BAB II

TINJAUAN PUSTAKA
II.1.1 Pengertian Spektrofotometri
Metode pengukuran menggunakan prinsip spektrofotometri adalah
berdasarkan absorpsi cahaya pada panjang gelombang tertentu melalui
suatu larutan yang mengandung kontaminan yang akan ditentukan
konsentrasinya. Proses ini disebut “absorpsi spektrofotometri”, dan jika
panjang gelombang yang digunakan adalah gelombang cahaya tampak,
maka disebut sebagai “kolorimetri”, karena memberikan warna. Selain
gelombang cahaya tampak, spektrofotometri juga menggunakan panjang
gelombang pada gelombang ultraviolet dan infra merah. Prinsip kerja dari
metode ini adalah jumlah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sebanding
dengan konsentrasi kontaminan dalam larutan (Lestari, 2010). Dalam
analisis secara spektrofotometri, terdapat tiga daerah panjang gelombang
elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 – 380 nm), daerah
visible (380 – 700 nm), daerah inframerah (700 – 3000 nm) (Khopkar,
1990).
II.1.2 Prinsip Spektrofotometri
Metode Spektrofotometri Ultra-violet dan Sinar Tampak telah
banyak diterapkan untuk penetapan senyawa-senyawa organik yang
umumnya dipergunakan untuk penentuan senyawa dalam jumlah yang
sangat kecil. Prinsip kerjanya berdasarkan penyerapan cahaya atau energi
radiasi yang diserap memungkinkan pengukuran jumlah zat penyerap
dalam larutan secara kuantitatif. Metode Spektrofotometri Ultra-violet dan
Sinar Tampak berdasarkan pada hukum Lambert-Beer (Triyati, 1985).
1. Spektrofotometer
Menurut Cairns (2009), spektrofotometer adalah alat untuk
mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi
panjang gelombang. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang
gelombang tertentu tergantung pada senyawaan atau warna terbentuk.
Secara garis besar spektrofotometer terdiri dari 4 bagian penting yaitu:
 a. Sumber Cahaya
Sebagai sumber cahaya pada spektrofotometer, haruslah
memiliki pancaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.
Sumber energi cahaya yang biasa untuk daerah tampak, ultraviolet
dekat, dan inframerah dekat adalah sebuah lampu pijar dengan kawat
rambut terbuat dari wolfram (tungsten). Lampu ini mirip dengan bola
lampu pijar biasa, daerah panjang gelombang 350 – 2200 nanometer
(nm).
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang berfungsi untuk menguraikan
cahaya polikromatis menjadi beberapa komponen panjang
gelombang tertentu (monokromatis) yang bebeda (terdispersi).
c. Cuvet
Cuvet spektrofotometer adalah suatu alat yang digunakan
sebagai tempat contoh atau cuplikan yang akan dianalisis. Cuvet
biasanya terbuat dari kwars, plexiglass, kaca, plastik dengan bentuk
tabung empat persegi panjang 1 x 1 cm dan tinggi 5 cm. Pada
pengukuran di daerah UV dipakai cuvet kwarsa atau plexiglass,
sedangkan cuvet dari kaca tidak dapat dipakai sebab kaca
mengabsorbsi sinar UV. Semua macam cuvet dapat dipakai untuk
pengukuran di daerah sinar tampak (visible).
d. Detektor
Peranan detektor penerima adalah memberikan respon terhadap
cahaya pada berbagai panjang gelombang. Detektor akan mengubah
cahaya menjadi sinyal listrik yang selanjutnya akan ditampilkan oleh
penampil data dalam bentuk jarum penunjuk atau angka digital.
II.1.3 Prinsip Kerja Alat Spektrofotometer
Monokromator menguraikan sinar yang masuk dari sumber cahaya
tersebut menjadi pita-pita panjang gelombang yang diinginkan untuk
pengukuran suatu zat tertentu, dan setiap gugus kromofor mempunyai
panjang gelombang maksimum yang berbeda. Dari monokromator tadi,
cahaya atau energi radiasi diteruskan dan diserap oleh suatu larutan yang
akan diperiksa di dalam kuvet. Jumlah cahaya yang diserap oleh larutan
akan menghasilkan sinyal elektrik pada detektor, yang mana sinyal
elektrik ini sebanding dengan cahaya yang diserap oleh larutan tersebut.
Besarnya sinyal elektrik yang dialirkan ke pencatat dapat dilihat sebagai
angka (Triyati, 1985).
Sel absorpsi dipakai dari bahan silika, kuvet dan plastik banyak
dipakai untuk daerah Sinar Tampak. Kualitas data absorbans sangat
tergantung pada cara pemakaian dan pemeliharaan sel. Sidik jari, lemak
atau pengendapan zat pengotor pada dinding sel akan mengurangi
transmisi. Jadi sel-sel itu harus bersih sekali sebelum dipakai (Skoog dan
West, 1971).
1. Jenis Spektrofotometer
Jenis-jenis spektrofotometer berdasarlam pada daerah spektrum
yang akan dieksporasi terdiri dari spektrofotometer sinar tampak (Vis)
serta gabungan spektrofotometer sinar tampak (Vis) dan ultraviolet
(UV), sedangkan berdasarkan teknik optika sinar terdiri dari
spektrofotometer optika sinar tunggal (single beam optic) dan
spektrofotometer optika sinar ganda (double beam optic). Berikut
penjabaran masing-masing jenis spektrofotometer:
a. Spektrofotometer Sinar Tampak (Vis)
Sumber cahaya yang digunakan adalah lampu tungsten
halogen. Lampu tungsten halogen menghasilkan cahaya tampak
dalam daerah panjang gelombang 350-800nm. Lampu tersebut
terbuat dari tabung kuarsa yang berisi filament tungsten dan
sejumlah kecil iodine. Spektrofotometer UV-Vis membandingkan
cuplikan standar yaitu substrat gelas preparat. Hasil pengukuran
dari spektrofotometer UV-Vis menunjukkan kurva hubungan
transmitan dan panjang gelombang (Basset, 1994).
 b. Spektrofotometer Sinar Tampak (Vis) dan Ultraviolet (UV)
Sumber cahaya yang digunakan adalah kombinasi antara
lampu tungsten halogen dan lampu deuterium (D2). Lampu
deuterium (D2) dapat menghasilkan cahaya dalam daerah 160–
380nm.
c. Spektrofotometer Optika Sinar Tunggal (Single Beam Optic)
Semua cahaya melewati seluruh sel sampel. Contoh alat
spektrofotometer single beam adalah spektronik 20. Alat ini
merupakan desain paling awal tetapi masih banyak digunakan baik
dalam pengajaran maupun laboratorium industri. Panjang
gelombang paling rendah adalah 190 sampai 210 nm dan paling
tinggi adalah 800-1000nm.
d. Spektrofotometer Optika Sinar Ganda (Double Beam Optic)
Cahaya terbagi ke dalam dua arah/berkas. Berkas cahaya
pertama melewati sel pembanding, dan cahaya yang lainnya
melewati sel sampel/ Berkas cahaya kemudian bergabung kembali,
masuk ke detektor, dan detektor merespon cahaya netto dari kedua
arah. Double beam digunakan pada panjang gelombang 190-
750nm.
II.1.4 Hukum yang Mendasari Spektrofotometri
Menurut Lestari (2010), prinsip kerja dari metode spektrofotometri
ini adalah jumlah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sebanding dengan
konsentrasi kontaminan dalam larutan. Prinsip ini dijabarkan dalam
Hukum Beer-Lambert, yang menghubungkan antara absorbansi cahaya
dengan konsentrasi pada suatu bahan yang mengabsorpsi, berdasarkan
persamaan berikut:
A = log (Iin / Iout) = (1/T) = a x b x c
Keterangan:
A = Absorbance
Iin = Intensitas cahaya yang masuk
Iout = Intensitas cahaya yang keluar
 T = Transmittansi
a = tetapan absorpsivitas molar
b = panjang jalur
c = konsentrasi pada suatu bahan yang mengabsorpsi
II.1.5 Larutan Standar, Larutan Blanko, dan Larutan Cuplikan
Larutan yang akan digunakan dalam penggunaan spektrofotometer
adalah larutan blanko. Larutan blanko merupakan larutan yang tidak
mengandung analit untuk dianalisis (Basset, 1994). Larutan standar adalah
larutan yang konsentrasinya sudah diketahui secara pasti (Day dan
Underwood, 1999). Larutan cuplikan atau analit adalah larutan yang akan
dianalisis atau ditentukan konsentrasinya atau strukturnya
(Padmaningrum, 2008).
1. Pemilihan Panjang Gelombang
Panjang gelombang yang digunakan untuk analisis kuantitatif
adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal.
Ada beberapa alasan mengapa harus menggunakan panjang gelombang
maksimal, yaitu yang pertama, pada panjang gelombang maksimal
kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang
maksimal tersebut, perubahan absorbansi untuk setiap satuan
konsentrasi adalah yang paling besar. Kedua, disekitar panjang
gelombang maksimal bentuk kurva absorbansi datar dan pada kondisi
tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi. Ketiga, jika dilakukan
pengukuran ulang maka kesalahan yang disebabkan oleh pemasangan
ulang panjang gelombang akan kecil sekali, ketika digunakan panjang
gelombang maksimal (Gandjar dan Rohman, 2007).