13/03/2017

UNIVERSIDAD DEL ZULIA

CENTRO DE ESTUDIOS DE CORROSIÓN
LABORATORIO DE CORROSIÓN MICROBIOLÓGICA

ESTUDIO DE MIC EN LABORATORIO:

EVALUACIÓN DE BIOPELÍCULAS
Y MORFOLOGÍA DE ATAQUE

Técnicas Microscópicas Seno del Fluido

Consorcios
de Células
Microscopía Óptica

Microscopía Electrónica (SEM y TEM)

Vacíos o
Microscopía Cofocal Láser (CLSM) Canales

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM)

Microscopía de Fluorescencia Adhesión Crecimiento Desprendimiento

Microelectrodos

Técnicas de Análisis Superficial

Difracción de Rayos X

Energía Dispersa de Rayos X

Espectroscopía de Infrarrojo (ATR/FT-IR)

Desarrollo de una biopelícula sobre

un sustrato metálico en el tiempo

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Provee información útil sólo cuando se acompaña con otras

técnicas (Por Ejemplo con microelectrodos)

Fuente: Center for the Biofilm Engineering

Microscopía de luz reflejada

Imagen de una biopelícula sobre un
cupón de 316L después de 13 días
de exposición a agua de río (in situ)
Fuente: Center for the Biofilm Engineering

 Fotomicrografías lámina de acero al carbono patrón

tomadas a 100X

 Fotomicrografías lámina de acero al carbono

expuesta a BSR por 1 día. 100X

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 Fotomicrografías lámina de acero al carbono

expuesta a BSR por 2 días. 100X

2
días

 Fotomicrografías lámina de acero al carbono

expuesta a BSR por 10 días. 100X

10
días

 Fotomicrografías lámina de acero al carbono

expuesta a BSR por 80 días. 100X

80
días

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Microscopía de Barrido Confocal Láser (Confocal Laser Scanning

Microscopy: CLMS): Esta técnica provee información “tridimensional” de la
morfología celular y su distribución sobre la superficie, la presencia de EPS y
la naturaleza de los productos de corrosión.

Cada imagen tomada con este microscopio

representa un sólo plano de un espécimen.

Si se retratan de forma sucesiva los

distintos planos que integran la muestra, el
microscopio puede hacer una reconstrucción
completa del espécimen en sus tres
dimensiones.

Imágenes Confocales de una biopelícula

tomada desde el fondo hasta el tope
Fondo

Tope

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Biopelícula en 3-D reconstruida

digitalmente

La unión de CLSM junto con los microelectrodos ha

permitido cuantificar la dinámica de las biopelículas y el
coeficiente de transporte de masa

Estratificación de las Biopelículas

Beyenal y Lewandowski, 2001.

“Mass Transport Dynamics, Activity, and Structure of
Sulfate Reducing Biofilms”
D. desulfuricans y P. fluorescens
Microelectrodos de H2S y pH

La concentración de H2S fue más baja en los

espacios vacíos de la biopelícula que en los
propios consorcios de células

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Imagen tomada con AFM de bacterias oxidadoras de manganeso

Leptotrix discophora SP6 adherida a la superficie de 316L

Fuente: MSU Center for the Biofilm Engineering

Imágenes tomadas con MEB (o SEM en inglés) de una

sola célula de D. desulfuricans G20 embebida en EPS

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Imagen tomada con MEB de

un depósito anular de
manganeso sobre un cupón
de acero inoxidable expuesto
a agua de río.

Mapeo con EDS de los depósitos

minerales anulares, demostrando
la presencia de manganeso,
oxígeno, calcio y carbono

Cupones 1 cm
2 cm

Glutaraldehido al 2.5 % en Buffer

Control
cacodilato 0.01 M, pH = 7.4
(Mínimo 4 horas)
Deshidrataciones sucesivas con
Acetona a diferentes
concentraciones (20, 30, 50, 70,
90, 100%) 15 min cada una.
Acetona 100 % (1 hora)

“Sputter Coater”

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Sin Au

Con Au

5000X

5000X

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10000X

10000X

Fe: 62.220 %
S: 26.569 %
P: 3.435 %
Mg: 7.776 %

Biopelícula:
entre un 85-95 % de agua

≈ 20 µm

Película deshidratada

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BIOPELÍCULA DE CULTIVO MIXTO

DE BSR DE LA PRÁCTICA

Problemas en la
Deshidratación

Células
reventadas

BIOPELÍCULA DE CULTIVO MIXTO DE BSR

Aplicaciones en Campo

Evaluación de Biopelículas sobre cupones de corrosión en la

Industria Petrolera

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Los fenómenos que ocurren a nivel de

interfase sólo pueden ser estudiados con el
uso de nuevas técnicas de análisis como los
Microelectrodos

Poseen diámetros de punta

muy pequeños:

No dañan la Biopelícula

Microelectrodos Alta Resolución espacial

Biopelícul
Sustrato Metálico
a

Pequeños sensores químicos cuyas puntas tienen

diámetros que oscilan entre 10 y 100 µm y permiten
determinar las características locales de los
microambientes a nivel de biopelícula.

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Algunos campos de la ciencia en donde se ha

reportado gran uso de estos instrumentos son:

Ecología Microbiana:
 Perfiles en sedimentos Sistemas de Nano Respiración
marinos  Respiración de huevos y
 Mediciones in situ de la embriones
producción de sulfuro
Mediciones en Pequeños
 Fotosíntesis en comunidades
Volúmenes de Líquidos (< 4 µL):
microbianas
 Mediciones de pH en drogas
Microbiología:
Fisiología:
 Respiración microbiana
 Medidas de flujo sanguíneo
 Microbiología de la boca
cerebral
Sistemas de Micro Respiración Investigaciones sobre riñones
 Respiración de animales  Nitratos y Nitritos en plasma de
acuáticos pequeños ratón
 Respiración de animales  Investigaciones sobre Diabetes
terrestres pequeños  Cirugía plástica
 Actividades Neuronales

Medición del O2 disuelto para

determinar velocidades de respiración

Fuente: www.unisense.com

Microelectrodos Potenciométricos:

El principio de la medición es determinar la diferencia de

potencial entre dos electrodos de referencia, sumergidos en
ambos lados de una membrana selectiva:

Sales Metálicas precipitadas

Vidrios selectivos de iones
Intercambiadores de ión Líquido (LIX)

Los Microelectrodos Potenciométricos más comunes son los

Microelectrodos de Sulfuros, Microelectrodos de Dióxido de
Carbono y los Microelectrodos Selectivos a Iones.

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Microelectrodos de pH

Los Tipos de Electrodos de pH más comunes son:

Electrolito

(A) Membrana Vidrio de

Alambre
Plomo
Selectiva de
Vidrio
Iridio

(B) Vidrio
LIX
Vidrio
Corning
0150
(C) Óxido de Metal Óxido de
Iridio

A B C

Microelectrodos Amperométricos

 Miden la corriente que resulta de la transferencia de electrone

s entre miembros de una pareja de óxido-reducción.

Al construir este tipo de electrodos es necesario:

Hacerlos selectivos, es decir, que sólo una pareja óxido-reducción

esté envuelta en la reacción del electrodo (deben polarizarse)

Hacerlos insensibles a la agitación de la solución (deben de cubrirse con

membranas)

• Entre los microelectrodos amperométricos más comunes se

pueden mencionar:
• Oxígeno Disuelto (OD), H2S, Cloruro y Peróxido de Hidrógeno.

Microelectrodo de H2S

Contra-electrodo -
-
-
-
-
-
-
- - - -
-
-
-
-
de Pt -
-
Cátodo
-
de- Platino
- -
-

(Cátodo) 2e-
2 K4Fe(CN)6
Carcaza externa
2 K3Fe(CN)6
+ + +
+ +
Electrolito: + Ánodo de Platino
+ + + ++
K3Fe(CN)6 50 mM en
Buffer Carbonato 2e-
2 K4Fe(CN)6
Ánodo de Pt
de Guarda 2 K3Fe(CN)6 H+
So
Ánodo de Pt HS-

Membrana de Silicona Membrana de Silicona

H2S

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1 Entrenamiento en el uso y calibración de los

dispositivos
2 Diseño y construcción de la celda de trabajo para
mantener las condiciones fijadas

3
Diseño del procedimiento de calibración,
posicionamiento de los microelectrodos y trabajo
experimental
4 Mantenimiento de la esterilidad y anaerobiosis
5 Puesta en práctica del procedimiento realizado y
medición continua de las variables, cada minuto por 24
horas.

Milivoltímetro de Alta
Impedancia

Picoamperímetro
Micromanipulador con
Motor

Microelectrodo
de pH

Controlador del
Motor del
Microelectrodo Micromanipulador
de H2S

Unidad
Convertidora de
Celda de Doble Pared
Señal

Soporte del
Micromanipulador
Computador con
Programa de
Adquisición de Datos

Micromanipulador

Microelectrodos
de pH y H2S

Base y Tapa
para el Reactor
Reactor de Vidrio
de doble
pared

Soporte para
Microelectrodos
Lámina de Hierro

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Entrada de
N2

Tapa del Reactor con

orificio para los
Reactor de
microelectrodos
Doble
Pared
Entrada de agua al
reactor (salida por el
lado opuesto)
Gato para
soportar el
Reactor a la
altura adecuada Base para colocar el
reactor y evitar el
movimiento

H2S pH

Comportamiento típico en el tiempo del pH y del H 2S a

nivel de interfase en el medio de cultivo sin iones
ferrosos inoculado con D. desulfuricans

Contaje Planctónico del Inóculo: 2,98x106 células vivas/mL

Contaje sésil a las 24 horas: 1,42x107 cel/cm 2

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Comportamiento en el tiempo del pH a nivel del seno

del fluido para los medios con y sin iones ferrosos

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