TUGAS JURNAL ORAL BIOLOGY

 Kallikrein Promotes Inflammation in Human Dental Pulp Cells Via Protease-Activated

Receptor-1 (Kalikrein Mendukung Terjadinya Inflamasi pada Sel Pulpa Gigi Manusia
melalui Reseptor Aktif- Protease- 1)
 Plasmin is involved in inflammation via protease-activate receptor-1 activation in human
dental pulp (Plasmin terlibat dalam peradangan melalui protease-activated reseptor-1
pada pulpa gigi manusia)

Tema: Mekanisme Rasa Sakit Penyakit Pulpa dan Periapikal

Sebagai tugas

Mata kuliah Oral Biology

Dosen pembimbing: drg. Shanty Chairani, M.Si.

Disusun oleh:

Saphira Pramudita

(Nomor Induk Mahasiswa: 04031281621037)

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER GIGI

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

TAHUN AJARAN 2017/2018

Kalikrein Mendukung Terjadinya Inflamasi pada Sel Pulpa
Gigi Manusia melalui Reseptor Aktif- Protease- 1

Abstrak

Plasma kalikrein (KLKB 1), sebuah serin protease, memecah molekul kininogen yang tinggi
untuk memproduksi bradikinin, vasodilatator poten dan peptida pro- inflamatori tinggi. Selain
itu, KLKB 1 mengaktifkan plasminogen dan leukosit lain dan faktor pembekuan darah dan
mengolah pro- encephalin, prorenin, dan C3. KLKB 1 juga menunjukkan dapat memecah
reseptor aktif- protease pada sel otot polos vaskuler untuk meregulasi ekspresi faktor reseptor
pertumbuhan epidermal. Dalam penelitian ini, kami meneliti inflamasi- tergantung KLKB 1 dan
aktivasi reseptor aktif- protease 1 pada sel pulpa gigi. Sel ini merespon stimulasi KLKB 1
dengan meningkatnya Ca+2 intraseluler, meningkatkan regulasi siklooksigenase- 2, dan sekresi
Prostagladin E2. Terlihat jelas, SCH79797, reseptor antagonis aktif- protease menghalangi efek-
efek tersebut. Sehingga, data ini mengindikasi bahwa KLKB 1 mempengaruhi reaksi inflamasi
pada jaringan gigi melalui reseptor aktif- protease. J. cell. Biochem. 117: 1522- 1528, 2016.

Kata kunci: Kalikrein; Reseptor Aktif- Protease; Inflamasi; Pulpa Gigi; Pulpitis

Kelangsungan hidup gigi ditentukan terutama oleh kesehatan pulpa, sebuah jaringan yang berasal
dari mesenkim yang terdiri dari lapisan odontoblas dan jaringan ikat imunokompeten dengan
elemen syaraf dan vaskuler. Iritasi pada pulpa karena stimuli mekanik, termal, kimiawi, atau
bakteri menyebabkan inflamasi [Selzer dan Bender, 1984] dan memproduksi sitokin
proinflamatori, seperti interleukin- 1β (IL- 1β), prostaglandin, siklooksigenase (COX), dan faktor
tumor nekrosis (TNF) [Sundqvist and Lerner, 1996; Chang et al., 2006]. Setelah beberapa iritasi,
jaringan menjadi nekrosis karena tidak memiliki kemampuan untuk sembuh.

Terutama pulpitis yang berhubungan dengan degradasi jaringan. Tentu saja, aktivitas elastinolitik
dan kolagenolitik meningkat pada pasien pulpitis supuratif dan nekrosis [Morand et al., 1981].
Selain itu, sitokin pro- inflamatori meningkatkan ekspresi matriks metalloproteinase [O’Boskey
dan Panagakos, 1998]. Penelitian ini mengindikasi bahwa reaksi inflamatori pada pulpa mirip
dengan jaringan lain. Sehingga, memahami reaksi lain dengan baik akan meningkatkan
perkembangan dalam pencegahan atau perawatan terapeutik.

Plasma kalikrein (KLKB1), sebuah serin protease, meregulasi maturasi pada beberapa precursor
protein [Metters et al., 2006] dan prorenin [Sainz et al., 2007; Schmaier, 2008]. Juga, protease ini
menghasilkan bradikinin selama pembekuan dengan memecah kininogen yang memiliki berat
molekul tinggi [Kitamura et al., 1985]. Kinin meningkatkan hiperpermeabilitas pembuluh darah,
migrasi leukosit, kontraksi otot polos, vasodilatasi, edema, dan eksresi natrium dari tubulus
renal. Selanjutnya, kinin meringankan nyeri, inflamasi akut, dan hipertensi [Francel, 1992]. Oleh
karena itu, memahami sistem kalikrein- kinin dapat mendasari pengendalian inflamasi.

Reseptor aktif- protease (PAR)-1 sampai PAR- 4 adalah reseptor pasangan protein G dengan
tujuh domain transmembran [Coughlin, 2000; Trejo, 2003]. PAR didistribusikan secara meluas,
terutama sepanjang sistem pencernaan, dan meregulasi beberapa proses fisiologis, termasuk
sekresi eksokrin dari saliva, lambung, atay kelenjar pancreas, motilitas otot polos
gastrointestinal, sitoproteksi mukosa lambung, dan penekanan nyeri visceral [Kawabata et al.,
2008]. PAR diaktivasi oleh pemecahan domain terminal ekstraseluler- N, sebuah peristiwa yang
memungkinkan terminus- N baru secara alosterik mengaktivasi jalur sinyal transduksi [coughlin,
2000; Trejo, 2003]. Tentu saja, pemecahan pada beberapa tempat aktivasi spesifik menentukan
karakteristik fungsional pada hasil reseptor yang diaktivasi. Tentu saja, protease yang
mengaktivasi PAR diidentifikasi melalui jalur yang dipengaruhi oleh tempat pemecahan berbeda
[Trivedi et al., 2009; Jaffre at al., 2012]. Selain itu, aktivasi PAR menyebabkan respon inflamasi.
Sebagai contoh, PAR-1 juga menstimulasi ekspresi COX-2 dan prostaglandin E 2 (PGE2) pada
miofibroblas dan kardiomikosit [Seymour et al., 2003; Chien et al., 2014].

Fibroblast pulpa PAR- 1, PAR- 3, dan PAR- 4 [Gruber et al., 2004]. Lebih lanjut, PAR- 2 terlihat
meregulasi inflamasi pulpa akibat karies [Lundy et al., 2010] dan memediasi pelepasan
neuropeptide hasil dari pemecahan protease arginine- spesifik sistein [Tancharoen et al., 2005].
Fibroblast gingiva juga mengekspresikan PAR-1 dan PAR- 3 [Chan et al., 2008], dan sekresi IL-
6 sebagai respon PAR- 1 [Tanaka et al., 2004]. Tambahan, kami menunjukkan bahwa plasmin
mengaktivasi PAR- 1 untuk menstimulasi ekspresi IL- 8 dan melepaskan PGE 2 [Kamio et al.,
2008]. Penelitian ini mengamati langsung PAR mungkin terlibat dalam pulpitis melalui
mekanisme yang belum terjelaskan secara lengkap.
Pada penelitian saat ini, kami menunjukkan bahwa KLKB 1 mengaktivasi PAR-1 yang
menyebabkan reaksi inflamasi pada pulpa gigi.

Material dan metode

Material

Fungizone, tripsin, dan medium α esensial (α- MEM) ditambahkan dengan serum fetal calf
(FCS) yang diperoleh dari GIBCO BRL Life Technologies (Tokyo, Japan). Penisilin G Dan
kanamisin diperoleh dari Meiji Seika (Tokyo, Japan), dan Fura- 2/ am diperoleh dari Dojindo
Labs (Tokyo, Japan). Rekombinan plasma KLKB1 diperoleh dari R&D system (MN). N3-
siklopropil-7-{[4-(1- metiletil) fenil] metil}-7H- pirolo[3,2- f]kinazolin- 1,3- diamin
(SCH79797) diperoleh dari Tocris Bioscience (Ellisville, MI). Paket imunoassai enzim PGE 2
diperoleh dari Oxford Biomedical Research (MI). Antibodi tikus yang melawan COX-2 manusia
didapat dari Santa Cruz Biotechnology (CA). Antibodi kelinci yang melawan aktin- β manusia
dan horseradish peroksidase (HRP)- terkonjungasi anti- igG kelinci didapat dari Cell Signaling
Technology (Danvers, MA). HRP- terkonjungasi anti- IgG tikus didapat dari HIS Globalspec
(NY).

Kultur Sel

Sel pulpa (seperti- fibroblast) diambil dari ekstraksi molar ketiga dibawah kondisi aseptic dari
pasien berumur 20 tahun yang menjalani perawatan ortodontik. Jaringan diiris pada coverslip
kaca steril dan dikultur untuk dipertemukan dalam α- MEM dengan tambahan 10% FCS, 20
U/mL penisilin G, 100 µg/mL kanamisin, dan 250 ng/mL fungizone. Setelah itu, sel dilepaskan
dengan 0.05% tripsin dalam garam buffer sulfat, disubkultur dalam labu kultur, dan disepuh pada
2 x 105 sel/mL setelah 6-9 bagian.

Informed consent diperoleh dari seluruh pasien, dan penelitian telah disetujui oleh komite etik
Nihon University School of Dentistry di Matsudo (No. EC12-010).

Mengukur Ca2+ Intraseluler

Sel pulpa (1x 105 ) dikultur pada plat kaca tipis, melingkar, berukuran 13.5 mm yang
mengandung α- MEM dengan 10% FCS. Sel yang dipertemukan lalu diberi label selama 30
menit pada suhu 37 ℃ dengan 2 mM Fura-2 /AM di α- MEM, dicuci dua kali, dan ditanam
kedalam kuarsa cuvettes yang mengandung larutan Krebs-Ringer-HEPES (120mM NaCl, 5mM
KCl, 1mM MgSO4, 0.96mM NaH2PO4, 0.2% glukosa, 0,1% serum bovine albumin, 1mM CaCl2,
dan 20mM HEPES, pH 7.4). Fluoresensi pada 500nm diukur dengan spektrofluorometer CAF-
110 (Nion Bunkou, Jepang), dengan eksitasi pada 340 dan 380 nm. Intraselular Ca2+ dihitung dari
rasio intensitas fluoresensi [Grynkiewicz dkk., 1985].

Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

Sel-sel pulpa gigi (1x106) dibiakkan untuk berkumpul di Kultur jaringan 10-cm yang
mengandung α-MEM yang mengandung 10% FCS. Kultur kemudian diinkubasi selama 24 jam
dalam α -MEM yang mengandung 1% FCS. Untuk mengukur efek KLKB1 terhadap ekspresi
COX-2, sel diinkubasi selama 1 jam dengan atau tanpa KLKB1 dalam α –MEM yang ditambah
dengan 1% FCS. RNA total kemudian diekstraksi dengan menggunakan sebuah RNeasy Mini
Kit (Qiagen, Hilden, Jerman), dengan mengikuti aturan pabrik. Selanjutnya, cDNA disintesis
dan diperkuat oleh RT-PCR menggunakan One Step RT-PCR Kit (Qiagen) dan instrumen PCR
Thermal Cycler Dice (TaKaRa, Shiga, Jepang). Secara singkat, RNA (100 ng) diperkuat dengan
500 nM oligonukleotida primer untuk COX-2 dan gliseraldehida- 3-fosfat dehidrogenase
(GAPDH). Reaksi itu dilakukan dengan predenaturasi selama 30 menit pada suhu 95 ℃ dan
amplifikasi dengan 22 siklus denaturasi pada suhu 94 ℃ selama 30 detik, pendinginan pada
suhu 55 ℃ selama 30 detik, elongasi pada 72 ℃ selama 30 detik, dan perpanjangan akhir
selama 10 menit pada suhu 72 ℃ . Akhirnya, produk amplifikasi di elektroforesis pada 2.0%
gel agarosa dan divisualisasikan dengan etidium bromida. Urutan primer tercantum pada Tabel I.

Real- Time RT-PCR

Sel-sel pulpa gigi dikultur untuk disatukan dalam kultur jaringan 10 cm yang mengandung α-
MEM dilengkapi dengan 10% FCS. Sel kemudian diinkubasi selama 24 jam mengandung α
-MEM yang mengandung 1% FCS, dirangsang dengan KLKB1, dan dicuci dua kali dengan PBS.
RNA total diekstraksi menggunakan RNeasy Mini Kit (Qiagen), mengikuti instruksi pabrik.
Konsentrasi RNA diukur dengan absorbansi pada 260 dan 280 nm. PCR real-time dilakukan
pada reaksi 25-µL menggunakan One-Step SYBRR PrimeScript RT-PCR Kit 2 (TaKaRa) dan
Thermal Cycler Dice Real-Time System (TaKaRa). Reaksi mengandung 1 µL RNA (total 100
ng), 12.5 µL 2x One- Step SYBRR RT-PCR buffer 4, 1 µL PrimeScript One-step Enzyme Mix 2,
400 nM masing-masing primer maju dan mundur, dan 8.5 µL RNase-free dH 2O. RNA
ditranskripsi secara terbalik selama 5 menit pada suhu 42 ℃ , didenaturasi pada 95 ℃
selama 10 detik, dan diamplifikasi lebih dari 50 siklus denaturasi pada 95 ℃ selama 5 detik,
dan didinginkan/diekstensi pada suhu 60 ℃ selama 30 detik. Primer untuk COX-2 dan
GAPDH tercantum dalam Tabel II.

Western Blotting

Sel-sel pulpa gigi (1x 106) dibiakkan untuk berkumpul di plat kultur jaringan 10 cm dengan α-
MEM dan 10% FCS dan kemudian diinkubasi selama 24 jam pada α--MEM dan 1% FCS. Sel
dilisis dengan CelLytic M (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) dilengkapi dengan Complete Mini
EDTA- free Protease Inhibitor Cocktail (Roche, Mannheim, Jerman), 100 mM PMSF, 0.2mM
EGTA, dan 2mM EDTA. Konsentrasi protein diukur dengan menggunakan metode Bradford
[1976]. Sampel direbus selama 5 menit pada suhu 95 ℃ dalam buffer yang mengandung
natrium dodesil sulfat, dipisahkan pada gel poliakrilamida 7.5%, dan dipindahkan ke membran
nitroselulosa pada 12.5 V semalaman. Membran diblokir pada suhu kamar selama 50 menit
dengan susu skim (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan), diperiksa selama 120 menit
dengan antibodi tikus yang melawan COX-2 (1: 1.000) dan antibodi kelinci yang melawan β-
actin (1: 1000), dicuci tiga kali dengan 4% susu skim mengandung 0,05% Tween 20, dan diberi
label untuk 90 menit dengan HRPterkonjungasi anti- igG tikus (1: 3.000) dan HRP terkonjungasi
anti- igG kelinci (1: 2.000). Immunoreaktivitas terdeteksi menggunakan ECL Prime Western
Blotting Detection System (GE, NJ) dan dihitung pada Adobe Photoshop.

Tabel I. Primer untuk RT-PCR

Gen Gen Bank Acc Primer Ukuran (bp)

Sekresi PGE2

Sel dilapisi pada 5x104 sel /cekungan di plat cekung- 24 yang mengandung α-MEM dan 10%
FCS. Ketika bertemu/ konfluen, sel diinkubasi selama 24 jam pada α-MEM yang mengandung
1% FCS dan dirangsang dengan KLKB1 selama 30 menit. Akhirnya, PGE 2 yang disekresikan ke
media kultur diukur dengan menggunakan paket enzim immunoassai sesuai instruksi pabrik.
Analisis Statistik

Hasil dilaporkan sebagai rata- rata ± SEM dari jumlah yang ditunjukkan pada percobaan. Data
dianalisis dengan menggunakan tes Tukey. Perbedaan nilai P kurang dari 0,05 dianggap
signifikan.

Hasil

KLKB1- menginduksi mobilisasi Ca2+

KLKB1 telah dilaporkan memobilisasi Ca2+ pada trombosit dan sel endotel kapiler otak. Kami
menemukan bahwa pada sel-sel pulpa, 1 µg / mL KLKB1 meningkatkan Ca 2+ intraselular dalam
30 detik, dengan tingkat yang secara bertahap memuncak pada 90 detik sebelum menurun ke
tingkat yang stabil (Gambar 1A). Peningkatan Ca2+ intraseluler merupakan konsentrasi yang
dependen (Gambar 1B).

KLKB1 menimbulkan ekspresi mRNA Cox-2

Analisis RT-PCR menggunakan primer spesifik untuk COX-2 yang menghasilkan single band
dengan ukuran yang diprediksi (310 bp), menunjukkan bahwa enzim tersebut diekspresikan
dalam sel pulpa gigi (Gambar 2). Intensitas band meningkat dengan paparan KLKB1 dalam
konsentrasi yang bergantung cara (Gambar 2A). Selain itu, ekspresi COX-2 memuncak 1 jam
setelahnya perawatan dengan KLKB1 dan menurun setelahnya (Gambar 2B). Demikian pula,
RT-PCR real-time menunjukkan bahwa rangsangan dengan KLKB1 selama 1 jam secara
signifikan meningkatkan ekspresi COX-2 pada konsentrasi bergantung cara (Gambar 2C).
Selain itu, ekspresi COX-2 memuncak selama 1 jam pada sel yang dirawat dengan KLKB1 0,5
µg / mL (Gambar 2D).

PAR-1 SCH79797 antagonis menghambat KLKB1- yang menginduksi mobilisasi Ca2+

SCH79797 secara potensial dan selektif menentang trombin-activated PAR-1 [Ahn et al., 2000].
Pada sel pulpa gigi yang diberi dengan 2 atau 20µM SCH79797 selama 10 menit, 1µM KLKB1
gagal menginduksi kenaikan Ca2+ intraselular (Gambar 3). Namun, antagonis tidak
mempengaruhi tingkat dasar Ca2+ (data tidak ditunjukkan). Pengamatan ini sangat menyarankan
bahwa pelepasan Ca2+ yang tergantung KLKB1 dapat digabungkan ke aktivasi PAR-1.
Ekspresi mRNA Cox-2- tergantung KLKB1 memerlukan aktivasi PAR-1

Dengan menggunakan RT-PCR dan RT-PCR real-time, kami mengukur ekspresi COX- 2
tergantung KLKB1 pada sel yang diperlakukan dengan atau tanpa SCH79797 (Gambar 4). PAR-
1 Antagonis (0.2 dan 2 µM) mengurangi kemampuan 0.5µg / mL KLKB1 untuk merangsang
ekspresi COX-2, menunjukkan bahwa PAR-1 yang diaktifkan sangat penting untuk efek ini.
Obat itu tidak menginduksi ekspresi COX-2 sendiri (data tidak ditunjukkan).

KLKB1 menginduksi ekspresi protein Cox-2 via PAR-1

Kelimpahan protein COX-2 secara nyata meningkat di dalam sel yang diolah dengan 1 µg / mL
KLKB1 selama 1 jam (Gambar 5). Namun, PAR-1 antagonis SCH79797 (2 µM) membalikkan
efek ini. Pengamatan ini menyarankan agar KLKB1yang menginduksi ekspresi protein COX-2 di
sel pulpa gigi digabungkan dengan aktivasi PAR-1.

Tabel I. Primer untuk RT-PCR

Gen Gen Bank Acc Primer Ukuran (bp)

Gambar. 1. Kalikrein (KLKB1) meingkatkan Ca 2+ intraseluler pada sel pulpa manusia. (A) Mobilisasi Ca 2+ pada sel pulpa manusia sarat dengan Fura-2 dan distimulasi dengan 1µg/mL
KLKB 1 pada titik waktu yang ditandai anak panah. Hasilnya direpresentatifkan dengan tiga eksperimen yang independen. (B) Dosis yang tergantung peningkatan Ca 2+ intraseluler.
Tingkat dasar pada kontrol sel (sebelum stimulasi) dikurangi dari KLKB1 yangmenginduksi nilai puncak Ca 2+. Nilai merupakan rata-rata ±SEM dari tiga eksperimen independen.
*P<0.05; **P<0.01 versus kontrol.

KLKB1 menginduksi pelepasan PGE2 digabungkan dengan aktivasi PAR-1

Pemaparan sel pulpa gigi dengan 1 µg / mL KLKB1 selama 1 jam dengan jelas merangsang
pelepasan PGE2, eikosanoid yang terlibat dalam peradangan (Gambar 6). Namun, pelepasan
PGE2 sangat berkurang terhadap 2 µM SCH79797, sangat disarankan KLKB1 yang mendukung
peradangan diaktivasi melalui PAR-1.

Diskusi

Pulpitis menyebabkan rasa sakit yang hebat, dan perawatan saluran akar bisa diperlukan bila
jaringan pulpa telah nekrosis. Namun, perawatan yang dilakukan mungkin bisa mendegradasi
struktur gigi secara jangka panjang [Trabert dkk, 1978]. Dengan demikian, menjaga kesehatan
pulpa gigi adalah strategi paling efektif untuk mencegah sakit gigi dan kehilangan gigi.
Menjelaskan mekanisme yang mendorong terjadinya pulpitis dapat membantu mencegah
degradasi jaringan, meski peran peradangan terus diperdebatkan. Tentunya, sementara ini
penyebab peradangan masih diyakini karena beberapa detrimental pada jaringan pulpa [Elsalhy
dkk, 2013], beberapa derajat peradangan mungkin juga diperlukan untuk membentuk dentin
tersier [Okabe dan Matsushima, 2006]. Dalam penelitian ini, kami meneliti hubungan antara
pulpitis dan protease serin KLKB1 berdasarkan laporan yang menunjukkan bahwa protease
terlibat dalam proses patologis dan fisiologis di pulpa gigi. Sebagai contoh, protease kolagenase
dan elastase mendegradasi jaringan pulpa [Morand dkk, 1998], sedangkan matriks
metaloprotease-3 menginduksi migrasi sel selama penyembuhan luka [Muromachi dkk, 2012].
KLKB1 adalah protease serin multifungsi yang, bersama dengan F12, F11, dan kininogen
dengan berat molekul yang tinggi, terdiri dari sistem kontak-kinin [Thomas, 2015].
 Gambar.2. KLKB1- tergantung ekspresi mRNA COX-2. (A) Sel distimulasi selama 60 menit dengan dosis KLKB1 yang ditunjuk., dan ekspresi COX-2 dan GAPDH dinilai dengan RT-PCR
dan elektroforesis gel agarosa. (B) ekspresi COX-2 dan GAPDH dinilai oleh RT-PCR dan elektroforesis gel agarosa pada sel pulpa yang dirawat dengan 0.5 µg/mL KLKB1 untuk waktu
tertentu. (C) sel pulpa distimulasi selama 60 menit dengan peningkatan konsentrasi KLKB1, dan ekspresi COX-2 dihitung dengan real time RT-PCR,dan dinormalkan dengan GAPDH, dan
dilaporkan tingkat ekspresi sel yang tidak dirawat bersifat relatif. Nilai didapatkan dari rata-rata ±SEM dari tiga eksperimen independen. *P<0.01 versus sel yang tidak dirawat. (D) Ekspresi
COX-2 diukur dengan real time RT-PCR, pada sel yang dirawat dengan KLKB1 untuk beberapa waktu tertentu. Ekspresi normal terhadap GAPDH dan dilaporkan ekspresi sel yang tidak
distimulasi relatif. Nilai didapatkan dari rata-rata ±SEM dari tiga eksperimen independen.*P<0.05 *P<0.01 versus sel yang tidak distimulasi (0 menit).

Gambar.3. SCH79797 menghambat KLKB1- yang menginnduksi peningkatan Ca2+. (A) Jarak waktu yang direpresentatifkan dan (B) kuantifikasi mobilisasi Ca 2+ pada pulpa gigi
sarat dengan Fura-2, dirawat/diberi selama 30 menit dengan atau tanpa SCH79797 (2 dan 20 µM), dan distimulasi dengan KLKB1. SCH79797 merupakan antagonis dari reseptor
aktif –protease (PAR-1). Nilai pada (B) merupakan rata-rata. **P<0.01 versus kontrol.

Protease ini diidentifikasi sebagai enzim saluran kemih yang mengurangi tekanan darah pada
pasien nondialitis dengan ginjal yang mengalami gangguan [Frey, 1926]. Bentuk protein yang
aktif disebut KLKB1, sedangkan prekursor tidak aktif disebut prekalikrein. Prekalikrein
diekspresikan terutama di hati dan disekresikan ke dalam peredaran darah secara in vivo [Mandle
dkk, 1976]. Prekalikrein dipecah untuk menghasilkan KLKB1 oleh Faktor XII (faktor Hageman)
yang teraktivasi. Faktor XII sendiri diaktifkan untuk aktivasi faktor XIIa dengan perubahan
muatan negatif di permukaan dan setelah cedera faktor XIIa diregulasi ke sel endotel vaskular
[Cerf dkk, 1999; Schmaier, 2008]. Di pulpa gigi ada banyak kapiler yang terhubung dengan
 saraf, yang bisa menyampaikan sinyal ke otak.
Oleh karena itu, reaksi ini bisa terjadi di dalam
pulpa, dan KLKB1 yang diaktifkan dapat
mencapai pulpa untuk mengaktifkan Ca2+ dan
pensinyalan COX-2. Selain itu, serin KLKB1
protease [Linardoutsos dkk, 2014] meregulasi
proses fisiologis seperti aktivitas leukosit dan
platelet [Cassaro dkk, 1987], aktivasi plasminogen
[Miles dkk, 1983], dan proses proenkephalin,
prorenin, dan C3 [Hayashi dkk, 2002].
Khususnya, KLKB1 memecah kininogen yang
memiliki berat molekul tinggi untuk menghasilkan
bradikinin, sebuah vasodilator poten dan peptida
Gambar 4. SCH79797 menghambat KLKB1-dependentCOX-2
mRNAexpression.Human sel pulpa gigi diinkubasi selama 30 menit dengan atau tanpa pro-inflamasi [Sainz dkk, 2007]. Selain itu,
SCH79797 (0,2 dan 2mM) dan distimulasi dengan KLKB1. Tingkat ekspresi COX-2 dan
GAPDH dinilai oleh (A) RT-PCR dan elektroforesis gel agarosa dan (B) secara real-time KLKB1 banyak diekspresikan pada sel otot polos
RT-PCR. Dalam (B), ekspresi COX-2 dinormalisasi pada GAPDH dan dilaporkan relatif
terhadap ekspresi dalam sel yang tidak distimulasi. Nilai adalah sarana? SEM dari tiga media tunika dan endotel, foamy makrofag, sel
percobaan independen Sel P <0,01 versus sel yang tidak distimulasi; † P <0,05; †† P
<0.01 versus sel yang dirangsang dengan KLKB1 tanpa adanya SCH79797. inflamasi, dan fibroblas di dalam intima yang
menebal pada plak pembuluh darah [Cerf dkk, 1999].

Dalam beberapa tahun terakhir, protease kalikrein dilaporkan dapat memicu pensinyalan
kaskade melalui PAR [Houle dkk., 2005; Mize dkk., 2008; Ramsay dkk., 2008; Abdallah dkk.,
2010; Burda dkk., 2013], terdapat mekanisme yang berbeda dari jalur yang bergantung- pada
kinin. Sampai saat ini, empat PAR (PAR-1 sampai PAR-4) telah ditemukan dan dikloning
[Coughlin, 2000]. PAR mereguasi proliferasi sel, pensinyalan Epidermal Growth Factor Reseptor
(EGFR), dan ekspresi COX-2 dan Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) [Hirota dkk.,
2012; Zhang dkk., 2012]. Di pulpa gigi, sel fibroblas telah dilaporkan mengekspresikan PAR-1,
PAR-3 [Gruber dkk., 2004], dan PAR-2 [Tancharoen dkk., 2005]. PAR ini dapat memicu
berbagai sinyal kaskade yang merangsang ekspresi COX-2 dan memperparah/eksaserbasi
pulpitis. Khususnya, kami sebelumnya telah menunjukkan bahwa PAR-1 yang mengaktifkan
peptide yang memobilisasi Ca2+. Namun, mengaktifkan peptida untuk PAR-2, PAR-3, dan PAR-4
yang memobilisasi Ca2+ lemah [Kamio dkk., 2008]. Khususnya, KLKB1yang menginduksi
ekspresi gen pada otot polos pembuluh darah aorta melalui PAR-1 [Abdallah dkk., 2010], dan
kalikrein telah menunjukkan secara langsung pengaktifan PAR-1 serupa dengan cara pengaktifan
trombin [Yoon dkk., 2013], yang memisahkan PAR-1 antara Arg-41 dan Ser-42 di eksodomain

Gambar.4. SCH79797 menghambat KLKB1- tergantung ekspresi mRNA COX-2. Sel pulpa
manusia di preinkubasi selama 30 menit dengan atau tanpa SCH79797 (0.2 dan 2 µM) dan
distimulasi dengan KLKB1. Tingkat ekspresi COX-2 dan GAPDH dinilai dengan (A) RT-PCR dan
elektroforesis gel agarosa dan (B) dengan real- time RT- PCR. Pada (B), ekspresi COX-2
dinormalisasi oleh GAPDH dan menunjukkan ekspresi sel yang tidak distimulasi relative. Nilai
merupakan rata-rata ±SEM dari tiga eksperimen independen. **P<0.01 versus sel yang tidak
distimulasi; +P<0.05; ++P<0.01 versus sel yang distimulasi dengan KLKB1 dengan tidak
hadirnya SCH79797.
 [Vu dkk., 1991]. Oleh karena itu, kami juga
menyelidiki apakah PAR-1 terlibat dalam
proses KLKB1 pada jaringan pulpa.

Kami sebelumnya, melaporkan bahwa

jaringan pulpa secara dominan
Gambar.5. Penghambatan KLKB1- tergantung ekspresi protein COX-2 oleh
SCH79797. Sel pulpa gigi dipapar selama 30 menit dengan SCH79797 dan lalu dirawat mengekspresikan PAR-1 [Kamio dkk., 2008].
selama 1 jam dengan KLKB1. Ekstrak sitoplasmik diuji untuk COX-2 dan β- aktin oleh
western blotting Dalam penelitian saat ini, kami menunjukkan
bahwa PAR-1 antagonis SCH79797
menghalangi kemampuan KLKB1 untuk meningkatkan Ca2+ intraselular. Demikian pula,
SCH79797 menunjukkan telah menghalangi konsentrasi peningkatan Ca2+ intraselular karena
PAR yang mengaktifkan peptida SFLLRN [Kamio dkk., 2008]. Namun, puncak Ca 2+ intraselular
pada tingkat yang berbeda saat sel-sel terpapar KLKB1 atau SFLLRN, mungkin karena PAR-1
dipecah pada tempat yang berbeda [Kamio dkk., 2008]. Seperti SFLLRN [Kamio dkk., 2014],
KLKB1 juga jelas menginduksi ekspresi COX-2 pada konsentrasi dan merangsang pelepasan
PGE2. Kami menemukan bahwa SCH79797 juga menghalangi efek ini. Perlu diketahui,
SCH79797 saja tidak meningkatkan mRNA COX-2 dan oleh karena itu diyakini tidak beracun.

Pengamatan ini sangat menyarankan agar PAR-1 berfungsi secara aktif dalam sel pulpa seperti
fibroblas. Namun, tidak begitu jelas mengapa PAR berbeda mengekspresikan jaringan ini.
Ekspresi diferensial ini mungkin disebabkan oleh heterogenitas kultur pulpa, yang, meski kaya
fibroblas, juga mungkin mengandung jenis sel lainnya, termasuk progenitor odontoblas. Namun,
sulit untuk memprediksi apakah reaksi ini
merupakan karakteristik Sel pulpa manusia
karena kami hanya meneliti sel pulpa manusia
dalam penelitian ini. Ada kemungkinan KLKB1
bisa menginduksi reaksi inflamasi pada jenis sel
lainnya. Karena itu, penelitian lebih lanjut
Gambar.6. KLKB1- yang menginduksi pelepasan prostaglandin E 2 dengan tidak hadirnya
SCH79797. Sel pulpa gigi dirawat dengan atau tanpa 2µM SCH79797 selama 30 menit dan diperlukan untuk menentukan apakah reaksi ini
distimulasi dengan 1 µg/mL KLKB1 selama 1 jam. Lepasnya prostaglandin E2 kedalam
medium ditentukan dengan enzim yang menyerupai imunoassai. Nilai merupakan rata-rata spesifik pada pulpitis. Secara keseluruhan, data
±SEM dari tiga eksperimen independen. *P<0.05; +P<0.05 versus sel yang distimulasi
dengan KLKB1 dengan tidak hadirnya SCH79797.
dan literatur ini menunjukkan bahwa KLKB1
terlibat pada pulpitis melalui aktivasi PAR-1.
Hasil saat ini mengingatkan pada penelitian
tentang plasmin [Kamio dkk., 2008], yang menginduksi Ekspresi COX-2 dan sekresi PGE2
melalui kalsineurin. Selain itu, KLKB1 telah dilaporkan dapat mengaktifkan PAR melalui
plasmin [Oikonomopoulou dkk., 2006]. Oleh karena itu, kita tidak dapat sepenuhnya
mengecualikan kemungkinan kontribusi aksis KLKB1-plasmin-PAR1. Juga, data kami
menunjukkan bahwa aktivasi PAR-1 sangat penting dalam kedua kasus tersebut. Mekanisme
mediasi efek ini masih belum jelas. Bahkan, jalur dimana KLKB1 berusaha berperan ganda di
kinin dan produksi COX-2 masih belum dapat diketahui. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk
menjelaskan mekanisme di mana KLKB1 mendukung pulpitis.

Ucapan Terima Kasih

Kami ingin mengucapkan terima kasih kepada Editage (www.editage.jp) untuk mengedit dalam
bahasa Inggris. Penelitian ini didukung oleh Grants-in Aid for Scientific (No. 24392079,
24592885) dari Japan Society for the the Promotion of Science (JSPS).

Referensi

Abdallah RT, Keum JS, El-Shewy HM, Lee MH, Wang B, Gooz M, Luttrell DK, Luttrell LM,
Jaffa AA. 2010. Plasma kallikrein promotes epidermal growth factor receptor transactivation
and signaling in vascular smooth muscle through direct activation of protease-activated
receptors. J Biol Chem 285:35206–35215.
Ahn HS, Foster C, BoykowG, Stamford A, MannaM, GrazianoM. 2000. Inhibition of cellular
action of thrombin by N3-cyclopropyl-7-[[4-(1-methylethyl) phenyl] methyl]-7H-pyrrolo[3,
2-f]quinazoline-1,3-diamine (SCH 79797), a nonpeptide thrombin receptor antagonist.
Biochem Pharmacol 60:1425–1434.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities
of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72:248–254.
Burda JE, Radulovic M, Yoon H, Scarisbrick IA. 2013. Critical role for PAR1 in kallikrein 6
mediated oligodendrogliopathy. Glia 61:1456–1470.
Cassaro CM, Sampaio MU, Maeda NY, Chamone DF, Sampaio CA. 1987. Human plasma
kallikrein: Effect on the induced platelet aggregation. Thromb Res 48:81–87.
Cerf M, Raidoo D, Fink E, Fritz H, Bhoola K. 1999. Plasma kallikrein localisation in human
blood vessels. Immunopharmacology 44:75–80.
Chang MC, Chen YJ, Tai TF, Tai MR, Li MY, Tsai YL, Lan WH, Wang YL, Jeng JH. 2006.
Cytokine-induced prostaglandin E2 production and cyclooxygenase- 2 expression in dental
pulp cells: Downstream calcium signalling via activation of prostaglandin EP receptor. Int
Endod J 39:819–826.
Chan CP, Chang MC,Wang YJ, Chen LI, Tsai YL, Lee JJ, Jia HW, Jeng JH. 2008. Thrombin
activates Ras-CREB/ATF-1 signaling and stimulates c-fos, c-jun, and c-myc expression in
human gingival fibroblasts. J Periodontol 79:1248–1254.
Chien PT, Hsieh HL, Chi PL, Yang CM. 2014. PAR1-dependent COX-2/PGE2 production
contributes to cell proliferation via EP2 receptors in primary human cardiomyocytes. Br J
Pharmacol 171:4504–4519.
Coughlin SR. 2000. Thrombin signalling and protease-activated receptors.Nature 407:258–264.
Elsalhy M, Azizieh F, Raghupathy R. 2013. Cytokines as diagnostic markers of pulpal
inflammation. Int Endod J 46:573–580.
Francel PC. 1992. Bradykinin and neuronal injury. J Neurotrauma 9(Suppl1): S27–S45.
Frey EK. 1926. Zusammenh€ange zwischen Herzarbeit und Nierent€atigkeit. Arch Klin Chir
142:663–669.
Gruber R, Jindra C, Kandler B, Watzak G, Fischer MB, Watzek G. 2004. Proliferation of dental
pulp fibroblasts in response to thrombin involves mitogen-activated protein kinase signalling.
Int Endod J 37:145–150.
Grynkiewicz G, PoenieM, Tsien RY. 1985. A new generation of Ca2þ indicators with greatly
improved fluorescence properties. J Biol Chem 260:3440–3450.
Kamio N, Hashizume H, Nakao S, Matsushima K, Sugiya H. 2008. Plasmin is involved in
inflammation via protease-activated receptor-1 activation in human dental pulp. Biochem
Pharmacol 75:1974–1980.
KamioN,Muromachi K, HayamaT, Okabe T,Kamio M, Morohashi T,Matsushima K. 2014.
Plasmin-induced cyclooxygenase-2 expression via calcineurin activation in human dental pulp
cells. Jpn J Conserv Dent 57:442–451.
Kawabata A, Matsunami M, Sekiguchi F. 2008. Gastrointestinal roles for proteinase-activated
receptors in health and disease. Br J Pharmacol 153: S230–S240.
Kitamura N, Kitagawa H, Fukushima D, Takagaki Y, Miyata T, Nakanishi S. 1985. Structural
organization of the human kininogen gene and a model for its evolution. J Biol Chem
260:8610 8617.
Hayashi J, Salomon DR, Hugli TE. 2002. Elevated kallikrein activity in plasma from stable liver
transplant recipients. Int Immunopharmacol 2:1667–1680.
Hirota CL, Moreau F, Iablokov V, Dicay M, Renaux B, Hollenberg MD, MacNaughton WK.
2012. Epidermal growth factor receptor transactivation is required for proteinase-activated
receptor-2-induced COX-2 expression in intestinal epithelial cells. Am J Physiol Gastrointest
Liver Physiol 303: G111–G119.
Houle S, Papez MD, Ferazzini M, Hollenberg MD, Vergnolle N. 2005. Neutrophils and the
kallikrein-kinin system in proteinase-activated receptor 4-mediated inflammation in rodents.
Br J Pharmacol 146:670–678.
Jaffr_e F, Friedman AE, Hu Z, Mackman N, Blaxall BC. 2012. B-adrenergic receptor stimulation
transactivates protease-activated receptor 1 via matrix metalloproteinase 13 in cardiac cells.
Circulation 125:2993–3003.
Linardoutsos D, Gazouli M, Machairas A, Bramis I, Zografos GC. 2014. Kallikrein-related
peptidases in cancers of gastrointestinal tract: An inside view of their role and clinical
significance. J BUON 19:53–59.
Lundy FT, About I, Curtis TM, McGahon MK, Linden GJ, Irwin CR, El Karim IA. 2010. PAR-2
regulates dental pulp inflammation associated with caries. J Dent Res 89:684–688.
Mandle RJ, Colman RW, Kaplan AP. 1976. Identification of prekallikrein and high-molecular
weight kininogen as a complex in human plasma. Proc Natl Acad Sci USA 73:4179–4183.
Metters KM, Rossier J, Paquin J, Chr_etien M, Seidah NG. 1988. Selective cleavage of
proenkephalin-derived peptides (less than 23,300 daltons) by plasma kallikrein. J Biol Chem
263:12543–12553.
Miles LA, Greengard JS, Griffin JH. 1983. A comparison of the abilities of plasma kallikrein,
beta-Factor XIIa, Factor XIa, and urokinase to activate plasminogen. Thromb Res 29:407–
417.
Mize GJ, Wang W, Takayama TK. 2008. Prostate-specific kallikreins-2 and -4 enhance the
proliferation of DU-145 prostate cancer cells through proteaseactivated receptors-1 and -2.
Mol Cancer Res 6:1043–1051.
Morand MA, Schilder H, Blondin J, Stone PJ, Franzblau C. 1981. Collagenolytic and
elastinolytic activities from diseased human dental pulps. J Endod 24:156–160.
Muromachi K, Kamio N, Narita T, Annen-Kamio M, Sugiya H, Matsushima K. 2012. MMP-3
provokes CTGF/CCN2 production independently of protease activity and dependently on
dynamin-related endocytosis, which contributes to human dental pulp cell migration. J Cell
Biochem 113:1348–1358.
O0Boskey FJ, Jr., Panagakos FS. 1998. Cytokines stimulate matrix metalloproteinase production
by human pulp cells during long-term culture. J Endod 24:7–10.
Oikonomopoulou K, Hansen KK, Saifeddine M, Tea I, Blaber M, Blaber SI, Scarisbrick I,
Andrade-Gordon P, Cottrell GS, Bunnett NW, Diamandis EP, Hollenberg MD. 2006.
Proteinase-activated receptors, targets for kallikrein signaling. J Biol Chem 281:32095–
32112.
Okabe T, Matsushima K. 2006. Regulation of ALP activity by TNF-alpha on human dental pulp.
J Endod 32:516–520.
Ramsay AJ, Dong Y, Hunt ML, Linn M, Samaratunga H, Clements JA, Hooper JD. 2008.
Kallikrein-related peptidase 4 (KLK4) initiates intracellular signaling via protease-activated
receptors (PARs). KLK4 and PAR-2 are co-expressed during prostate cancer progression. J
Biol Chem 283:12293–12304.
Sundqvist G, Lerner UH. 1996. Bradykinin and thrombin synergistically potentiate interleukin 1
and tumour necrosis factor induced prostanoid biosynthesis in human dental pulp fibroblasts.
Cytokine 8:168–177.
Sainz IM, Pixley RA, Colman RW. 2007. Fifty years of research on the plasma kallikrein-kinin
system: From protein structure and function to cell biology and in-vivo pathophysiology.
Thromb Haemost 98:77–83.
Schmaier AH. 2008. Assembly, activation, and physiologic influence of the plasma
kallikrein/kinin system. Int Immunopharmacol 8:161–165.
Selzer S, Bender IB. 1984. The dental pulp: Biologic considerations in dental procedures.
Philadelphia: JB Lippincott Company.
Seymour ML, Zaidi NF, Hollenberg MD, MacNaughton WK. 2003. PAR1-
dependent and independent increases in COX-2 and PGE2 in human colonic myofibroblasts
stimulated by thrombin. Am J Physiol Cell Physiol 284: C1185–C1192.
Tanaka N, Morita T, Nezu A, Tanimura A, Mizoguchi I, Tojyo Y. 2004. Signaling mechanisms
involved in protease activated receptor-1-mediated interleukin-6 production by human
gingival fibroblasts. J Pharmacol Exp Ther 311:778–786.
Tancharoen S, Sarker KP, Imamura T, Biswas KK, Matsushita K, Tatsuyama S, Travis J,
Potempa J, Torii M, Maruyama I. 2005. Neuropeptide release from dental pulp cells by RgpB
via proteinase-activated receptor-2 signaling. J Immunol 174:5796–5804.
Thomas R. 2015. The vascular side of plasma kallikrein. Blood 125:589–590. Trabert KC, Caput
AA, Abou-Rass M. 1978. Tooth fracture—A comparison of endodontic and restorative
treatments. J Endod 4:341–345.
Trejo J.2003.Protease-activated receptors:Newconcepts in regulation ofGproteincoupled receptor
signaling and trafficking. J Pharmacol Exp Ther 307:437–442.
Trivedi V, Boire A, Tchernychev B, KaneiderNC, Leger AJ,O0Callaghan K, Covic L, Kuliopulos
A. 2009. Platelet matrix metalloprotease-1 mediates thrombogenesis
by activating PAR1 at a cryptic ligand site. Cell 137:332–343.
Vu TK, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR. 1991. Molecular cloning of a
functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell
64:1057–1068.
Yoon H, Radulovic M, Wu J, Blaber SI, Blaber M, Fehlings MG, Scarisbrick IA. 2013.
Kallikrein 6 signals through PAR1 and PAR2 to promote neuron injury and exacerbate
glutamate neurotoxicity. J Neurochem 127:283–298.
Zhang C, Gao GR, Lv CG, Zhang BL, Zhang ZL, Zhang XF. 2012. Proteaseactivated receptor-2
induces expression of vascular endothelial growth factor and cyclooxygenase-2 via the
mitogen-activated protein kinase pathway in gastric cancer cells. Oncol Rep 28:1917–1923.
Plasmin terlibat dalam peradangan melalui protease-
activated reseptor-1 pada pulpa gigi manusia

Abstrak

Plasmin adalah enzim proteolitik yang diproduksi dari plasminogen oleh aktivator plasminogen.
Kami menyelidiki fungsi plasmin pada sel-sel fibroblast pada pulpa gigi manusia. Plasmin
menginduksi peningkatan konsentrasi Ca2 + intraselular ([Ca2 +] i) dalam konsentrasi dengan cara
yang independen. Ekspresi mRNA untuk protease-activated reseptor (PAR-1) telah terdeteksi,
dan PAR-1 mengaktifkan peptida SFLLRN yang menginduksi peningkatan [Ca2 +] i pada sel.
Peningkatan [Ca2 +] yang disebabkan plasmin dihambat pada kemunculan PAR-1 antagonis
SCH79797. Plasmin merangsang ekspresi mRNA interleukin-8 (IL-8) dan pelepasan
prostaglandin E2, yang terlibat dalam peradangan. Efek dari plasmin pada ekspresi pelepasan
mRNA IL-8 dan pelepasan prostaglandin E2 dihambat di hadapan Antagonis PAR-1 SCH79797.
Hasil ini menunjukkan bahwa plasmin mengaktifkan PAR-1 dan terlibat dalam peradangan pada
pulpa gigi manusia.

1. Perkenalan

Plasmin adalah enzim proteolitik yang diproduksi dari plasminogen oleh aktivator plasminogen
(PA). Sudah diketahui bahwa plasmin mencerna benang fibrin dan zat lainnya dalam darah,
seperti fibrinogen, Faktor V dan protrombin, menyebabkan hipokoagulabilitas darah. Selain itu,
plasmin dianggap terlibat dalam penyembuhan luka, remodeling jaringan, angiogenesis dan
proliferasi sel, karena plasmin mampu mengaktifkan matriks laten metaloprotease untuk
degradasi matriks [1,2]. Selanjutnya, plasmin telah menunjukkan dapat mengaktifkan
pensinyalan sel dan fungsinya. Pada trombosit, plasmin mengaktifkan fosfolipase C dan protein
kinase C, sehingga merangsang mobilisasi Ca2 +
dan fosforilasi protein [3]. Dalam monosit
perifer, plasmin telah terbukti menjadi chemoattractant yang poten dan spesifik melalui jalur
yang tergantung GMP siklik [4]. Di sel endotel, plasmin merangsang pelepasan arakidonat [5].
Protease-activated receptors (PARs) termasuk rumpun reseptor - Gprotein- yang ditambahkan
tujuh domain transmembran yang terdiri dari empat anggota: PAR-1, PAR-2, PAR-3 dan PAR-4
[6,7]. PAR-1, PAR-3 dan PAR-4 diaktifkan oleh trombin, sedangkan PAR-2 diketahui diaktifkan
oleh tripsin, triptase dan faktor koagulasi VIIa dan Xa, namun tidak oleh trombin. Peptidase ini
mengaktifkan PAR melalui pembelahan domain ekstraselular N-terminal, yang kemudian
memungkinkan N-terminus baru untuk berinteraksi secara distal dalam molekul yang sama untuk
mengaktifkan jalur- Gprotein- yang ditambahkan sinyal transduksi [6,7]. PARs didistribusikan
secara luas, terutama pada seluruh sistem pencernaan, dan memainkan berbagai peran fisiologis
seperti modulasi eksokrin kelenjar saliva, ekskresi lambung atau pankreas, motilitas otot polos
gastrointestinal, sitoproteksi mukosa lambung, dan penekanan nyeri viseral [8- 11]. Selain itu,
aktivasi PAR telah disarankan untuk menginduksi respon inflamasi pada sel epitel respiratori,
aktivasi PAR-1, PAR-2 dan PAR-4 merangsang pelepasan interleukin (IL) -6, IL-8 dan
prostaglandin E2, sitokin proinflammatori, yang merupakan kemokin proinflamasi dan
encosanoid masing-masing terlibat dalam peradangan[12]. Dalam fibroblas gingiva manusia,
PAR-1 merangsang produksi IL-6 [13].

Pulpa gigi berasal dari jaringan mesenkim dan terdiri dari lapisan odontoblas yang berdekatan
dengan dentin dan jaringan ikat yang imunokompeten dengan saraf dan unsur vaskular. Iritasi
mekanis, kimiawi dan mikroba pada pulpa gigi dapat memberikan respon nyeri dan inflamasi.
Penyakit pada pulpa dikaitkan dengan degradasi jaringan. Aktivitas elastinolitik dan
kolagenolitik telah dilaporkan meningkat pada pulpa gigi manusia dengan keluhan pulpitis
supuratif dan nekrosis [14]. Sitokin telah terbukti merangsang peningkatan produksi matriks
metalloproteinase [15]. Pengamatan ini menunjukkan bahwa proses peradangan di pulpa gigi
mirip dengan jaringan lain.

Seperti halnya peradangan pada jaringan lain [1,2], sistem PA /plasmin dianggap berperan
penting dalam pulpitis, mendorong penyakit pulpa lebih lanjut, karena sitokin proinflamasi
seperti TNF-α dan IL-1α merangsang sintesis jaringan tipe PA (tPA) dan melepaskannya pada sel
pulpa gigi manusia [16,17]. Baru-baru ini, kami juga melaporkan IL-1β menstimulasi ekspresi
mRNA untuk tipe urokinase PA (uPA) dan pelepasan uPA pada sel pulpa gigi manusia [18].
Namun, fungsi plasmin belum dipahami dengan baik. Di Penelitian ini, kami menunjukkan
bahwa plasmin mengaktifkan PAR-1 dan akibatnya merangsang respons inflamasi di sel-sel
pulpa gigi manusia.

2. Material dan metode

2.1. Material

Serum calf fetal (FCS), minimal esensial medium (α-MEM), fungizone dan tripsin diperoleh dari
GIBCO BRL Life Technologies (Tokyo, Jepang). Penisilin G dan kanamisin berasal dari Meiji
Seika (Tokyo, Jepang). Fura-2 / AM dibeli dari Dojindo Labs (Tokyo, Jepang). Plasmin manusia
(rekombinan,>95% murni) dibeli dari Calbiochem (Darmstadt, Jerman). PAR-agonis peptida
SFLLRN, SLIGKV, TFRGAP, GYPGQV diperoleh dari Bachem AG (Bubendorf, Swiss). N3-
Cyclopropyl-7 - {[4- (1-methylethyl) fenil] metil} - 7H-pyrrolo [3,2-f] qinazolin-1,3-diamina
(SCH79797) dibeli dari Tocris Bioscience (Ellisville, MI). Trombin manusia diperoleh dari
Haematologic Technologies Inc. (Essex Junction, VT). Kit enzim immunoassai prostaglandin E2
berasal dari Cayman Chemical Co. (Ann Arbor, MI).

2.2 Kultur Sel

Pada sel pulpa gigi manusia (fibroblas) yang diperoleh dari molar ketiga yang diekstraksi di
bawah kondisi aseptik dari pasien berusia 20 tahun yang melakukan perawatan ortodontik.
Pasien diberikan informed consent sebelum memberikan sampel. Setelah diekstraksi, jaringan
dipotong, ditempatkan pada sajian kultur jaringan 35 mm, dan ditutup dengan penutup kaca yang
disterilkan. α-MEM dilengkapi dengan 10% FCS dan antibiotik (20 U / ml penisilin G,
kanamisin 100 mg / ml, 250 ng / ml fungizone) yang digunakan sebagai kultur. Begitu
pertumbuhan sel dari eksplan telah bertemu, sel-selnya dilepas dengan 0,05% trypsin dalam
buffer garam fosfat dan disubkultur dalam labu kultur. Untuk percobaan, sel dari bagian 6-9
dilapiskan pada medium 2 X 105 sel / ml. Studi ini disetujui oleh komite etik Nihon University
School of Dentistry di Matsudo (No. EC02-078).
2.3 Mengukur konsentrasi Ca2+ intraseluler

Sel-sel pulpa gigi manusia (1 X 105) dibiakkan pada pelat kaca tipis, melingkar, berukuran 13,5
mm dalam α-MEM yang mengandung 10% FCS. Sel Confluent diinkubasi dengan 2 µM fura-2 /
AM dalam α- MEM selama 30 menit pada suhu 37 ℃ . Setelah dimuati fura-2 / AM, piringan
gelas dengan attached cell dicuci dua kali dan dimasukkan ke dalam kuvet kuarsa yang
mengandung larutan Krebs-Ringer-Hepes [120mM NaCl, 5 mM KCl, 1mM MgSO4, 0,96 mM
NaH2PO4, 0,2% glukosa, 0,1% serum bovine albumin, 1mM CaCl2, dan 20mM Hepes (pH 7,4)]
untuk penentuan Ca2 + intraselular. Fluoresensi sel yang dimuati –fura-2 diukur dengan sebuah
spektrofluorometer CAF-110 (Nihon Bunkou, Jepang) dengan excitationat 340 nm dan 380 nm
dan emisi pada 500 nm. [Ca2 +]i dihitung dari rasio intensitas fluoresensi [19].

2.4 RT-PCR

Sel-sel pulpa gigi manusia (1 X 106) dikultur dalam jaringan kultur (10 cm) dalam α-MEM yang
mengandung 10% FCS. Ketika sel-sel itu konfluen, mereka diinkubasi dalam α-MEM
mengandung FCS 1% selama 24 jam. Ketika efek plasmin pada Ekspresi mRNA IL-8 diperiksa,
sel lebih jauh diinkubasi dalam 1% FCS α-MEM selama 1 jam dengan atau tanpa plasmin. Total
RNA seluler diekstraksi dari sel dengan menggunakan RNeasy mini kit (QIAGEN®). Prosedur
untuk isolasi RNA sesuai dengan protokol yang diterapkan pada RNeasy mini kit. Sintesis cDNA
dan amplifikasi oleh RT-PCR dilakukan dengan menggunakan kit One-Step RT-PCR. Untuk
campuran PCR menggunakan, RNA (100 ng) dan primer oligonukleotida (500 nM). Primer PCR
untuk PAR-1, PAR-2, PAR-3, PAR-4, IL- 8 dan gliseraldehida-3-fosfat dehidrogenase (GAPDH)
dirancang dengan mengacu pada urutan yang dilaporkan, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1
[20,21]. Sistem PCR GeneAmp 9600 (PerkinElmer) diprogram untuk sintesis cDNA, dan
prosedurnya melibatkan pra-denaturasi selama 30 menit pada suhu 95 ℃ , diikuti 22 siklus
denaturasi termal selama 30 detik pada suhu 94 ℃ , pelepasan primer selama 30 detik pada
suhu 55 ℃ , perpanjangan rantai untuk 30 s pada suhu 72 ℃ , dan perpanjangan akhir
selama 10 menit pada suhu 72 ℃ . Fragmen PCR dielektroforesis pada gel agarosa 2,0% dan
kemudian diwarnai dengan etidium bromida.
2.5 Menentukan prostaglandin E2

Sel (5 X 104) dilapisi di piring 24-lubang di α-MEM yang mengandung 10% FCS. Sel pada tahap
konfluen diinkubasi dalam α-MEM yang mengandung FCS 1% selama 24 jam, dan distimulasi
dengan plasmin atau SFLLRN selama 10 menit. Konsentrasi prostaglandin E2 dalam medium
kultur diukur dengan menggunakan EIA Kit sesuai petunjuk pabrik.
Tabel 1 – Primer untuk RT-PCR
Nama gen Primer Ukuran Produk (bp)

2.6 Analisis statistik

Hasilnya disajikan sebagai ± S.E. untuk jumlah percobaan ditunjukkan. Uji Tukey dilakukan
untuk analisis statistik.

3. Hasil
3.1 Plasmin menginduksi mobilisasi Ca2+

Plasmin telah dilaporkan dapat menginduksi mobilisasi Ca2 + di trombosit [3,22] dan sel endotel
kapiler otak [23]. Oleh karena itu, pertama-tama kami memeriksa apakah plasmin menginduksi
mobilisasi Ca2 + di sel-sel pulpa gigi manusia. Seperti Gambar 1A menunjukkan, plasmin (200
nM) menginduksi peningkatan intraseluler Konsentrasi Ca2 +
([Ca2 +]i) pada sel pulpa gigi
manusia yang dimuati fura-2. [Ca2+]i mulai meningkat pada 30 detik setelah stimulasi dengan
plasmin, secara bertahap mencapai tingkat puncak pada 90 detik, dan kemudian menurun ke
tingkat yang mantap. Gambar 1B merangkum
tingkat puncak pada [Ca2 +]i yang disebabkan oleh berbagai konsentrasi plasmin. Kenaikan [Ca2
+
]i yang diinduksi oleh plasmin (10 - 200 nM) pada sel-sel pulpa gigi manusia tergantung
konsentrasi.
3.2 Pengaruh PAR peptida pada mobilisasi Ca2+ pada sel pulpa gigi manusia

Telah dilaporkan bahwa peningkatan [Ca2 +]i oleh plasmin disebabkan oleh aktivasi PAR [22,23],
dan sel pulpa gigi manusia mengekspresikan PAR [24,25]. Karena itu, kami selanjutnya
memeriksa efek PAR-yang mengaktifkan peptida pada mobilisasi Ca2 +
di sel-sel pulpa gigi
manusia. Diketahui bahwa terdapat 4 subtipe PAR yaitu: PAR-1, PAR-2, PAR-3 dan PAR-4
[6,7]. Ketika sel dimuati fura-2 dirangsang dengan PAR yang mengaktifkan peptida, SFLLRN
(100 µM), yang mengaktifkan PAR-1, jelas dapat menginduksi peningkatan pada [Ca 2 +]i ,
sedangkan SLIGKV (100 µM), TFRGAP (100 µM) dan GYPGQV (100 µM), yang masing-
masing mengaktifkan PAR-2, PAR-3 dan PAR-4, tidak memiliki atau memiliki efek lemah pada
[Ca2 +]i, seperti yang ditunjukkan pada Gambar 2A. Gambar 2B merangkum respon konsentrasi
pada puncak kurva [Ca2 +]i yang diinduksi oleh PAR- yang mengaktifkan peptida. SFLLRN (1-
100 µM) menyebabkan kenaikan konsentrasi pada [Ca2 +]i , dan respon maksimal diperoleh pada
100 µM, sedangkan peptida yang mengaktifkan PAR-2, PAR-3 dan PAR-4 gagal menginduksi
peningkatan secara meyeluruh pada [Ca2 +]i . Hasil ini menunjukkan bahwa sel-sel pulpa gigi
manusia mengekspresikan PAR 1.

3.3 Analisis RT- PCR pada subtipe PAR di sel pulpa gigi manusia

Untuk mengkonfirmasi ekspresi mRNA untuk PAR pada sel pulpa gigi manusia, analisis RT-PCR
dilakukan dengan menggunakan primer untuk setiap subtipe PAR. Seperti yang ditunjukkan pada
Gambar 3, ketika primer spesifik untuk mRNA PAR-1 digunakan untuk amplifikasi, satu band
dengan ukuran yang diprediksi (514 bp) terdeteksi pada kekuatan yang tinggi. Band dari produk
PCR juga terdeteksi dengan menggunakan primer untuk mRNA PAR-2 dan PAR-4, tapi lebih
lemah dari band mRNA PAR-1. Tidak ada produk PCR yang ditemukan untuk mRNA PAR-3.
Hasil ini menunjukkan bahwa PAR-1 adalah PAR subtipe dominan yang berfungsi pada sel pulpa
gigi manusia.
 Gambar 2 – Efek PAR yang mengaktifkan peptida pada [Ca 2+] i. (A) Mobilisasi Ca2+yang diinduksi oleh PAR yang mengaktifkan peptida pada fura-2-
dimuat pada sel-sel pulpa gigi manusia. SFLLRN (100 µM), SLIGKV (100 µM), TFRGAP (100 µM) atau GYPGQV (100 µM), PAR-1, PAR-2, PAR-3 dan
PAR-4 pengaktif peptida masing-masing ditambahkan ke medium pada saat ditunjukkan oleh panah. Ini Hasilnya mewakili 3-6 percobaan independen. (B)
Efek konsentrasi dari PAR yang mengaktifasi peptida. Sel pulpa gigi manusia yang dimuati Fura-2 dirangsang dengan berbagai konsentrasi PAR yang
mangaktifasi peptida, SFLLRN (lingkaran tertutup), SLIGKV (kotak tertutup), TFRGAP (lingkaran terbuka) dan GYPGQV (segitiga terbuka). Tingkat
kontrol dikurangi dari tingkat puncak yang diinduksi oleh peptida. Nilai merupakan sarana W S.E.M. untuk 3 eksperimen independen. ** P <0,01.

3.4 Penghambatan plasmin yang menginduksi mobilisasi Ca2+ oleh antagonis PAR-1

Selanjutnya kami menguji efek antagonis PAR-1 pada mobilisasi Ca 2+ di sel-sel pulpa gigi
manusia. SCH79797 poten dan antagonis PAR-1 selektif, berlawanan dengan trombin- ligan
yang diikatkan [26]. Sel diperlakukan dengan SCH79797 (20 µM) selama 10 menit, peningkatan
[Ca2 +]i diinduksi oleh PAR-1 yang mengaktifkan peptida SFLLRN (100 µM) atau PAR agonis α-
trombin (20 nM) jelas telah dihambat (Tabel 2). Di sel yang diperlakukan dengan SCH79797,
plasmin (100 nM) juga gagal menginduksi kenaikan [Ca 2 +]i, seperti yang ditunjukkan pada Tabel
2. SCH79797 tidak berpengaruh pada basal [Ca2 +]i (data tidak ditunjukkan). Pengamatan ini
sangat menunjukkan bahwa efek plasmin berhubungan dengan aktivasi PAR-1.
Gambar 3 - Ekspresi mRNA PAR pada sel pulpa gigi manusia. RT-PCR
dilakukan dengan menggunakan primer yang spesifik pada setiap
jenis PAR, seperti yang dijelaskan pada Bagian 2. Produk PCR
menjadi subjek elektroforesis melalui 2% gel agarose dan kemudian
diwarnai dengan etidium bromida. Panel bawah menunjukkan
tingkat mRNA GAPDH sebagai kontrol. Hasil ini mewakili 3
percobaan independen

3.5 Plasmin menginduksi ekspresi mRNA IL-8 dan pelepasan prostaglandin E 2 yang
berhubungan dengan aktivasi PAR-1

Kami selanjutnya memeriksa apakah plasmin terlibat dalam peradangan di pulpa gigi manusia.
Gambar 4 menunjukkan efek plasmin dan SFLLRN pada ekspresi mRNA untuk proinflamasi
kemokin IL-8 pada sel-sel pulpa gigi manusia. Saat sel dirangsang dengan plasmin (100 nM) dan
SFLLRN (100 µM) selama 1 jam, ekspresi IL-8 mRNA sangat meningkat. Namun, pada
kemunculan antagonis PAR-1 SCH79797 (2 µM), ekspresi mRNA IL-8 yang diinduksi plasmin
atau SFLLRN berkurang. Pengamatan ini menunjukkan bahwa plasmin menginduksi ekspresi
mRNA IL-8 yang bergabung pada aktivasi PAR-1 di sel-sel pulpa gigi manusia.
Selanjutnya kami menyelidiki efek aktivasi PAR-1 pada pelepasan prostaglandin E2, merupakan
eicosanoid yang terlibat dalam peradangan, pada sel-sel pulpa gigi manusia. Seperti yang
ditunjukkan pada Tabel 3, ketika sel dirangsang dengan plasmin (100 nM) atau SFLLRN (100
µM) selama 10 menit, pelepasan prostaglandin E2 jelas meningkat. Namun, seperti plasmin atau
SFLLRN yang menginduksi pelepasan prostaglandin E 2 sangat berkurang dengan kehadiran
SCH79797 (2 µM). Hasil ini sangat menunjukkan bahwa plasmin berfungsi sebagai faktor
inflamasi melalui PAR-1 aktivasi pada pulpa gigi manusia.
 Tabel 2- efek inhibitor PAR-1 antagonis pada plasmin-, SFLLRN- dan α-
thrombin yang menginduksi peningkatan [Ca2+]i

Setelah pretreatment dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 atau 20 µM) selama

10 menit, sel-sel dirangsang dengan plasmin (100 nM), PAR-1 yang mengaktifkan
peptida SFLLRN (100 µM) atau PAR agonis α-trombin (20 nM). Rasio penghambat
dinyatakan sebagai persentase dari kontrol (peningkatan plasmin-, SFLLRN-atau
thrombin yang menginduksi [Ca2+]I dengan tidak adanya antagonis). Nilai
merupakan rata-rata ±S.E.M. untuk 3 eksperimen independen.

** P <0,01

Gambar 4 - Plasmin dan SFLLRN yang menginduksi ekspresi mRNA IL-8

dengan tidak adanya atau adanya PAR-1 antagonis. Setelah perawatan
tanpa atau dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 µM) selama 30 menit,
Sel pulpa gigi manusia distimulasi dengan 100 nM plasmin atau 100 µM
SFLLRN selama 1 jam, dan kemudian RNA total mereka dijadikan subjek
RT-PCR. Produk PCR dikenai elektroforesis melalui 2% gel agarose dan
kemudian diwarnai dengan etidium bromida. Panel yang lebih rendah
menunjukkan tingkat mRNA GAPDH sebagai kontrol. Hasil ini mewakili 6
independen percobaan.
 Tabel 3- Plasmin- dan SFLLRN- menginduksi pelepasan Prostagladin E2
pada atau tidaknya PAR-1 antagonis

Setelah perawatan tanpa atau dengan PAR-1 antagonis SCH79797 (2 µM) selama 10 menit,
sel-sel pulpa gigi manusia dirangsang dengan 100 µM plasmin atau 100 µM SFLLRN selama 10
menit. Prostaglandin E2 dilepaskan ke medium terkondisi yang ditentukan dengan
menggunakan EIA Kit. Hasilnya mewakili 4 eksperimen independen.

** P <0,01.

4. Diskusi

Dalam penelitian ini, kami menunjukkan bahwa plasmin berfungsi di sel-sel pulpa gigi manusia.
Plasmin dihasilkan dari plasminogen oleh aksi PA. Dua jenis PA, tPA dan uPA, diekspresikan
oleh berbagai jaringan. Meski keduanya mengaktifkan plasminogen, tPA merupakan primer yang
terlibat dalam fibrinolisis karena memiliki afinitas tinggi untuk fibrin dan ekstraselular matriks,
sedangkan uPA mendukung kemotaksis sel inflamasi dan proliferasi melalui interaksi dengan
permukaan reseptor sel yang memiliki afinitas tinggi (uPAR) [27,28]. Di sel-sel pulpa gigi
manusia, telah dilaporkan bahwa TNF-α dan IL-1α menginduksi sintesis tPA dan sekresinya
[16,17] dan IL-1β menginduksi sintesis uPA dan sekresinya [18]. Oleh karena itu, plasmin
kemungkinan diproduksi oleh sekresi PA dari sel yang distimulasi dengan sitokin inflamasi ini.
Pada sel pulpa gigi manusia, plasmin menstimulasi ekspresi IL-8 mRNA dan pelepasan
prostaglandin E2. IL-8 adalah anggota rumpun kemokin dan diproduksi oleh berbagai jenis sel
seperti monosit, makrofag dan fibroblas [29]. Kemokin ini terutama memediasi aktivasi dan
migrasi neutrofil dari darah tepi ke dalam jaringan dan terlibat dalam inisiasi dan amplifikasi
proses inflamasi sebagai respons terhadap berbagai macam patogen [29]. Oleh karena itu, bisa
dibayangkan bahwa IL-8 berperan penting dalam peradangan pada pulpa gigi manusia. Di Di sisi
lain, prostaglandin E2 merupakan anggota dari rumpun eicosanoid dan merupakan mediator
utama peradangan berbagai penyakit [30]. Pulpa gigi manusia yang mengalami inflamasi telah
dilaporkan mengandung kadar prostaglandin yang tinggi, termasuk prostaglandin E 2, bila
dibandingkan dengan pulpa yang asimtomatik [31]. Mediator kimia bradikinin dan sitokin
inflamasi TNF-α dan IL-1β merangsang produksi prostaglandin E 2 pada sel pulpa gigi manusia
[32,33]. TNF-α dan IL-1β juga menginduksi ekspresi gen siklooksigenase, enzim yang
bertanggung jawab memproduksi prostaglandin, di sel-sel pulpa gigi [34]. Pengamatan ini
menunjukkan bahwa prostaglandin E2 penting dalam proses peradangan pulpa. Oleh karena itu,
efek dari plasmin yang kami tunjukkan dalam penelitian ini menunjukkan bahwa plasmin terlibat
dalam proses peradangan pada pulpa gigi.
Kami juga menunjukkan bahwa efek plasmin pada ekspresi mRNA IL-8 dan pelepasan
prostaglandin E2 yang digabungkan ke aktivasi PAR-1. Sejauh ini, 4 jenis PAR, PAR-1, PAR-2,
PAR-3 dan PAR-4, telah ditemukan dan dikloning [6,7]. Sebelumnya, telah dilaporkan bahwa
mRNA PAR-1 dan PAR-3 terdeteksi terutama di sel-sel fibroblas pulpa manusia [24], sedangkan
penelitian lain menemukan bahwa sel-sel ini hanya mengekspresikan mRNA PAR-2 [25]. Dalam
penelitian ini, mRNA PAR-1 ditemukan untuk diekspresikan secara dominan. Selanjutnya, di
antara PAR yang mengaktivasi peptida, SFLLRN, yang mengaktifkan PAR-1, jelas menginduksi
kenaikan dosis pada [Ca2 +]i. Selain itu, Peningkatan SFLLRN pada [Ca2 +]i dihambat oleh PAR-1
antagonis SCH79797. Pengamatan ini sangat menunjukkan bahwa PAR-1 diekspresikan dan
berfungsi dalam sel fibroblas pulpa gigi manusia, meski alasan perbedaan ekspresi PAR belum
jelas. Meski sel-sel pulpa gigi yang digunakan dalam percobaan ini kaya fibroblas, sel kultur
mungkin mengandung jenis sel lain seperti sel progenitor odontoblas, karena sel-sel pulpa gigi
yang diisolasi telah dilaporkan akan diinduksi untuk membedakan sel odontoblas dan
menghasilkan struktur dentin-mineral secara in vitro [35,36]. Oleh karena itu, perbedaan ekspresi
PARs tampaknya disebabkan oleh adanya berbagai jenis sel.
PAR-1 telah diketahui akan diaktifkan dengan pembelahan ikatan peptida arginin-41/serine-42
yang berada di dalam exodomain oleh trombin [37]. Plasmin langsung membelah dan
mengaktifkan reseptor yang mirip dengan trombin [38,39]. Hal ini juga menunjukkan bahwa
plasmin menginduksi ekspresi gen dan mitogenesis pada fibroblas [40,41], sekresi elastase pada
makrofag [42], dan migrasi sel ovarium yang mengekspresikan integrin rekombinan pada
hamster cina [43] melalui aktivasi PAR-1. Demikian pula ekspresi mRNA IL-8 yang diinduksi
plasmin dan pelepasan prostaglandin E2 yang dihambat oleh PAR-1 inhibitor, menunjukkan
behwa aktivasi PAR-1 penting untuk efek plasmin pada sel-sel pulpa gigi manusia. Diambil
bersamaan dengan data sebelumnya, hasil ini menunjukkan plasmin terlibat dalam proses
inflamasi melalui aktivasi PAR-1 pada pulpa gigi manusia.

Ucapan terima kasih

Studi ini didukung sebagian oleh Grants- in- Aid untuk penelitian Ilmiah dari JSPS (# 17592001,
# 19592212) dan Nihon University Research Grant untuk tahun 2007.

Referensi

[1] Wun TC. Plasminogen activation: biochemistry, physiology, and therapeutics. Crit Rev
Biotechnol 1988;8:131–48.
[2] Carmeliet P, Collen D. Development and disease in proteinase-deficient mice: role of the
plasminogen, matrix metalloproteinase and coagulation system. Thromb Res
1998;91:255–85.
[3] Schafer AI, Maas AK, Ware JA, Johnson PC, Rittenhouse SE, Salzman EW. Platelet protein
phosphorylation, elevation of cytosolic calcium, and inositol phospholipid breakdown in platelet
activation induced by plasmin. J Clin Invest 1986;78:73–9.
[4] Syrovets T, Tippler B, Rieks M, Simmet T. Plasmin is a potent and specific chemoattractant
for human peripheral monocytes acting via a cyclic guanosine monophosphatedependent
pathway. Blood 1997;89:4574–83.
[5] Chang WC, Shi GY, Chow YH, Chang LC, Hau JS, Lin MT, et al. Human plasmin induces a
receptor-mediated arachidonate release coupled with G proteins in endothelial cells. Am J
Physiol 1993;264:C271–81.
[6] Coughlin SR. Thrombin signalling and protease-activated receptors. Nature 2000;407:258–
64.
[7] Trejo J. Protease-activated receptors: new concepts in regulation of G protein-coupled
receptor signaling and trafficking. J Pharmacol Exp Ther 2003;307:437–42.
[8] Kawabata A, Morimoto N, Nishikawa H, Kuroda R, Oda Y, Kakehi K. Activation of
protease-activated receptor-2 (PAR-2) triggers mucin secretion in the rat sublingual gland.
Biochem Biophys Res Commun 2000;270: 298–302.
[9] Kawabata A, Kinoshita M, Nishikawa H, Kuroda R, Nishida M, Araki H, et al. The protease-
activated receptor-2 agonist induces gastric mucus secretion and mucosal cytoprotection. J Clin
Invest 2001;107:1443–50.

[10] Kawabata A, Kuroda R, Nishida M, Nagata N, Sakaguchi Y, Kawao N, et al. Protease-

activated receptor-2 (PAR-2) in the pancreas and parotid gland: Immunolocalization and
involvement of nitric oxide in the evoked amylase secretion. Life Sci 2002;71:2435–46.
[11] Kawabata A. Gastrointestinal functions of proteinase activated receptors. Life Sci
2003;74:247–54.
[12] Asokananthan N, Graham PT, Fink J, Knight DA, Bakker AJ, McWilliam AS, et al.
Activation of protease-activated receptor (PAR)-1, PAR-2, and PAR-4 stimulates IL-6, IL-8, and
prostaglandin E2 release from human respiratory epithelial cells. J Immunol 2002;168:3577–85.
[13] Tanaka N, Morita T, Nezu A, Tanimura A, Mizoguchi I, Tojyo Y. Signaling mechanisms
involved in proteaseactivated receptor-1-mediated interleukin-6 production by human gingival
fibroblasts. J Pharmacol Exp Ther 2004;311:778–86.
[14] Morand MA, Schilder H, Blondin J, Stone PJ, Franzblau C. Collagenolytic and elastinolytic
activities from diseased human dental pulps. J Endodont 1981;7:156–60.
[15] O’Boskey Jr FJ, Panagakos FS. Cytokines stimulate matrix metalloproteinase production by
human pulp cells during long-term culture. J Endodont 1998;24:7–10.
[16] Ueda I, Matsushima K. Stimulation of plasminogen activator activity and matrix
metalloproteinases of human dental pulp-derived cells by tumor necrosis factor-a. J Endodont
2001;27:175–9.
[17] Chang YC, Yang SF, Huang FM, Liu CM, Tai KW, Hsieh YS. Induction of tissue
plasminogen activator gene expression by proinflammatory of cytokines in human pulp and
gingival fibroblasts. J Endodont 2003;29:114–7.
[18] Kamio N, Hashizume H, Nakao S, Matsushima K, Sugiya H. IL-1b stimulates urokinase-
type plasminogen activator expression and secretion in human dental pulp cells. Biomed Res
2007;28:315 22.
[19] Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly
improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985;260:3440–50.
[20] Tanaka N, Morita T, Nezu A, Tanimura A, Mizoguchi I, Tojyo Y. Thrombin-induced Ca2+
mobilization in human gingival fibroblasts is mediated by protease-activated receptor-1 (PAR-1).
Life Sci 2003;73:301–10.
[21] Yumoto H, Nakae H, Fujinaka K, Ebisu S, Matsuo T. Interleukin-6 (IL-6) and IL-8 are
induced in human oral epithelial cells in response to exposure to periodontipathic Eikenella
corrodens. Infect Immun 1999;67:384–94.
[22] Nakamura K, Kimura M, Fenton Jr JW, Andersen TT, Aviv A. Duality of plasmin effect on
cytosolic free calcium in human platelets. Am J Physiol 1995;268:C958–67.
[23] Bartha K, Do¨mo¨ to¨ r E, Lanza F, Adam-Vizi V, Machovich R. Identification of thrombin
receptors in rat brain capillary endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab 2000;20: 175–82.
[24] Gruber R, Jindra C, Kandler B, Watzak G, Fischer MB, Watzek G. Proliferation of dental
pulp fibroblasts in response to thrombin involves mitogen-activated protein kinase signalling. Int
Endodont J 2004;37:145–50.
[25] Tancharoen S, Sarker KP, Imamura T, Biswas KK, Matsushita K, Tatsuyama S, et al.
Neuropeptide release from dental pulp cells by RgpB via proteinase-activated receptor-2
signaling. J Immunol 2005;174:5796–804.
[26] Ahn H-S, Foster C, Boykow G, Stamford A, Manna M, Graziano M. Inhibition of cellular
action of thrombin by N3- cyclopropyl-7- {[4-(1-methylethyl)phenyl]methyl}-7Hpyrrolo[ 3,2-
f]qinazoline-1,3-diamine (SCH79797), a nonpeptide thrombin receptor antagonist. Biochem
Pharmacol 2000;60:1425 34.
[27] Saksela O. Plasminogen activation and regulation of pericellular proteolysis. Biochim
Biophys Acta 1985;823: 35–65.
[28] Irigoyen JP, Mun˜ oz-Ca´noves P, Montero L, Koziczak M, Nagamine Y. The plasminogen
activator system: biology and regulation. Cell Mol Life Sci 1999;56:104–32.
[29] Harada A, Sekido N, Akahoshi T, Wada T, Mukaida N, Matsushima K. Essential
involvement of interleukin-8 (IL8) in acute inflammation. J Leukoc Biol 1994;56:559–64.
[30] Park JY, Pillinger MH, Abramson SB. Prostaglandin E2 synthesis and secretion: The role of
PGE2 synthesis. Clin Immunol 2006;119:229–40.
[31] Cohen JS, Reader A, Fertell R, Beck FM, Meyers WJ. A radioimmunoassay determination
of the concentrations of prostaglandin E2 and F2a in painful and asymptomatic human dental
pulps. J Endodont 1985;11:330–5.
[32] Sundqvist G, Rosenquist JB, Lerner UH. Effects of bradykinin and thrombin on
prostaglandin formation, cell proliferation and collagen biosynthesis in human dentalpulp
fibroblasts. Arch Oral Biol 1995;40:247–56.
[33] Chang MC, Chen YJ, Tai MR, Li MY, Tsai YL, Lan WH, et al. Cytokine-induced
prostaglandin E2 production and cyclooxygenase-2 expression in dental pulp cells: downstream
calcium signaling via activation of prostaglandin EP receptor. Int Endodont J 2006;39: 819–26.
[34] Chang YC, Yang SF, Huang FM, Liu CM, Tai KW, Hsieh YA. Proinflammatory cytokines
induce cyclooxygenase-2 mRNA and protein expression in human dental pulp cell cultures. J
Endodont 2003;29:201–4.
[35] Tsukamoto Y, Fukutani S, Shin-Ike T, Kubota T, Sato S, Suzuki Y, et al. Mineralized nodule
formation by cultures of human dental pulp-derived fibroblasts. Arch Oral Biol 1992;37:1045–
55.
[36] About I, Botteo MJ, de Denato P, Camps J, Franquin JC, Mitsiadis TA. Human dentin
production in vitro. Exp Cell Res 2000;258:33–41.
[37] Vu TK, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR. Molecular cloning of a functional thrombin
receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation. Cell 1991;64:1057–68.
[38] Vouret-Craviari V, Grall D, Chamberd J-C, Rasmussen UB. Post-translational and activation
dependent modification of the G protein-coupled thrombin receptor. J Biol Chem 1995;8367–72.
[39] Kuliopulos A, Covie L, Seley SK, Sheridan PJ, Helin J, Costello CE. Plasmin
desensitization of the PAR1 thrombin receptor: Kinetics, sites of truncation, and implications for
thrombolytic therapy. Biochemistry 1999;38:4572–85.
[40] Pendurthi UR, Ngyuen M, Andrade-Gordon P, Petersen LC, Rao LVM. Plasmin induces
Cyr61 gene expression in fibroblasts via protease-activated receptor-1 and p44/42 mitogen-
activated protein kinase-dependent signaling pathway. Arterioscler Thromb Vasc Biol
2002;22:1421–6.
[41] Mandal SK, Rao LVM, Tran TTT, Pendurthi UR. A novel mechanism of plasmin-induced
mitogenesis in fibroblasts. J Thromb Haemost 2004;3:163–9.
[42] Raza SL, Nehring LC, Shapuro SD, Cornelius LA. Proteinaseactivated receptor-1 regulation
of macrophage elastase (MMP-12) secretion by serine proteinases. J Biol Chem 2000;52:41243–
50.
[43] Majumdar M, Tarui T, Akakura N, Ruf W, Takada Y. Plasmin-induced migration requires
signaling through protease-activated receptor 1 and integrin a9b1. J Biol Chem 2004;279:37528–
34.
RANGKUMAN

Iritasi pada pulpa dapat terjadi karena stimuli mekanik, termal, kimiawi, atau bakteri sehingga
terjadi inflamasi yang apabila terus berlanjut maka dapat menyebabkan gigi mengalami nekrosis.
Pada saat inflamasi terbentuklah sitokin proinflamasi seperti interleukin- 1β (IL- 1β),
prostaglandin, siklooksigenase (COX), dan faktor tumor nekrosis (TNF).

Plasma kalikrein atau KLKB1 adalah sebuah serin protease yang mengatur proses maturasi pada
beberapa precursor protein, menghasilkan bradikinin, dan memecah kininogen yang memiliki
berat molekul tinggi. Lalu adapula plasmin yaitu enzim proteolitik yang diproduksi dari
plasminogen. Dimana kedua enzim tersebut dapat mengaktivasi PAR (Protease- Active-
Reseptor) yang merupakan reseptor protein G dengan tujuh domain transmembran, dimana
dalam dua jurnal ini diketahui bahwa salah satu anggotanya yaitu PAR-1 lebih teraktivasi karena
KLKB1 dan plasmin memobilisasi Ca2+ .

PAR-1 yang teraktivasi ini lalu akan menstimulasi ekspresi IL-8 dan melepaskan PGE2 yang
merupakan faktor proinflamasi. PAR-1 dapat dihambat denga PAR-1 antagonis SCH79797.