Fluorescent Immunoassays (FIA)

Fluorescent Immunoassays (FIA) Fluorescent Immunoassays hanyalah jenis

immunoassay yang berbeda. Variabel kuncinya adalah teknik biokimia yang digunakan
untuk mendeteksi pengikatan antibodi “deteksi” dan molekul analit. Keuntungan dari
sistem pendeteksi Fluorescent telah dikenal selama bertahun-tahun. Ini termasuk deteksi
sensitivitas yang lebih tinggi dari analit, reagen sederhana dan desain pengujian
sederhana. Beberapa terobosan telah terjadi selama beberapa tahun terakhir yang
memungkinkan penerapan sistem immunoassay berbasis fluoresen pada titik perawatan.
Sebuah immunoassay berbasis neon modern menggunakan sebagai pendeteksian reagen
senyawa fluorescent yang menyerap cahaya atau energi (energi eksitasi) pada panjang
gelombang tertentu dan kemudian memancarkan cahaya atau energi pada panjang
gelombang yang berbeda.
Perbedaan antara panjang gelombang cahaya eksitasi dan cahaya emisi disebut
pergeseran Stokes. Semakin besar pergeseran atau perbedaan dalam panjang gelombang
maka akan semakin sedikit interferensi karena cahaya eksitasi yang terdeteksi sebagai
bagian dari cahaya emisi. Baru-baru ini sejumlah perbaikan teknis telah terjadi yang
memungkinkan penerapan sistem immunoassay sensitivitas tinggi. Ini termasuk
ketersediaan sumber cahaya rendah dengan panjang gelombang sempit, fluorophores
baru yang lebih stabil yang memiliki pergeseran Stokes sangat lebar, detektor cahaya
solid state stabil dan mikroprosesor untuk memproses dan menganalisis data dari setiap
tes. Ketika sistem pendeteksian fluorescent dihubungkan dengan uji aliran lateral dan
dicocokkan dengan penganalisa biaya yang kuat namun rendah seperti Quidel Sofia atau
Sofia 2, hasilnya adalah peningkatan kinerja pengujian, kesempatan untuk pengujian
pergi bersama dengan penghapusan salah tafsir sering dikaitkan dengan tes point-of-
care yang dibaca secara visual.

Enzyme immunoassay
Enzyme immunoassay merupakan uji serologis yang umum digunakan di berbagai
laboratorium imunologi. Uji ini memiliki beberapa keunggulan seperti teknik
pengerjaan yang relatif sederhana, ekonomis, dan memiliki sensitivitas yang cukup
tinggi. Enzyme immunoassay diperkenalkan pada tahun 1971 oleh Peter Perlmann dan
Eva Engvall untuk menganalisis adanya interaksi antigendengan antibodi di dalam suatu
sampel dengan menggunakan enzim sebagai pelapor .
Umumnya Enzyme immunoassay dibedakan menjadi dua jenis, yaitu :
competitive assay yang menggunakan konjugat antigen–enzim atau konjugat antobodi–
enzim, dan non-competitive assayyang menggunakan dua antibodi. Pada Enzyme
immunoassay non-competitive assay, antibodi kedua akan dikonjugasikan dengan enzim
sebagai indikator. Teknik kedua ini seringkali disebut sebagai "Sandwich" Enzyme
immunoassay.
Intensitas warna campuran diukur dengan spektrofotometer yang disebut
Enzyme immunoassay reader hingga mendapatkan hasil berupa densitas optis (OD).
Dengan menghitung rata-rata kontrol negatif yang digunakan, didapatkan nilai cut-off
untuk menentukan hasil positif-negatif suatu sampel. Hasil OD yang berada di bawah
nilai cut-off merupakan hasil negatif, dan demikian juga sebaliknya.
Uji ini memiliki beberapa kerugian, salah satu di antaranya adalah kemungkinan
yang besar terjadinya hasil false positive karena adanya reaksi silang antara antigen
yang satu dengan antigen lain. Hasil berupa false negativedapat terjadi apabila uji ini
dilakukan pada window period, yaitu waktu pembentukan antibodi terhadap suatu virus
baru dimulai sehingga jumlah antibodi tersebut masih sedikit dan kemungkinan tidak
dapat terdeteksi.

Radioimmunoassay
Radioimmunoassay merupakan metode laboratorium (in vitro method) untuk mengukur
dengan relative tepat jumlah zat yang ada pada tubuh pasien dengan isotop radioaktif
yang bercampur dengan antibody yang disisipkan ke dalam sampel. Radioimmunoassay
merupakan revolusi dalam pemeriksaan medis. Pada tahun 2009, teknik ini masih
revolusioner karena merupakan blueprintuntuk pengembangan metode lebih lanjut
dalam teknik laboratorium di bidang medis.
Dengan menggunakan prinsip ini titer atau kadar berbagai hormon, antigen,
antibodi, enzim dan obat dalam darah dapat diukur dengan ketepatan dan ketelitian yang
sangat tinggi. Karena limit deteksi yang sangat baik ini maka RIA digunakan sebagai
peralatan laboratorium standar.
 RIA memanfaatkan radioaktivitas dari isotop radioaktif yang diinjeksikan ke
dalam sampel. Cacahan radiasi dideteksi menggunakan pencacah seperti detector
Geiger-Muller, scintillator, dan sebagainya.
RIA memiliki 2 keampuhan metode antara lain adalah: Pertama, pengukuran
radioaktivitas memberikan kepekaan dan ketelitian yang tinggi serta tidak terpengaruh
oleh factor-faktor lain yang terdapat dalam system. Kedua, reaksi immunologi
berlangsung secara spesifik karena antigen hanya dapat bereaksi dengan antibody yang
sesuai dengannya sehingga zat lain atau antigen lain yang tidak sesuai karakteristiknya
tidak dapat ikut campur dalam reaksi.
 Prinsip Kerja
Prinsip radioimmunoassay dapat diringkas sebagai persaingan reaksi dalam
campuran yang terdiri dari antigen/hormon berlabel radioaktif, antibodi dan
antigen/hormon yang tidak berlabel radioisotop. Antigen radioaktif dicampur dengan
sejumlah antibodi. Antigen dan antibodi berikatan satu sama lain menjadi satu zat.
Kemudian ditambahkan zat yang tidak diketahui jenisnya yang mengandung sedikit
antigen. Zat baru ini merupakan zat yang diuji

Chemiluminescent immunoassay (CLIA)

Chemiluminescent immunoassay (CLIA) adalah teknik immunoassay di mana label,
yaitu "indikator" sejati dari reaksi analitik, adalah molekul luminescent. Secara umum,
luminescence adalah emisi radiasi yang terlihat atau dekat-terlihat (λ = 300–800 nm)
yang dihasilkan ketika sebuah elektron bertransisi dari keadaan tereksitasi ke keadaan
dasar. Energi potensial yang dihasilkan dalam atom akan dirilis dalam bentuk cahaya.
Dalam spektrofotometri, luminescence memiliki kelebihan dibandingkan absorbansi di
mana yang pertama adalah ukuran absolut sedangkan yang kedua relatif. Kami
membuat referensi untuk chemiluminescence, karena jenis luminescence diterapkan
untuk teknik immunoassay umumnya mengidentifikasi reaksi kimia eksergonik sebagai
sumber energi yang paling cocok untuk menghasilkan keadaan tereksitasi elektronik.
Metode heterogen adalah uji chemiluminescent yang lebih banyak digunakan. Metode
chemiluminescent dapat langsung — menggunakan penanda luminofor — atau tidak
langsung — menggunakan penanda enzim. Salah satu metode mungkin kompetitif atau
tidak kompetitif. Dalam metode chemiluminescent langsung, penanda luminofor yang
digunakan adalah ester acridinium dan ruthenium, sedangkan penanda enzimatik yang
digunakan dalam metode tidak langsung adalah alkalin fosfatase dengan substrat
adamantil 1, 2-dioxetane aril fosfat (AMPPD) dan peroksidase horseradish dengan
luminol atau turunannya sebagai substrat. Sintesis molekul seperti AMPPD dan derivat
molekul dasar isoluminol lebih stabil dibandingkan dengan penanda luminescent lain
dan menghasilkan emisi cahaya dengan hasil kuantum yang menonjol secara
karakteristik. Aktivasi substrat ini membutuhkan reaksi kimia atau enzimatik yang
terkait dengan reaksi imunologi. Sebagai contoh, penggunaan luminol dan turunan dari
isoluminol sebagai label chemiluminescent tergantung pada kopling immunoassay
dengan reaksi enzimatik yang dikatalisis oleh peroksidase .Penambahan penambah
(misalnya ferrocyanide, ion logam) lebih meningkatkan aktivasi elektronik, yang pada
akhirnya mengarah ke sensitivitas analitik yang sangat tinggi (mol − 16 per liter), tentu
lebih unggul daripada yang dapat dicapai oleh metode immunoassay lain seperti RIA,
immunoenzymatic dan metode fluoroimmunoenzimatik (FEIA), dll.