Anda di halaman 1dari 7

PERCOBAAN 7

Isolasi dan Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR


(Polymerase Chain Reaction)
Isolation and Amplification of DNA using PCR (Polymerase Chain Reaction)
Nama : Michael Yonathan Suryana

NIM : 10514017

Kelas : 01

Kelompok :3
Email : mikesyonathan96@gmail.com

ABSTRAK
Metode PCR digunakan untuk mengisolasi dan memperbanyak fragmen DNA dari koloni tunggal.
Fragmen DNA yang digunakan yaitu 16S rDNA. Fragmen DNA diperoleh dengan cara lisis sel
bakteri dengan menggunakan pemanasan. Perbanyakan fragmen DNA telah dilakukan dengan
proses amplifikasi pada PCR dengan menggunakan dua primer oligonukleotida yakni primer maju
dan primer mundur. Fragmen dianalisis dengan metode elektroforesis. Elektroforegram
menunjukkan hasil negatif pada sampel 1 dan 2 yang diakibatkan kesalahan pada proses resuspensi
larutan DNA.

Kata kunci : PCR, 16S rDNA, primer, amplifikasi, elektroforesis

ABSTRACT
PCR method was used to isolate and copy DNA fragment from single colony. DNA fragment
which is used here is 16S rDNA. DNA fragment was obtained by bacterial cell lysis within heating
condition. DNA fragment copying was done by amplification process on PCR used two
oligonucleotide primers such as forward primer and reverse primer. Fragment was analyzed by
electrophoresis method. Electrophoregram shows negative result on sample 1 and 2 that caused by
resuspension mistake on DNA mixing.

Keywords : PCR, 16S rDNA, primer, amplification, electrophoresism


1. PENDAHULUAN primer dengan urutan komplemen
PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah pada templat. Proses ini biasanya
suatu teknik in vitro yang dapat dilakukan pada suhu 50oC – 60oC.
mengamplifikasi bagian DNA tertentu yang Selanjutnya, DNA polymerase akan
berada di antara dua bagian urutan DNA. berikatan sehingga ikatan hidrogen
Amplifikasi DNA dengan PCR dapat tersebut akan menjadi sangat kuat dan
dilakukan dengan menggunakan primer tidak akan putus kembali apabila
oligonukleotida yang biasa disebut sebagai dilakukan reaksi polimerisasi
amplimer. Primer adalah suatu molekul DNA selanjutnya, misalnya pada 72oC.
untai tunggal pendek yang berkomplemen
dengan ujung urutan DNA templat. Primer 3. Ekstensi/Pemanjangan
ini akan diperpanjang pada DNA templat Umumnya, reaksi pemanjangan
oleh suatu DNA polimerase dengan rantai terjadi pada suhu 72oC. Primer
keberadaan deoksinukleosida trifosfat yang telah menempel setelah tahap
(dNTPs) pada kondisi reaksi yang sesuai. annealing akan mengalami
Proses ini akan menghasilkan rantai DNA perpanjangan pada sisi 3’nya dengan
baru yang berkomplemen dengan rantai penambahan basa nukleotida yng
templat sehingga menghasilkan DNA untai komplemen dengan templat oleh
ganda baru. Sintesis rantai DNA baru dapat DNA polimerase. Basa nukleotida
diulang melalui proses denaturasi termal diperoleh biasanya dari dNTP di
molekul DNA untai ganda, penempelan dalam sistem PCR.
primer pada DNA, dan perpanjangan primer
oleh DNA polimerase pada temperatur yang
2. METODE PENELITIAN
sesuai dengan kerja enzim (Newton, 1997).
Tahapan PCR yaitu sbb: Alat dan Bahan
1. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai Alat : Mesin PCR, pipet mikro, tabung mikro,
ganda akan membuka menjadi dua cetakan gel agarosa, dan chamber
untai tunggal akibat terjadinya elektroforesis agarosa
pemutusan ikatan hidrogen yang Bahan: Agarosa, Buffer TAE, loading buffer
membentuk struktur untai ganda. DNA, ddH2O steril, bakteri
Pada tahap ini, seluruh reaksi enzim
tidak berjalan, misalnya reaksi Cara Kerja
polimerisasi pada siklus yang 2.1.Lisis Sel Bakteri
sebelumnya. Denaturasi biasanya ddH2O steril dipipet sebanyak 40 µL
dilakukan antara suhu 90oC – 95oC. ke dalam tabung mikro 1,5 mL.
Bakteri kemudian diinokulasikan dari
2. Annealing/Penempelan Primer cawan petri menggunakan tusuk gigi
Pada tahap penempelan primer steril ke dalam tabung yang berisi
(annealing), primer akan menuju ddH2O steril. Kemudian, campuran
daerah yang spesifik yang dididihkan selama 10 menit
komplemen dengan urutan primer. menggunakan penangas air.
Kespesifikan ini juga dibantu dengan Selanjutnya, sampel didiamkan
kehadiran ion Mg2+ saat dilakukan hingga suhu ruang. Sampel yang telah
PCR. Pada proses annealing ini, mencapai suhu ruang disentrifugasi
ikatan hidrogen akan terbentuk antara dengan kecepatan 12.000 x g selama
1 menit. Supernatan diambil dan di dalam alat elektoforesis
dipisahkan ke dalam tabung mikro (Bio-Rad®). Kemudian, kotak
steril. running diisi dengan buffer
TAE 1x hingga tanda batas.
2.2.Amplifikasi DNA dengan PCR
Campuran dipipet ke dalam tabung 2.3.2. Running Gel Agarosa
mikro 1,5 mL dengan komposisi sbb: Sampel yang akan
Tabel 1. Komposisi Campuran Reagen dielektroforesis disiapkan
Reagen 1x Reaksi 5x Reaksi dengan mencampurkan
Master larutan sampel dengan
Mix 6,25 µL 31,25 µL pemberat (bromfenol biru
Kappa 0,1% b/v + sukrosa 40% b/v)
Primer dengan perbandingan 5:1.
1,00 µL 5,00 µL Selanjutnya, dilakukan
Maju
Primer elektroforesis pada tegangan
1,00 µL 5,00 µL 70 V selama 40 menit.
Mundur
ddH2O
3,25 µL 16,25 µL 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Steril
Volume Side Directed Mutagenesis (SDM) adalah
11,50 µL 57,50 µL metode biologi molekuler yang digunakan
Total
untuk membuat perubahan yang disengaja
Kemudian dari volume total 57,5 µL dan spesifik (mutasi) pada urutan DNA milik
dipindahkan ke dalam 4 buah tabung gen. SDM dapat digunakan untuk
mikro 200 µL (tabung A, B, C, dan D) menginvestigasi struktur dan aktivitas
masing-masing dengan aliquot biologis dari DNA, RNA, dan molekul
sebanyak 11,5 µL. Ke dalam tabung protein. Oleh karena itu, SDM dapat
A dan B, ditambahkan 1 µL sampel dijadikan dasar dalam rekayasa protein. SDM
bakteri hasil lisis. Ke dalam tabung C, juga dapat berguna di dalam analisis
dimasukkan DNA templat. Tabung D
penyakit-penyakit yang berhubungan dengan
digunakan menjadi kontrol negatif.
kelainan urutan DNA.
2.3.Elektroforesis Agarosa Pada percobaan ini, DNA yang diujikan
2.3.1. Pembuatan Gel Agarosa untuk diamplifikasikan yaitu 16S rDNA. Gen
Gel Agarosa dibuat dengan 16S rDNA adalah suatu gen yang mengkode
cara melarutkan 1,5 gram
16S rDNA yang merupakan suatu komponen
agarosa ke dalam 150 mL
30S dari ribosom DNA. Untuk mengisolasi
buffer TAE 1x dengan cara
pemanasan. Setelah larut, gen 16S rDNA, dapat dilakukan
larutan didinginkan hingga pengamplifikasian urutan nukleotida gen
suhu ±50oC. Kemudian ke dengan teknik PCR. Fragmen gen 16S rDNA
dalam larutan, ditambahkan penting untuk diperbanyak dengan metode
red gel sebanyak 1 µL. PCR karena fragmen gen 16S rDNA
Selanjutnya, larutan dituang merupakan fragmen yang memiliki sejumlah
ke dalam cetakan gel dan urutan DNA yang tetap di samping sejumlah
dibiarkan hingga mengeras. urutan DNA lainnya bervariasi. Hal ini
Setelah mengeras, gel ditaruh
menjadi keuntungan tersendiri untuk PCR. Adapun jenis-jenis PCR yang sudah
keperluan penentuan pohon filogenetik. umum saat ini yaitu:
Tahap-tahap PCR secara umum dibagi 1. Real-time PCR
menjadi tiga bagian yaitu tahap denaturasi, 2. Nested PCR
annealing, dan elongasi. Tahap denaturasi 3. Multiplex PCR
berfungsi untuk memutuskan ikatan hidrogen 4. Quantitative PCR
yang terdapat di antara untai ganda heliks 5. Arbitrary Primed PCR
PCR dapat diaplikasikan pada berbagai
DNA. Tahap denaturasi dilakukan pada suhu
keperluan, di antaranya sbb:
95oC. Suhu 95oC merupakan suhu yang
dianggap optimum bagi terjadinya 1. Identifikasi dan karakterisasi
pemutusan ikatan hidrogen hingga seluruh berbagai agen infeksius
heliks DNA terbuka. 2. Penyidikjarian genetik untuk
keperluan forensik
Tahap selanjutnya yaitu tahap 3. Deteksi mutasi
annealing/penempelan primer. Tahap 4. Kloning gen
annealing dilakukan pada suhu ±48oC. Suhu 5. Sekuensing PCR
48oC merupakan suhu yang mendekati nilai
suhu leleh/melting point (Tm) bagi DNA. PCR dapat dilakukan secara berulang
Nilai Tm dapat diperoleh secara teoretis hingga puluhan siklus. Pada percobaan ini
melalui perhitungan sbb:
dilakukan sebanyak 25 siklus. Dengan
Tm = 2(A+T) + 4(G+C) jumlah siklus sebanyak 25 siklus, jumlah
fragmen DNA yang dapat diperoleh yaitu:
Suhu tahap annealing merupakan suhu
yang penting untuk dikendalikan karena bila Jumlah fragmen DNA diinginkan pada
suhu terlalu rendah dapat terjadi miss priming percobaan ini
yaitu primer gagal menempel pada DNA
= 2n siklus − 2. n siklus = 225 − 2.25
templat, namun bila suhu tahap annealing
terlalu tinggi dapat menyebabkan primer = 33.554.382
gagal menempel pada DNA templat.
Siklus PCR dapat digambarkan menurut
Tahap selanjutnya yaitu tahap elongasi gambar sbb:
yang berlangsung pada suhu 72oC. Suhu ini
merupakan suhu optimum bagi terjadinya
pemanjangan DNA karena pada suhu 72oC
tidak terjadi pemutusan ikatan hidrogen
namun cukup jauh dengan suhu pada tahap
penempelan primer.
PCR sendiri saat ini telah dikembangkan
menjadi beberapa jenis karena adanya
Gambar 1. Siklus PCR
kebutuhan lebih lanjut dan khusus untuk
keperluan analisis tertentu menggunakan
Selama siklus PCR berlangsung, terjadi menyebabkan arah transkripsi mundur.
perbanyakan fragmen DNA. Skema Primer mundur menempel pada sense DNA.
perbanyakan fragmen DNA yaitu sbb: Kedua primer mesti digunakan karena DNA
berbentuk heliks yang saling komplemen dan
arah berbeda (3’ to 5’ dan 5’ to 3’). Pada
percobaan ini digunakan BacF1 dan UniBiI
karena kedua primer ini bersifat universal
sehingga relatif mudah untuk diterapkan.
Pada percobaan ini hasil amplifikasi DNA
dengan PCR dianalisis dengan metode
elektroforesis. Elektroforegram yang
Gambar 2. Skema Perbanyakan Fragmen DNA dihasilkan pada percobaan ini yaitu:
Fungsi Dream Taq Polymerase 10x yaitu
sebagai sumber DNA polimerase yang
diperlukan sebagai enzim untuk proses
polimerisasi DNA. Polimerase yang
digunakan yaitu Taq karena Taq Polymerase
relatif lebih stabil walaupun pada suhu tinggi
yang dibutuhkan pada PCR yang suhu
denaturasinya relatif tinggi. Sumber Taq
polymerase yaitu dari bakteri termofilik
Thermus aquaticus. Fungsi buffer Dream
Taq poymerase yaitu sebagai pengatur pH
dari campuran agar pH yang dicapai
merupakan pH optimum untuk proses Gambar 3. Elektoforegram Hasil Amplifikasi DNA dengan
PCR; Urutan dari kiri ke kanan : sampel 1, sampel 2,
amplifikasi DNA. Fungsi dNTP yaitu sebagai kontrol positif, kontrol negatif, dan marker
sumber basa nukleotida yang diperlukan pada
tahap elongasi/pemanjangan. Fungsi ddH2O Berdasarkan elektroforegram gambar 1,
steril yaitu sebagai pelarut bagi campuran teramati bahwa DNA sampel 1 maupun
yang kemudian akan dilakukan PCR. ddH2O sampel 2 belum terbentuk. Hal ini dapat
yaitu air yang telah didemineralisasi dan diakibatkan oleh preparasi sampel yang
deionisasi. ddH2O mesti dalam keadaan steril kurang baik. Resuspensi sampel yang
agar tidak ada bakteri kontaminan yang dapat dilakukan secara kasar dapat menyebabkan
mengganggu proses amplifikasi DNA pada DNA di dalam sampel rusak sehingga saat
saat PCR dilakukan. Primer diperlukan dianalisis secara elektroforesis, tidak
sebagai inisiator sebelum terjadinya tampak adanya DNA pada sampel 1 dan 2.
polimerisasi DNA. Primer yang digunakan Kontrol negatif tidak menunjukkan adanya
mesti dua jenis yaitu primer maju dan primer pita. Hal ini sesuai karena kontrol negatif
mundur. Primer maju adalah primer yang bertujuan untuk mengurangi kesalahan
menyebabkan arah transkripsi maju. Primer analisis yang diakibatkan oleh kehadiran
maju akan menempel pada non-sense DNA. DNA lain. Preparasi kontrol negatif sudah
Primer mundur adalah primer yang sesuai sehingga tidak ada pita terbentuk,
yang menunjukkan bahwa tidak terdapat Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan
DNA (negatif). Kontrol positif rangkaian praktikum dan laporan edisi
menunjukkan adanya pita terbentuk pada spesial praktikum percobaan 7 ini. Penulis
kisaran 1500-200 kb. Untuk perbandingan ucapkan terimakasih kepada bu Enny dan
dengan elektroforegram DNA standar, Dessy selaku dosen mata kuliah Metabolisme
digunakan DNA marker. DNA marker yang dan Informasi Genetika, pak Reza selaku
digunakan yaitu GeneRuler™ 1 kb DNA dosen dan pemimpin praktikum Metabolisme
Ladder. Nilai kisaran 1500-2000 kb dan Informasi Genetika, dan seluruh asisten
diperoleh dengan membandingkan posisi praktikum Metabolisme dan Informasi
pita kontrol positif dengan pita DNA Genetika. Penulis ucapkan terimakasih juga
marker serta dengan bantuan gambar dari kepada teman-teman kelompok 3 yang telah
internet yang berisi posisi pita yang bekerjasama dengan baik menjadi rekan
dilengkapi dengan ukuran DNA pada praktikan dalam suka dan duka selama 1
berbagai posisi. Gambar DNA marker semester ini dalam praktikum Metabolisme
GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder yaitu sbb: dan Informasi Genetika.

DAFTAR PUSTAKA
[Online]
https://www.neb.com/applications/cloning-
and-synthetic-biology/site-directed-
mutagenesis diakses pada tanggal 19 April
2017 pukul 22.38
[Online]
http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structure
Id=1tau diakses pada tanggal 19 April 2017
pukul 22.45
Graham, C.R., Newton, A. (1997). PCR :
Introduction to Biotechniques, 2nd edition.
BIOS Scientific Publishers. 123-133
Pavlov, A. R.; Pavlova, N. V.; Kozyavkin, S. A.;
Slesarev, A. I. (2004). Recent developments
in the optimization of thermostable DNA
polymerases for efficient applications. Trends
in Biotechnology. 22 (5): 253–
Gambar 4. DNA Marker GeneRuler™ 1 kb DNA Ladder 260. doi:10.1016/j.tibtech.2004.02.011. PMI
D 15109812.
4. KESIMPULAN
PCR terhadap 16S rDNA telah dilakukan. Pombert JF, Sistek V, Boissinot M, Frenette M
Teknik resuspensi yang baik diperlukan agar (2009). Evolutionary relationships among
salivarius streptococci as inferred from
DNA tidak rusak saat tahap preparasi sampel
multilocus phylogenies based on 16S rRNA-
sebelum dilakukannya PCR. encoding, recA, secA, and secY gene
sequences. BMC Microbiol. 9:
UCAPAN TERIMA KASIH 232. doi:10.1186/1471-2180-9-
Puji syukur penulis ucapkan kepada Tuhan 232. PMC 2777182. PMID 19878555
Yang Maha Esa atas kasih dan penyertaan-