity and matrix
metalloproteinases of human dental pulp-derived cells by tumor necrosis factor-a. J Endodont
2001;27:175–9.
[17] Chang YC, Yang SF, Huang FM, Liu CM, Tai KW, Hsieh YS. Induction of tissue
plasminogen activator gene expression by proinflammatory of cytokines in human pulp and
gingival fibroblasts. J Endodont 2003;29:114–7.
[18] Kamio N, Hashizume H, Nakao S, Matsushima K, Sugiya H. IL-1b stimulates urokinase-
type plasminogen activator expression and secretion in human dental pulp cells. Biomed Res
2007;28:315 22.
[19] Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly
improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985;260:3440–50.
[20] Tanaka N, Morita T, Nezu A, Tanimura A, Mizoguchi I, Tojyo Y. Thrombin-induced Ca2+
mobilization in human gingival fibroblasts is mediated by protease-activated receptor-1 (PAR-1).
Life Sci 2003;73:301–10.
[21] Yumoto H, Nakae H, Fujinaka K, Ebisu S, Matsuo T. Interleukin-6 (IL-6) and IL-8 are
induced in human oral epithelial cells in response to exposure to periodontipathic Eikenella
corrodens. Infect Immun 1999;67:384–94.
[22] Nakamura K, Kimura M, Fenton Jr JW, Andersen TT, Aviv A. Duality of plasmin effect on
cytosolic free calcium in human platelets. Am J Physiol 1995;268:C958–67.
[23] Bartha K, Do¨mo¨ to¨ r E, Lanza F, Adam-Vizi V, Machovich R. Identification of thrombin
receptors in rat brain capillary endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab 2000;20: 175–82.
[24] Gruber R, Jindra C, Kandler B, Watzak G, Fischer MB, Watzek G. Proliferation of dental
pulp fibroblasts in response to thrombin involves mitogen-activated protein kinase signalling. Int
Endodont J 2004;37:145–50.
[25] Tancharoen S, Sarker KP, Imamura T, Biswas KK, Matsushita K, Tatsuyama S, et al.
Neuropeptide release from dental pulp cells by RgpB via proteinase-activated receptor-2
signaling. J Immunol 2005;174:5796–804.
[26] Ahn H-S, Foster C, Boykow G, Stamford A, Manna M, Graziano M. Inhibition of cellular
action of thrombin by N3- cyclopropyl-7- {[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl}-7Hpyrrolo[ 3,2-
f]qinazoline-1,3-diamine (SCH79797), a nonpeptide thrombin receptor antagonist. Biochem
Pharmacol 2000;60:1425 34.
[27] Saksela O. Plasminogen activation and regulation of pericellular proteolysis. Biochim
Biophys Acta 1985;823: 35–65.
[28] Irigoyen JP, Mun˜ oz-Ca´noves P, Montero L, Koziczak M, Nagamine Y. The plasminogen
activator system: biology and regulation. Cell Mol Life Sci 1999;56:104–32.
[29] Harada A, Sekido N, Akahoshi T, Wada T, Mukaida N, Matsushima K. Essential
involvement of interleukin-8 (IL8) in acute inflammation. J Leukoc Biol 1994;56:559–64.
[30] Park JY, Pillinger MH, Abramson SB. Prostaglandin E2 synthesis and secretion: The role of
PGE2 synthesis. Clin Immunol 2006;119:229–40.
[31] Cohen JS, Reader A, Fertell R, Beck FM, Meyers WJ. A radioimmunoassay determination
of the concentrations of prostaglandin E2 and F2a in painful and asymptomatic human dental
pulps. J Endodont 1985;11:330–5.
[32] Sundqvist G, Rosenquist JB, Lerner UH. Effects of bradykinin and thrombin on
prostaglandin formation, cell proliferation and collagen biosynthesis in human dentalpulp
fibroblasts. Arch Oral Biol 1995;40:247–56.
[33] Chang MC, Chen YJ, Tai MR, Li MY, Tsai YL, Lan WH, et al. Cytokine-induced
prostaglandin E2 production and cyclooxygenase-2 expression in dental pulp cells: downstream
calcium signaling via activation of prostaglandin EP receptor. Int Endodont J 2006;39: 819–26.
[34] Chang YC, Yang SF, Huang FM, Liu CM, Tai KW, Hsieh YA. Proinflammatory cytokines
induce cyclooxygenase-2 mRNA and protein expression in human dental pulp cell cultures. J
Endodont 2003;29:201–4.
[35] Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-Ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y, et al. Mineralized
nodule formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch Oral Biol
1992;37:1045–55.
[36] About I, Botteo MJ, de Denato P, Camps J, Franquin JC, Mitsiadis TA. Human dentin
production in vitro. Exp Cell Res 2000;258:33–41.
[37] Vu TK, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR. Molecular cloning of a functional thrombin
receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell 1991;64:1057–68.
[38] Vouret-Craviari V, Grall D, Chamberd J-C, Rasmussen UB. Post-translational and
activation dependent modification of the G protein-coupled thrombin receptor. J Biol Chem
1995;8367–72.
[39] Kuliopulos A, Covie L, Seley SK, Sheridan PJ, Helin J, Costello CE. Plasmin
desensitization of the PAR1 thrombin receptor: Kinetics, sites of truncation, and implications for
thrombolytic therapy. Biochemistry 1999;38:4572–85.
[40] Pendurthi UR, Ngyuen M, Andrade-Gordon P, Petersen LC, Rao LVM. Plasmin induces
Cyr61 gene expression in fibroblasts via protease-activated receptor-1 and p44/42 mitogen-
activated protein kinase-dependent signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol
2002;22:1421–6.
[41] Mandal SK, Rao LVM, Tran TTT, Pendurthi UR. A novel mechanism of plasmin-induced
mitogenesis in fibroblasts. J Thromb Haemost 2004;3:163–9.
[42] Raza SL, Nehring LC, Shapuro SD, Cornelius LA. Proteinaseactivated receptor-1 regulation
of macrophage elastase (MMP-12) secretion by serine proteinases. J Biol Chem 2000;52:41243–
50.
[43] Majumdar M, Tarui T, Akakura N, Ruf W, Takada Y. Plasmin-induced migration requires
signaling through protease-activated receptor 1 and integrin a9b1. J Biol Chem 2004;279:37528–
34.