Anda di halaman 1dari 4

Nama :Aldrian Febriansyah

NIM :165100501111016
Kelas :Q
Kelompok :Q4

ANALISA PROSEDUR

1. Preparasi

Pada tahapan ini,langkah pertama yang harus dilakukan adalah mempersiapkan alat dan
bahan. Alat yang digunakan adalah 11 erlenmeyer, 6 tabung reaksi, beaker glass+magnetic
stirrer, falcon sebanyak 4 buah, mikrotip biru dalam gelas beker yang sudah disterilisasi. 11
erlenmeyer ini digunakan dengan sebagai berikut: 1 erlenmeyer untuk 3,08 gram MRSB di
dalam 56 ml aquades, 1 erlenmeyer untuk 200 ml aquades (sebagai tempat alginat yang
ditambah dengan CaCl2), 1 erlenmeyer untuk 200 ml aquades sebagai pencucian, 1 ml
erlenmeyer untuk 50 ml pepton 0,05 gram sebagai perendaman, 1 ml erlenmeyer untuk 200
ml pepton 0,2 gram sebagai pengujian, 1 erlenmeyer 50 ml NaCl 0,05 gram, semuanya itu
digunakan untuk imobilisasi sel. Sedangkan untuk imobilisasi enzim, I erlenmeyer untuk 51
ml MRSB 2,81 gram, 1 erlenmeyer untuk 200 ml aquades (sebagai tempat alginat yang
ditambah dengan CaCl2), 1 erlenmeyer untuk 200 ml aquades sebagai pencucian, 1
erlenmeyer untuk 50 ml pepton 0,05 gram sebagai perendaman, dan 1 erlenmeyer untuk 200
ml pepton 0,2 gram sebagai pengujian. Untuk 6 tabung reaksi, masing-masing digunakan
untuk 5 ml MRSB. 10 ml pepton (blanko), dan 10 ml pepton (blanko) sehingga didapatkan 20
ml pepton 0,2 gram. Ketiganya itu untuk imobilisasi sel. Sedangkan untuk imobilisasi enzim,
1 tabung reaksi diisi 6 ml NB 0,048 gram atau setara dengan 0,05 gram. 1 tabung reaksi untuk
10 ml pepton, dan 1 tabung reaksi diisi juga 10 ml pepton sehingga didapatkan 20 ml pepton
0,2 gram (blanko). Beaker glass+magnetic stirrer digunakan untuk menghomogenkan larutan.
Falcon sebanyak 6 buah digunakan untuk sentrifugasi, di mana 1 falcon berisi MRSB untuk
sel, 1 falcon berisi MRSB untuk enzim, dan 4 lainnya diisi dengan aquades dengan berat sama
dengan MRSB. Mikrotip biru berfungsi sebagai tube yang diletakkan di ujung mikropipet
untuk memindahkan cairan dalam jumlah kecil secara akurat. Sedangkan bahan yang
digunakan adalah alginat, CaCl2, MRSB, NB. Alginat digunakan sebagai matriks dalam
pengujian imobilisasi ini di mana nantinya alginat tersebut akan menjaga sisi aktif enzim agar
tidak terjadi perubahan. CaCl2 akan berikatan dengan alginat membentuk Ca-alginat dalam
bentuk gel dan tidak larut dalam air. MRSB dan NB digunakan sebagai media untuk kultur L.
casei maupun B. subtilis. Di sini kami menggunakan stok kultu L. casei untuk sel, dan B.
subtilis untuk enzim.

a. Pembuatan stok kultur 5 ml


Setelah mempersiapkan semua alat dan bahan tersebut, kemudian membuat stok kultur
5 ml dengan cara mengambil 1 ose isolat L. lactis (dari NA miring). Leletakkan semua
keperluan yang akan digunakan ke dalam LAF agar menghindari terjadinya
kontaminasi dan juga menyebabkan kejadian-kejadian yang tidak diinginkan. Setelah
itu hidupkan bunsen untuk aseptis tabung reaksi dan juga ose. Selanjutnya aseptis diri
dan lingkungan. Setelah itu aseptis ose terlebih dahulu dengan cara mencelupkan ose
ke alkohol 70% dan dilanjutkan membakar ose ke api bunsen hingga menyebabkan
ose berpijar merah, dan lakukan pengulangan hingga 3x. Selanjutnya membuka tabung
reaksi yang berisi media miring dan juga kultur dan kemudian di lanjutkan dengan
memanaskan ujung pada bunsen secara melingkar. Selanjutnya ose yang tadi sudah di
Nama :Aldrian Febriansyah
NIM :165100501111016
Kelas :Q
Kelompok :Q4

aseptis selanjutnya digunakan untuk mengambil satu kultur pada media miring.
Selanjutnya setelah di ambil tabung reaksi yang berisi kultur di panas kembali bagian
ujungnya dengan bunsen. Selanjutnya diinokulasikan pada 5 ml MRSB, dan ose yang
telah digunakan di aseptis lai dengan cara mencelupkan ose ke alkohol 70% dan
dilanjutkan membakar ose ke api bunsen hingga menyebabkan ose berpijar merah, dan
lakukan pengulangan hingga 3x dan berakhir pada api kemudian diinkubasi pada suhu
30oC selama 24 jam, sehingga didapatkan stok kultur 5 ml.
b. Pembuatan stok kultur 50 ml sel
Stok kultur 5 ml yang telah didapatkan, diinokulasikan sebanyak 3% ke dalam 50 ml
MRSB. MRSB digunakan karena merupakan media terbaik untuk pertumbuhan L.
casei. Setelah itu diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam, sehingga didapatkan stok
kultur 50 ml.
c. Pembuatan stok kultur 50 ml enzim
Stok kultur 5 ml yang telah didapatkan, diinokulasikan sebanyak 3% ke dalam 50 ml
NB. NB digunakan karena merupakan media terbaik untuk optimasi enzim. Setelah itu
diinkubasi pada suhu 30oC selama 24 jam, sehingga didapatkan stok kultur 50 ml.
d. Pembuatan CaCl2
Pembutaan CaCl2 dilakukan dengan cara menimbang CaCl2 sebanyak 0,55 gram
dalam timbangan analitik dan dilarutkan ke dalam 100 ml aquades steril . Setelah
larut, kemudian disimpan di dalam refrigerator supaya kera dan bisa membentuk beud
sempurnya.

2. Pembuatan imobilisasi sel

Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mempersiapkan stok kultur 50 ml, dan 6
falcon. Falcon beserta tutupnya ditimbang dalam timbangan analitik, dan diapatkan berat
sebesar 13,48 gram. Setelah itu, diisi dengan menggunakan stok kultur MRSB sebanyak 44
gram atau 45 ml dalam skala falcon. Selain itu juga ditimbang MRSB untuk enzim sebanyak
44 gram atau 45 ml dalam skala falcon karena akan dilakukan sentrifugasi secara bersamaan.
Untuk 4 falcon yang lain diisi dengan aquades dengan berat yang sama yaitu 44 gram, hal ini
karena sentrifugasi memerlukan 6 falcon, sehingga harus dilengkapi dengan aquades supaya
seimbang. 6 falcon tersebut sebelumnya diberi selongsong, kemudian dimasukkan ke dalam
alat sentrifugasi. Pada bagian tengahnya diberi vaselin sebagai pelumas. Selanjutnya ditutup
dan diatur waktu 10 menit, temperatur 4oC, serta kecepatan 8000 rpm. Untuk imobilasasi sel
ini yang digunakan adalah pelet karena di dalam pelet mengandung sel-sel, sedangkan untuk
supernatan nya dibuang. Pelet tersebut kemudian dicuci dengan 50 ml NaCl 0,9% w/v.
Selanjutnya divortex supaya homogen. Setelah itu dilakukan sentrifugasi lagi dengan tujuan
supaya mendapatkan sel yang murni. Pelet hasil sentrifugasi ditambahkan Na-alginat
konsentrasi 2% dengan cara 2 gram alginat dimasukkan ke dalam labu ukur berisi aquades 55
ml, dikocok, selanjutnya ditambah aquades lagi sebanyak 45 ml supaya konsentrasinya
menjadi 2%, kemudian dimasukkan ke dalam falcon sampai 30 ml yang sebelumnya telah
berisi pelet. Selanjutnya divortex supaya homogen. Hasil vortex diambil sebanyak 10 ml dan
diteteskan dengan menggunakan syringe ke dalam larutan CaCl2 0,05 M dingin yang telah
dibuat pada tahap preparasi sehingga membentuk beud sempurna. Setelah itu didiamkan
Nama :Aldrian Febriansyah
NIM :165100501111016
Kelas :Q
Kelompok :Q4

selama 30 menit dalam larutan CaCl2 tersebut. Kemudian disaring menggunakan penyaring
dan dicuci menggunakan aquades steril. Hasilnya sebanyak 4 gram dimasukkan ke dalam 200
ml pepton steril untuk diuji pH, kebocoran (spektrofotometer) pada hari ke-0, ke-2, dan ke-4,
difoto pada hari ke-0 dan ke-4 serta hitung beratnya pada hari ke-0. Kemudian sisanya
disimpan dalam pepton 0,1% 20 ml. Pengujian pH pada hari ke-0, ke-2, dan ke-4 dengan cara
siapkan pH meter. Kemudian tekan on, selanjutnya tekan kalibrasi (cal). Cuci probe
menggunakan aqaudes dan lap mengunakan tisu sampai bersih, kemudian masukkan probe ke
dalam buffer pH 7, tunggu sampai keluar tulisan cfm pada layar pH meter. Setelah muncul
keluar cfm kemudian tekan cfm dilanjutkan mencuci probe menggunakan aquades dan lap
sampai bersih, kemudian masukkan probe ke dalam buffer pH 4. Tunggu sampai keluar cfm
pada layar pH meter, setelah muncul tulisan cfm, tekan cfm. Selanjutnya probe dibilas dengan
aquades dan dikeringkan menggunakan tisu. Kemudian masukkan probe ke dalam erlenmeyer
yang berisi sampel sel dan tunggu sampai angka pada pH meter berhenti dan itulah pH dalam
larutan sel tersebut, catat hasilnya dalam data hasil praktikum. Setelah itu diuji kebocorannya
pada hari ke-0, ke-2, dan ke-4 menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 200 nm
dengan cara menyiapkan pepton sebagai larutan blangko dan sampel sel yang akan diuji.
Ambil kuvet dan bersihkan menggunakan aquades dengan cara memasukkan aquades ke
dalam kuvet dan dikocok sampai bersih, setelah dirasa bersih kemudian dibuang aquades sisa
pembersihan tersebut. Ketika memegang kuvet harus pada bagian yang sisi kasar, tidak boleh
pada sisi yang bening karena dapat mempengaruhi hasil pengukuran. Setelah itu masukkan
pepton ke dalam kuvet yang sudah bersih untuk kalibrasi. Masukkan kuvet yang sudah berisi
pepton ke dalam spektrofotometer dan tutup, kemudian tekan kalibrasi (cal) pada
spektrofotemeter hingga muncul angka 0. Setelah itu ambil kuvet dan cuci menggunakan
aquades dengan cara memasukkan aquades ke dalam kuvet dan dikocok sampai bersih,
setelah dirasa bersih kemudian dibuang aquades sisa pembersihan tersebut. Setelah itu
masukkan larutan sampel ke dalam kuvet, kemudian masukkan ke dalam spektrofotomete dan
tutup. Tunggu sampai angka pada layar spektrofotometer berhenti, dan itulah absorbansi yang
dihasilkan, catat hasilnya dalam data hasil praktikum.

3. Pembuatan imobilisasi enzim

Langkah pertama yang harus dilakukan adalah mempersiapkan stok kultur 50 ml, dan 6
falcon. Falcon beserta tutupnya ditimbang dalam timbangan analitik, dan diapatkan berat
sebesar 13,48 gram. Setelah itu, diisi dengan menggunakan stok kultur MRSB sebanyak 44
gram atau 45 ml dalam skala falcon. Selain itu juga ditimbang MRSB untuk sel sebanyak 44
gram atau 45 ml dalam skala falcon karena akan dilakukan sentrifugasi secara bersamaan.
Untuk 4 falcon yang lain diisi dengan aquades dengan berat yang sama yaitu 44 gram, hal ini
karena sentrifugasi memerlukan 6 falcon, sehingga harus dilengkapi dengan aquades supaya
seimbang. 6 falcon tersebut sebelumnya diberi selongsong, kemudian dimasukkan ke dalam
alat sentrifugasi. Pada bagian tengahnya diberi vaselin sebagai pelumas. Selanjutnya ditutup
dan diatur waktu 10 menit, temperatur 4oC, serta kecepatan 8000 rpm. Untuk imobilasasi
enzim ini yang digunakan adalah supernatan karena di dalam supernatan mengandung ekstrak
enzim kasar, sedangkan untuk peletnya dibuang. Supernatan hasil sentrifugasi ditambahkan
Nama :Aldrian Febriansyah
NIM :165100501111016
Kelas :Q
Kelompok :Q4

Na-alginat konsentrasi 2% dengan cara 2 gram alginat dimasukkan ke dalam labu ukur berisi
aquades 55 ml, dikocok, selanjutnya ditambah supernatan hasil sentrifugasi sebanyak 45 ml
supaya konsentrasinya menjadi 2%, kemudian dimasukkan ke dalam falcon sampai 30 ml.
Selanjutnya dihomogenisasi menggunakan magnetic stirrer. Hasilnya diambil sebanyak 10 ml
dan diteteskan dengan menggunakan syringe ke dalam larutan CaCl2 0,05 M dingin yang
telah dibuat pada tahap preparasi sehingga membentuk beud sempurna. Setelah itu didiamkan
selama 30 menit dalam larutan CaCl2 tersebut. Kemudian disaring menggunakan penyaring
dan dicuci menggunakan aquades steril. Hasilnya sebanyak 4 gram dimasukkan ke dalam 200
ml aquades steril untuk diuji kebocorannya menggunakan metode bradford pada hari ke-0, ke-
2, dan ke-4 menggunakan spektrofotometer panjang gelombang 595 nm dan difoto hasilnya
pada hari ke-0 dan ke-4.

4. Detesi kebocoran enzim metode Bradford

Sebanyak 0,1 ml sampel dipipet ke dalam tabung, kemudian ditambahkan 5 ml reagen


bradford. Setelah itu divortex, hasilnya diinkubasi selama 10 sampai 60 menit. Selanjutnya
diukur OD menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 595 nm dengan cara
menyiapkan aquades steril sebagai larutan blangko dan sampel+larutan bradford yang sudah
diinkubasi. Ambil kuvet dan bersihkan menggunakan aquades dengan cara memasukkan
aquades ke dalam kuvet dan dikocok sampai bersih, setelah dirasa bersih kemudian dibuang
aquades sisa pembersihan tersebut. Ketika memegang kuvet harus pada bagian yang sisi
kasar, tidak boleh pada sisi yang bening karena dapat mempengaruhi hasil pengukuran.
Setelah itu masukkan aquades steril ke dalam kuvet yang sudah bersih untuk kalibrasi.
Masukkan kuvet yang sudah berisi aquades steril ke dalam spektrofotometer dan tutup,
kemudian tekan kalibrasi (cal) pada spektrofotemeter hingga muncul angka 0. Setelah itu
ambil kuvet dan cuci menggunakan aquades dengan cara memasukkan aquades ke dalam
kuvet dan dikocok sampai bersih, setelah dirasa bersih kemudian dibuang aquades sisa
pembersihan tersebut. Setelah itu masukkan larutan sampel+larutan bradford ke dalam kuvet,
kemudian masukkan ke dalam spektrofotomete dan tutup. Tunggu sampai angka pada layar
spektrofotometer berhenti, dan itulah absorbansi yang dihasilkan, catat hasilnya dalam data
hasil praktikum , kemudian dibandingkan kadar protein dengan kurva standar BSA, dan
didapatkan hasil.