Anda di halaman 1dari 13

MAKALAH

FORENSIK DAN APLIKASI PCR

Disusun Oleh :

1. Erni Puji Lestari


2. Ihsan Abqory
3. Meli Agustin
4. Nur Indah Dwi Cahyanti

DIII TEKNOLOGI LABORATORIUM MEDIK


POLTEKKES KEMENKES BANTEN
2017
BAB II
PEMBAHASAN

PENILAIAN PROFIL STR


Profil DNA yang dihasilkan dari sampel kerja kasus untuk menafsirkannya memerlukan
beberapa pengalaman. Pedoman telah berevolusi untuk membantu interpretasi profil STR untuk
memastikan bahwa hasil yang kuat dan konsisten, ini sangat penting ketika berhadapan dengan
sampel yang mengandung jumlah yang sangat kecil dari DNA, DNA yang terurai atau campuran
dari profil yang berasal dari dua atau lebih -semua situasi yang menyulitkan interpretasi. Bab ini
mengeksplorasi sejumlah artefak yang dapat terjadi pada profil DNA. beberapa skenario kerja
kasus yang dapat menyebabkan profil kompleks juga dipertimbangkan.

Puncak Gagap
Selama pengerasan alel STR normal untuk menghasilkan puncak gagap, yang mengulang satu
unit lebih kecil atau lebih besar dari alel sesungguhnyar, alel kecil lebih umum dihasilkan dari
sebagian kasus. Puncak gagap dibentuk oleh helai slippage selama perpanjangan untai DNA
selama proses amplifikasi PCR. (Gambar 7.1)

Gambar 7.1
Selama PCR, slippage antara template dan helai DNA baru lahir menggandakan satu
helai lebih kecil dibandingkan dengan template untai

Bahkan dalam profil kualitas yang baik akan ada beberapa puncak gagap, yang dikenali dan
tidak mengganggu interpretasi profil. Ambang batas normal biasanya digunakan untuk
membantu dalam identifikasi dan interpretasi puncak gagap, jadi untuk contoh sementara puncak

2
gagap bervariasi antara lokus, mereka biasanya kurang dari 15% dari puncak utama [4,5] –
pemahaman puncak gagap penting terutama ketika menafsirkan campuran.

Lokus STR yang berbeda memiliki berbagai kecenderungan gagap. Ini tergantung pada
struktur pengulangan inti: disingkat dan mengulangi trinukleotidacenderung lebih rentan
terhadap gagap dari STR autosomal yang telah diadopsi oleh komunitas forensik memiliki tetra
dan mengulangi inti pentanukleotida (Gambar 7.2) . STR dengan mengulangi inti sederhana
cenderung memiliki tingkat gagap lebih tinggi dari senyawa yang mengulangi inti kompleks.

Puncak Perpecahan
Taq polymerase yang digunakan untuk menggerakkan reaksi berantai polimerase menambahkan
nukleotida ke molekul DNA yang baru disintesis tergantung padacaratemplate. Namun juga
memiliki aktivitas, yang disebut transferase terminal, dimanaia menambahkan nukleotida pada
akhir molekul yang diperkuat tergantung padanon-template. Sekitar 85% dari waktu penambahan
residu adenine (Gambar 7.3) .
Hal inipenting bahwa sebagian besar dari produk PCR memiliki penambahan nukleotida non-
template, jika puncak perpecahan diamati dalam profil DNA (Gambar 7.4). Puncak perpecahan
biasanya disebabkan oleh aktivitas sub-optimal dari taq polymerase atau terlalu banyak DNA
template di PCR.

Untuk meminimalkan pembentukan puncak perpecahan dalam profil, pada tahap akhir siklus
PCR, reaksi diinkubasi pada suhu 65-720 C dengan waktu antara 45-60 menit, memungkinkan
taq polymerase untuk menyelesaikan penambahan non-templete dari semua produk PCR.

Interpretasi profil dengan puncak perpecahan ini dimungkinkan karena puncak dengan
ditambahkan nukleotida dianggap sebagai puncak yang benar. masalah dapat terjadi ketika
adanya alel yang berbeda dengan hanya satu pasangan basa, allele THO1 9.3 sebagai contoh
dapat bingung dengan alel THO1 10. Dalam banyak kasus profil dengan tingkat tinggi dari
puncak perpecahan harus dianalisis ulang untuk meminimalkan kemungkinan terjadi kesalahan
interpretasi

3
Gambar 7.2
Puncak gagap terbentuk selama slippage taq polymerase selama penggandaan
template untai .Hasil slippage saat amplifikasi produkmengulangi satu unit lebih
pendek dari template . Gagap puncak umumnya kurang dari 15 % pada produk
amplifikasi yang sebenarnya. Panel (a) menunjukkan dinucleotide yang berulang ,
yang mana memiliki titik rawan tinggi pada slippage , puncak gunung yang
ditunjukkan oleh panah berukuran ditunjukkan oleh puncak utama ( berdasarkan
area puncak ) . Panel (b) adalah pengulangan tetranucleotide , yangmana ditunjukan
dengan menurunnya level puncak.

Gambar 7.3
Taq polymerase menambahkan nukleotida dari ujung 3 'ke arah untai yang baru
disintesis. Penambahan non-template biasanya merupakan adenin dan hasil dari
produk PCR yang merupakan salah satu pasangan basa lebih panjang dari template
(N + 1). Garis panah mewakili ke depan dan primers terbalik.

4
Menarik
Dalam Bab 6 diperkenalkan file matrix - file ini berisi informasi tentang tingkat berlapis spectral
dengan pewarna yang telah digunakan untuk label produk PCR. Informasi ini digunakan oleh
Genescan® and GeneMapper™ ID software untuk menghasilkan puncak yang terdiri dari satu
warna. Jika file matriks tidak berkualitas baik maka koreksi ini tidak sempurna dan puncak
dalam profil yang dihasilkan terdiri lebih dari satu warna; Fenomena ini disebut pull-up. Pull-up
mudah untuk dikenal sebagai produk berukuran lebih kecil akan muncul tepat pada ukuran yang
sama dengan STR alel nyata. Pull-up juga dapat terjadi ketika terjadi amplifikasiyang berlebihan,
bahkan jika file matriks yang berkualitas baik (Gambar 7.5a)

Gambar 7.4
Puncak gunung terlihat di profil saat penambahan non-template tidak terjadi
dengan semua produk PCR. Tiga contoh menunjukkan jumlah penurunan selain
non-template dengan panel (a) menunjukkan contoh di mana sebagian besar
produk PCR memiliki penambahan non-template melalui panel (c), di mana hanya
50% dari produk PCR yang ditambahkan non -template.

5
Gambar 7.5
Jika reaksi kelebihan beban dengan DNA, (a) puncak masih ada tetapi artefak
seperti pull-up dan puncak perpecahan yang lebih jelas. Ketika template berada
dalam kisaran yang optimal (b dan c) puncak yang seimbang dan mudah untuk
menafsirkan hasil. Ketika PCR tidak memiliki cukup template untuk memperkuat
(d), maka terjadi keluarnya lokus dan alel (lihat bagian piring untuk versi penuh
warna dari angka ini).

DNA TEMPLATE
Kit STR komersial telah dioptimalkan untuk memperkuat sejumlah kecil DNA template yang
umumnya antara 0,5 dan 2,5 ng, yang mewakili sekitar 166 dan 833 salinan genom manusia
haploid. Hal ini tidak selalu memungkinkan untuk menambahkan jumlah optimal dari DNA
untuk PCR ketika ukuran sampel terbatas.

PROFIL KELEBIHAN BEBAN


Kelebihan beban PCR juga dapat menyebabkan profil yang sulit untuk ditafsirkan. Jika kamera
CCD jenuh maka puncak tinggi / daerah tidak lagi menjadi indikator yang baik dari jumlah
produk dan ini dapat menyebabkan masalah dalam menilai keseimbangan puncak dan dapat
membuat interpretasi campuran yang sulit. Profil kelebihan beban juga cenderung memberi dasar
yang bising, peningkatan kadar gagap, puncak split dan pull-up (Gambar 7.6)

6
Gambar 7.6
Berat beban profile. Semua puncak telah menunjukkan puncak datar menunjukkan
bahwa mereka tidak mempunyai skala, data dasar ini sangat berisik, beberapa
membagi puncak yang jelas dan puncak yang sangat luas, yang dapat menyebabkan
ukuran masalah. Ada yang diucapkan puncak gagal (lihat bidang piring untuk versi
angka ini).

MENYALIN NOMOR DNA YANG RENDAH


Di banyak adegan kejahatan mungkin untuk menyimpulkan permukaan yang telah kontak fisik
dengan pelaku , sebagai contoh menangani senjata , pisau , ligatur , pintu atau setir mobil.
Daerah-daerah ini dapat diusap untuk mengumpulkan sel-sel epitel selama telah terjadi kontak
[10/07]. Jumlah DNA diekstraksi bisa sangat rendah tetapi dalam beberapa keadaan mungkin
untuk mendapatkan profil DNA penuh kurang dari 100 pg pada template DNA: kisaran normal
DNA template antara 500 dan 2500 pg (2,5 ng). Untuk menganalisis jumlah kecil seperti DNA
angka siklus amplifikasi meningkat menjadi 34. Jumlah standar siklus dalam amplifikasi
menggunakan kit komersial antara 28 - 32 siklus. Studi empiris telah menunjukkan bahwa di atas
34 siklus jumlah artefak yang terdeteksi lebih besar daripada manfaat dari tingkat yang lebih
tinggi dari artefak [11]. Harus diambil sangat hati-hati ketika menafsirkan profil LCN [11,12].
Sejumlah fitur dapat dilihat ketika memperkuat jumlah DNA template yang rendah.Ini adalah:
alel drop-out, dan drop-in; puncak ketidakseimbangan yang parah; lokus drop-out (Gambar 7.5d);
dan peningkatan gagap [12-14]. Alel drop-out terjadi ketika melalui peristiwa kebetulan satu alel
dalam lokus heterozigot yang istimewa; ini dapat memberikan kesan yang salah bahwa profil
pada lokus tertentu dalam homozigot. Untuk meminimalkan kemungkinan yang terjadi PCR

7
harus diulang setidaknya dua kali dan hanya alel yang muncul secara konsisten itu yang benar
(Gambar 7.7).
Fenomena ini juga menyebabkan ketidakseimbangan puncak yang lebih tinggi
dibandingkan dengan jumlah lebih tinggi dari template DNA .Alel drop-in juga merupakan
fenomena biasa ketika memperkuat jumlah kecil dari template DNA .Alel yang drop-in adalah
produk amplifikasi palsu dan tidak akan diperkuat dengan duplikasi triplicate tetapi masih bisa
menghasilkan hasil yang bingung dari profil . Drop-out pusat , terutama besar lokus STR juga
bisa terjadi, hal ini mengurangi jumlah informasi dari profil tapi hasiltidak membingungkan. Saat
ini, tidak ada kesepakatan secara nyata komunitas ilmuwan tentang LCN menggunakan PCR. [15]

Gambar 7.7
Tiga analisis PCR terpisah dari ekstrak DNA dapat menyebabkan hasil yang berbeda.
Ketika berhadapan dengan nomor template yang sangat rendah, umumnya alel
relative terputus dan genotipe benar hanya bisa dipastikan melalui banyaknya
amplifikasi - dan bahkan kemudian hasilnya bisa diperdebatkan

8
Gambar 7.8
Profile menunjukkan lokus hijau dari kit AmpFlSTR® SGM Plus®. Daerah puncak
pada area terkecil pada setiap lokus ditampilkan sebagai persentase dari puncak lebih
besar. Ukuran puncak sebanding dengan jumlah produk PCR - ini dapat diukur
dengan mengukur tinggi puncak atau, biasanya lebih, daerah puncak

Keseimbangan Puncak
STR lokus yang digunakan dalam analisis forensik umumnya heterozigot, memproduksi dua
puncak di profile. Dalam profil yang sempurna dua puncak dihasilkan yang seimbang 1: 1 dalam
hal puncak yang tinggi dan daerah tetapi dalam kenyataannya ini sangat langka dan satu puncak
akan lebih besar dari yang lain (Gambar 7.8). Variasi dalam puncak yang tinggi dapat
disebabkan oleh peristiwa kebetulan, di mana satu alel lebih efisien diperkuat dari yang lain.
Ekstrak DNA berkualitas baik, puncak yang lebih kecil, rata-rata, sekitar 90% ukuran puncak
yang lebih besar [4].
Laboratorium akan menggunakan nilai yang berbeda yang didasarkan pada studi validasi
mereka sendiri tetapi umumnya memerlukan puncak lebih kecil dari lokus untuk berada dalam
60% dari puncak yang lebih besar [4]. Ketidakseimbangan puncak bisa lebih ekstrim ketika
profil terdegradasi DNA dan ketika memperkuat jumlah DNA template yang rendah. Pada
kesempatan langka mutasi dari situs pengikatan primer akan mengurangi efisiensi PCR untuk
satu alel, yang dapat menghasilkan tingkat tinggi ketidakseimbangan puncak dan bahkan alel
putus. Frekuensi mutasi ini rendah, berkisar antara frekuensi 0,01 dan 0,001 per lokus [16].

Campuran
Banyak sampel biologis yang pulih dari tempat kejadian akan berisi campuran bahan selular
lebih dari satu orang. Busana akan sering mengandung bahan selular dari pemakainya dan
mungkin juga mengandung bahan dari penyerang setelah serangan; pegangan pintu atau roda
kemudi mungkin telah ditangani oleh beberapa orang - ada banyak keadaan ketika campuran
bahan dapat dikumpulkan. Campuran dalam DNA profile dapat diakui oleh kehadiran lebih dari
dua alel setiap lokus dalam profile, biasanya akan ada beberapa lokus yang memiliki tiga atau
empat alel dan kehilangan keseimbangan puncak.
9
Setelah menetapkan bahwa profile dicampur, tugas pertama adalah untuk menilai berapa banyak
kontributor diwakili dalam profile. Dua campuran orang yang paling sering terlihat di kerja kasus
forensik; dengan campuran dua orang maksimal empat alel akan hadir pada setiap lokus
sedangkan tiga campuran orang akan berisi hingga enam alel di lokus. Ketika empat alel hadir
pada lokus tertentu dan ada komponen mayor dan minor, interpretasinya relatif sederhana
(Gambar 7.9). Rasio luas puncak dalam lokus umumnya sesuai dengan rasio molekul template
[17, 18], daerah puncak yang menganggap morfologi puncak serta ketinggian [16], yang biasa
digunakan sebagai panduan untuk menafsirkan campuran profiles [19]. Bahkan dalam campuran
dua orang ketika ada bersama alel antara mayor dan minor profile, hasil menjadi lebih sulit -
terutama campuran di mana profil minor kurang dari sepertiga dari tingkat utama profile [16].
Dalam campuran di mana komponen utama lebih banyak, hal ini mungkin sering untuk
menyimpulkan besar profil; namun , dalam kasus tersebut sulit untuk mendapat banyak
informasi dari komponen kecil di mana interpretasinya sulit karena artefak dalam profil seperti
gagap puncak , dan juga oleh besar profil utama menutupi profil kecil [20]. Perangkat lunak telah
dikembangkan dengan tujuan untuk membantu kompleks campuran [21] .

10
Gambar 7.9
Campuran dua individu akan menyebabkan hingga empat puncak pada setiap lokus.
Daerah antara garis putus-putus mewakili zona di mana komponen minor dari
campuran dapat diartikan. Garis putus-putus yang lebih rendah mewakili 15% dan
60% dari puncak utama - di bawah 15% adalah zona di mana gagap puncak dari alel
utama dapat terjadi dan puncak, di bawah 60% tidak dapat dengan mudah dijelaskan
oleh ketidakseimbangan puncak. Pada lokus ini komponen utama dapat diartikan
sebagai 13-15 sementara genotipe komponen minor adalah 16-20.

DNA yang terurai


Banyak sampel yang dikumpulkan dari lokasi kejahatan mungkin telah terkena lingkungan mulai
dari jam, hari, atau bahkan lebih lama jika tempat kejadian kriminal telah dapat
ditemukan.Ketika DNA sedang digunakan untuk mengidentifikasi analisis sisa-sisa manusia,
sisa-sisa tersebut mungkin beberapa tahun sebelum mereka dianalisis atau mungkin pernah
terpapar lingkungandengan suhu tinggi.Sesungguhnya pada yang demikian itu situasi DNA
dalam bahan selular tidak akan berada dalam kondisi murni dan akan terurai. Hal ini mengarah
ke karakteristik profil DNA dengan lebih amplifikasi dari lokus yang lebih kecil dan
keberhasilan penurunan penuh dengan ukuran alel.Gambar 7.10 dan 7.11 menunjukkan dua
contoh sampel DNA yang terurai; yang pertama adalah sampel dari tulang yang telah di dalam
air selama 30 tahun.Lokus kecil lebih diperkuat sedangkan lokus yang lebih besar hampir tidak
terdeteksi 22 - penurunan amplifikasi secara bertahap sebagai panjang alel meningkat.

11
Gambar 7.10 .
Profil dihasilkan menggunakankit AmpFlSTR® Profiler Plus® dari terapan
biosystems .Ekstraki DNA darisuatu tulang pulih dari sebuah danau Skotlandia
setelah sekitar 30 tahun . Profil khas dari profil terdegradasi dengan pengurangan
bertahap dalam jumlah produk sebagai amplicon bertambah besar ( lihat piring sesi
full-colour gambar versi ini)

Dalam contoh kedua, contoh lokus putus dapat dilihat pertama dua lokus biru, D3S1358 dan
vWa telah berhasil diperkuat tetapi tidak ada FGA alel.Profil ini adalah dari jaringan otot
manusia yang telah terpapar untuk suhu tinggi dan terurai hingga masih sangat sedikit atau tidak
ada DNA yang 200 bp atau lebih lama 23 .Hasil dari penguraian profil dapat sulit dan perhatian
khusus harus diambil ketika homozigot yang terdeteksi lokus –apakah mereka benar benar
homozigot dan tidak heterozigot dengan salah satu alel telah putus ? Maka tingkat ini sangat
rendah , jika ada cukup bahan PCR dilakukan rangkap dua , dengan LCN PCR , untuk
meminimalkan kemungkinan adanya profil yang salah.
Analisis untuk membantu proses DNA yang terurai, serangkaian multiplexes telah
dikembangkan dengan primers diposisikan dekat dengan inti mengulangi dari STRs, dengan
demikian meminimalkan panjang amplicons.

12
Gambar 7.11
Gambar ini adalah profil yang dihasilkan menggunakan AmpFlSTR Blue™ dari
aplikasi biosistem .DNA itu diambil dari jaringan otot yang diambil dari sebuah
kecelakaan pesawat .Otot yang telah terkena suhu tinggi dan DNA ini sangat rusak -
produk amplifikasi tidak terdeteksi lokus FGA .Ukuran standar juga ditunjukkan oleh
yang bukan puncak gelap ( puncak piring lihat bagian full-colour untuk versi angka
ini).

13