Anda di halaman 1dari 6

13

IV METODOLOGI PENELITIAN

4.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Balai Karantina Ikan Kelas I

Surabaya I pada bulan Januari 2015.

4.2 Alat dan Bahan Penelitian

4.2.1 Peralatan

Peralatan yang dibutuhkan dalam penelitian ini yaitu tabung reaksi, rak tabung

reaksi, cawan petri, pembakar bunsen, ose, mikroskop, scalpel, gelas objek, cover

glass, autoclave, hot plate, kertas cakram, pipet mikro, pipet tetes, pengaduk,

erlenmeyer, gelas ukur, timbangan digital, haemocytometer dan Rotary vacum

evaporator.

4.2.2 Bahan

Bahan yang dibutuhkan yaitu isolat murni Saprolegnia sp. yang diperoleh dari

stok Laboratorium Balai Karantina Ikan Kelas I Surabaya I, daun kemangi (Ocimum

sanctum L), aquades, etanol 96 %, Formalin, Dimethyl sulfoxide (DMSO) 10%,

Sabouraud Dextrose Agar (SDA), dan antibiotik.

4.3 Metode Penelitian

4.3.1 Prosedur Kerja

A. Pembuatan Media Sabouraud Detroxe Agar dan Sterilisasi Alat

Bahan-bahan yang digunakan untuk membuat media SDA adalah serbuk

SDA, akuades dan antibiotik. Tekstur media SDA kenyal dengan permukaan halus
14

dan berwarna kuning pucat. Media SDA ini termasuk media padat (Pradhika, 2008).

Komposisi gram/L media SDA terdiri dari Peptic Digest of Animal Tissue: 5 gram,

Pancreatic Digest of Casein: 5 gram, Dextrose: 40 gram, Agar: 15 gram.

Penggunaan media sangat penting untuk isolasi, diferensiasi maupun

identifikasi untuk mendapatkan lingkungan hidup yang cocok bagi pertumbuhan

jamur (Setiyani, 2010). Media SDA ini dibuat dengan cara menimbang bahan (serbuk

SDA) dengan perhitungan 65 gram/L kemudian dimasukkan ke dalam labu

Erlenmeyer dan ditambahkan akuades (Hakim, 2009). Bahan-bahan tersebut diaduk

perlahan dengan pengaduk, lalu labu Erlenmeyer diletakkan diatas Hot Plate agar

dapat tercampur rata dan homogen. Ujung labu yang berisi larutan homogen ditutupi

dengan kapas kemudian dibungkus dengan kertas aluminium. Labu Erlenmeyer

diletakkan di dalam autoklaf bersama dengan cawan petri pada suhu 121 ˚C tekanan

15 Psi selama 15 menit guna untuk sterilisasi. Bahan dikeluarkan dari autoklaf dan

ditambah antibiotik (Viccillin). Hal ini dimaksudkan untuk meminimalisasi dan

menghindari adanya kontaminasi bakteri. Bahan SDA yang dalam keadaan cair

dimasukkan sebanyak 20 ml pada setiap cawan Petri. Media SDA kemudian

didinginkan, didiamkan selama 24 jam dan siap digunakan (Sugiawan, 2006).

B. Pembuatan Pelarut Ekstrak Daun kemangi

Ekstrak daun kemangi diencerkan dengan pelarut Dimethyl sulfoxide

(DMSO). Pelarut DMSO yang digunakan yaitu kosentrasi 10%, untuk membuat
15

larutan tersebut maka diperlukan 10 ml DMSO 100 % ditambahkan 90 ml aquades

(Assidqi, 2012).

C. Pembuatan Serbuk dan Ekstraksi Daun Kemangi

Daun kemangi yang digunakan yaitu daun kemangi yang berdaun besar. Daun

kemangi dikeringkan dengan sinar matahari selama 3 hari dan dihaluskan hingga

menjadi serbuk kemangi. Serbuk kemangi sebanyak 500 gram dimaserasi dengan

menggunakan etanol 96 % selama 3 x 24 jam dalam suhu kamar.

Menurut Ansel (1989) maserasi merupakan cara ekstraksi yang paling

sederhana karena bahan yang akan diekstrak cukup dilarutkan di dalam pelarut.

Selain itu pelarut yang digunakan dalam penelitian adalah etanol 96%. Hal ini karena

etanol dapat mengekstrak seluruh bahan aktif yang terkandung dalam daun kemangi,

terutama yang memiliki sifat antijamur. Larutan yang didapat kemudian disaring

menggunakan kertas saring lalu diuapkan menggunakan Rotary vacum evaporator.

Ekstrak yang dihasilkan kemudian diencerkan sesuai dengan konsentrasi :

1) Konsentrasi 100% yaitu 5 ml bahan ekstrak kemangi.

2) Konsentrasi 90% yaitu 4,5 ml bahan ditambah dengan 0,5 ml DMSO 10%.

3) Konsentrasi 80% yaitu 4 ml bahan ditambah dengan 1 ml DMSO 10%.

4) Konsentrasi 70% yaitu 3,5 ml bahan ditambah dengan 1,5 ml DMSO 10%.

5) Konsentrasi 60% yaitu 3 ml bahan ditambah dengan 2 ml DMSO 10%.

6) Konsentrasi 50% yaitu 2,5 ml bahan ditambah dengan 2,5 ml DMSO 10%.

7) Konsentrasi 40% yaitu 2 ml bahan ditambah dengan 3 ml DMSO 10%.


16

8) Konsentrasi 30% yaitu 1,5 ml bahan ditambah dengan 3,5 ml DMSO 10%.

9) Konsentrasi 20% yaitu 1 ml bahan ditambah dengan 4 ml DMSO 10%.

10) Konsentrasi 10% yaitu 0,5 ml bahan ditambah dengan 4,5 ml DMSO 10%.

11) Kontrol positif yaitu 0,2 ml formalin.

12) Kontrol negatif yaitu 5 ml DMSO 10%.

D. Kultur dan Identifikasi Saprolegnia sp.

Saprolegnia sp. yang didapatkan dari stok di Laboratorium Balai Karantina

Ikan Kelas I Surabaya I diperbanyak dengan mengkultur jamur pada media SDA.

Proses diawali dengan cara menginokulasikan jamur pada salah satu media SDA yang

sudah dibuat dengan menggunakan scalpel secara aseptis, kemudian dilanjutkan

dengan proses pemurnian dengan cara mengkultur ulang jamur yang sudah tumbuh

pada media SDA dengan menggunakan scalpel aseptis (Akbar, 2008).

Proses pemurnian dimulai dengan mengambil satu jenis koloni menggunakan

scalpel pada media SDA lama yang memiliki warna dan tekstur sejenis kemudian

diinokulasi pada media SDA baru dan diinkubasi pada suhu 25 o C selama 2-7 hari

untuk mendapatkan isolat murni (Yuasa dkk, 2003). Setelah itu dilakukan kultur pada

media air untuk memudahkan pengamatan. Dimulai dengan memotong bagian tepi

agar yang terdapat koloni jamur kira - kira 0,5 - 1,0 cm menggunakan pisau scalpel

yang telah dibakar lalu memindahkan potongan agar ke aquades dalam cawan petri

dan inkubasi selama beberapa hari pada suhu 25o C (Yuasa dkk, 2003). Identifikasi

dilakukan secara makroskopis yaitu dengan pengamatan bentuk dan warna koloni
17

sedangkan pengamatan secara mikroskopis meliputi bentuk hifa, bentuk spora dan

letak spora dengan menggunakan mikroskop (Yuasa, 2003).

E. Pembuatan Suspensi Jamur

Isolat jamur murni Saprolegnia sp. yang telah dikultur pada media agar

dipindahkan dalam tabung untuk mendapatkan suspense jamur maka dilakukan

perhitungan spora menggunakan haemocytometer. Kepadatan spora minimal yang

akan digunakan sekitar 105 sel/ml (Yuasa, 2003). Tahapannya yaitu mengambil sedikit

suspense Saprolegnia sp. dengan pipet tetes dan teteskan sebanyak satu tetes di tepi

gelas penutup, membiarkan selama satu sampai dua menit agar sel yang ada di dalam

bilik stabil (Lampiran 4).

4.3.2 Uji Efektifitas Antijamur

Pengujian efektifitas antijamur menggunakan metode difusi cakram.

Pengujian dilakukan untuk mengetahui konsentrasi minimal dari suatu larutan

antijamur yang dapat menghambat pertumbuhan jamur tertentu. Metode difusi kertas

cakram dimulai dengan merendam kertas cakram yang akan digunakan selama ± 10

menit ke dalam ekstrak daun kemangi dengan konsentrasi 10%, 20%, 30%, 40%,

50%, 60%, 70%, 80%, 90% dan 100% dengan ukuran kertas cakram sebesar 6mm

(Taura, 2014), media kontrol (-) diberikan DMSO 10%. Konsentrasi formalin yang

efektif dan aman untuk pengendalian Saprolegniasis adalah 4 ml/L (Wahyuningsih,

2006). Maka dalam penelitian digunakan konsentrasi 0,4% pada kontrol (+). Inkubasi

dilakukan pada suhu 25 ˚C selama 48 jam. Kertas cakram yang telah mengandung
18

ekstrak diangin-anginkan sampai tidak ada larutan yang menetes kemudian diletakkan

dengan jarak minimal dari tepi cawan adalah 20-25 mm di atas permukaan media

(Hakim, 2009). Kertas cakram tersebut akan berdifusi ke dalam media uji dan

menghasilkan zona bening di sekitarnya (Sarjono dan Mulyani, 2007). Besarnya zona

bening yang dihasilkan sebanding dengan potensi antijamur yang dihasilkan oleh zat

aktif yang terdapat dalam bahan dan diukur menggunakan penggaris.

4.4 Analisis Data

Data hasil penelitian berupa diameter zona hambat pertumbuhan jamur

Saprolegnia sp. oleh antifungi ekstrak daun kemangi (Ocimum sanctum L) dan

formalin 0,4 %. Diameter zona hambat adalah diameter daerah yang tidak ditumbuhi

oleh jamur disekitar kertas cakram dikurangi dengan diameter kertas cakram

(Sunarmi, 2010). Menurut Hakim (2009), penetapan potensi antijamur dilakukan

dengan membandingkan konsentrasi sampel yang menghasilkan diameter zona

hambat yang sama dengan diameter zona hambat baku pembanding yang digunakan

yaitu formalin.

Data tersebut disajikan secara deskriptif yang merupakan bagian dari statistik

yang mempelajari alat, teknik, atau prosedur yang digunakan untuk menganalisis data

dengan cara menggambarkan atau mendeskripsikan kumpulan data atau hasil

pengamatan. Statistik deskriptif juga dapat dilakukan untuk mencari kuatnya

hubungan antar variabel dengan membuat perbandingan dari rata-rata data sampel

atau populasi (Sugiyono, 2006).