Anda di halaman 1dari 4

Nama : Monika Roosyidah

NIM : 142010101106
Angkatan : 2014

Metode Imunohistokimia dengan Sensitivitas Tinggi dan Spesifik sebagai Deteksi Mutasi
V600E BRAF pada Melanoma

RAS/RAF/MEK/ERK merupakan mitogen yang diaktivasi oleh jalur protein kinase yang
berfungsi sebagai pengatur proliferasi, masa hidup, dan migrasi sel dan sering terjadi
penyimpangan pada kasus melanoma dan tumor. Mutasi gen BRAF merupakan salah satu bentuk
penyimpangan yang terjadi pada banyak kanker pada manusia dan terbanyak terjadi pada
kutaneus melanoma (50%). Bentuk mutasi gen BRAF yang tersering adalah substitusi satu asam
amino yaitu valin dengan asam glutamat pada residu 600 (V600E) dan hal ini terjadi sebanyak
75% kasus pada melanoma metastase.
Mutasi gen BRAF dihubungkan dengan prognosis yang buruk pada melanoma, kanker
kolorektal dan kanker tiroid papilar. Penundaan diagnosis dan pengobatan pada pasien kanker
mungkin dapat menurunkan kualitas hidup dan angka harapan hidupnya sehingga diperlukan
terapi yag efektif. Deteksi mutasi gen BRAF dapat menggunakan beberapa jenis metode PCR.
Namun, kekurangan metode ini adalah harga yang mahal dan pengerjaannya yang harus
dilakukan pada laboratorium tertentu dan juga memakan waktu yang lama. Oleh karena itu
dokter membutuhkan metode lain yang lebih cepat dan murah namun juga sensitif dan spesifik.
IHC atau imunohistokimia dapat dikembangkan sebagai metode diagnostik mendeteksi mutasi
gen BRAF sehingga akan meningkatkan kualitas hidup pasien dan dapat dilakukan di
laboratorium patologi di rumah sakit atau klinik. Berikut adalah laporan mengenai sensitivitas
dan spesifitas anti-BRAF antibody untuk mendeteksi mutase V600E pada pasien melanoma
metastase.
Pasien dan Metode
Pasien yang dilakukan uji diagnostik ini ada 100 orang pasien melanoma stadium IIIC dan IV
dan pasien yang mengalami tumor dan sudah dilakukan tes mutasi DNA BRAF oleh Peter
MacCallum Cancer Centre, Departement of Diagnostic Molecular Pathology (Melbourne,
Australia). Jaringan diambil dengan bisopsi fine needle aspiration.
 Imunohistokimia
Immunostaining Anti-BRAF V600E dilakukan pada jaringan sampel, menggunakan antibodi
monoclonal VE1 tikus yang sebelumnya dilakukan pemotongan jaringan 4µm lalu difiksasi
dengan formalin dan dilakukan embedding dengan paraffin (FFPE) (Heidelberg, Germany).
Selanjutnya potongan jaringan dikeringkan pada suhu 800C selama 15 menit dan diwarnai
dengan supernatan hibridoma non dilusi BRAF V600E spesifik klon VE1 (tersedia pada A.v.D.,
Spring Bioscience, Pleasanton, CA) pada Ventana BenchMark XT imunostainer (Ventana
Medical System, Tucson, AZ). Prosedur pewarnaan Ventana meliputi pretreatment dengan
kondisioner sel 1 (pH 8) selama 60 menit dilanjutkan dengan inkubasi dengan antibody VE1
pada suhu 370C selama 32 menit. Inkubasi antibody diikuti oleh sinyal amplifikasi standar
dengan kit Ventana amplifier, ultra-Wash, dan counterstaining dengan 1 tetes hematoxylin
selama 4 menit dan 1 tetes reagen bluing selama 4 menit. Sebagai deteksi kromogenik, maka
digunakan ultraView Universal DAB detection kit (Ventana Medical Systems) yang akan
memberikan warna coklat saat terjadi ikatan antigen antibodi. Slide dipindahkan dari
imunostainer, dicuci dengan tetes dishwashing detergent. Kromogen tidak terdeteksi ketika
ditambahkan antibody primer yaitu antibody BRAF V600E klon VE1.
 Deteksi Mutasi
Deteksi mutasi BRAF dilakukan pada potongan FFPE blok jaringan dan sampel diuji pada Peter
MacCallum Cancer Centre, Departement of Diagnostic Molecular Pathology (Melbourne,
Australia). Semua sampel digunakan termasuk sampel kanker regional dan metastase jauh
kecuali pada 10 pasien yang mengalami kutaneus melanoma primer. Sampel lalu dimakrodiseksi
dan dilakukan analisis HRM menggunakan primer flanking kodon 600 pada gen BRAF. Primer-
primer ini mengidentifikasi ekson 15 BRAF diantara nukleotida c. 1788 dan c. 1823 pada
sekuens NM_004333.4, terkait kodon 597 sampai 607. Semua HRM abnormal dikumpulkan dan
dilakukan sekuens DNA dengan primer yang telah disebutkan. Sekuens selanjutnya dilakukan
pada sampel dari pasien yang dicurigasi kemungkinan menjadi kandidat GlaxoSmithKline fase 1
clinical trial selektif inhibitor BRAF Dabrafenib (GSK2118436). Sampel diamplifikasi dengan
primer M13-tagged ekson 15 BRAF dan disekuens menggunakan primer M13. Data sekuens
diperoleh dari seluruh ekson 15 berisikan nukleotida c. 1742 sampai c. 1860 dalam referensi
sekuens NM_004333.4, terkait kodon 581 sampai 620. Fungsi dari pemeriksaan PCR ini untuk
membandingkan antara hasil IHC dan PCR.
Hasil IHC negativ dan positif mutasi BRAF V600 yang bertentangan diuji lagi dengan Peter
MacCallum Cancer Centre. Sedangkan hasil bertentangan IHC positif dengan BRAF V600
negatif diuji lagi menggunakan metode Healthscope Pathology (Clayton, Australia). Pewarnaan
HE pada potongan FFPE direview oleg ahli patologi.
Hasil dan Pembahasan
Tiga kasus tidak mengandung sel tumor saat dievaluasi dan sudah dikonfirmasi oleh ahli
patologi independen. 97 kasus lainnya terdiri dari 47 kasus memiliki mutasi gen BRAF pada
awal sekuens DNA (V600E=37, V600K-6 dan mutase BRAF lain=4). 35 dari 37 mutasi V600E
BRAF terwarna positif dengan antibody VE1. Keduanya, antara mutasi V600E tumor primer dan
metastase terwarna positif dengan VE1 dan pewarnaan lebih jelas terlihat pada lesi metastase.
Melanoma metastase memilki prognosis yang buruk dengan angka harapan hidup hanya
9 sampai 10 bulan saja dan pasien akan mengalami progresivitas penyakit yang cepat. Mutasi
V600E BRAF melanoma metastase sangat sensitive terhadap inhibitor BRAF dengan
vemurafenib dan dabrafenib. Deteksi mutasi gen BRAF saat ini sangat dibutuhkan dengan
menggunakan teknik molecular namun sayangnya masih sulit untuk didapatkan dan tersedia
pada laboratorium patologi, karna prosesnya meliputi blok retrieval, pemotongan, postage,
makrodiseksi, dan ekstraksi DNA sebelum mendeteksi BRAF. Maka dari itu metode yang saat
ini telah digunakan sangat mahal dan sulit untuk dilakukan. Berbeda halnya ketika diagnosis
dilakukan dengan metode imunohistokimia karena memberikan banyak manfaat diantaranya
dapat dilakukan dalam 24-48 jam pada insisi tumor, terjangkau, dan banyak tersedia di
laboratorium patologi dan membutuhkan jaringan yang minimal. Penelitian ini membandingkan
antara metode IHC dan PCR untuk mendeteksi V600E BRAF pada pasien melanoma metastase.
Hasil dari penelitian ini menunjukkan jika deteksi menggunakan antibody VE1 sangat sensitive
(97%) dan spesifik (98%) untuk keberadaan mutasi BRAF V600E. Pada saat penelitian terdapat
5 kasus yang berbeda hasil namun setelah dilakukan analisis mutase DNA ulang hanya 2 yang
mengalami perbedaan yang menunjukkan bahwa pendeteksian dengan antibodi lebih sensitive
untuk V600E daripada teknik sekuens tadisional.
Kesimpulan
Antibodi VE1 sangat sensitif dan spesifik untuk mendeteksi mutasi V600E BRAF
melanoma pada FFPE dibandingkan deteksi genetik BRAF. Metode IHC ini mungkin bisa
digunakan untuk mengevaluasi jaringan dengan komponen sel tumor yang rendah. Harganya
terjangkau, menggunakan jaringan yang minimal dan tidak memerlukan waktu lama untuk
penegakan diagnosis oleh dokter.

Sumber : Long, J.V. et al. 2013. Immunohistochemistry Is Highly Sensitive and Specific for the
Detection of V600E BRAF Mutation in Melanoma. 37(1).

Anda mungkin juga menyukai