LAPORAN

STUDI LAPANGAN

Isolasi Bakteri Streptococcus Pada Yoghurt Calpico Frezz

Oleh :
 Hilda Nur Haliza 1741420074
 Khairunnisa 1741420049
 M. Sofa Safarana Genalda 1741420071

POLITEKNIK NEGERI MALANG

2017
 BAB I
PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Bioproses merupakan proses pembentukan suatu produk yang

menggunakan mikroba sebagai biokatalisator. Bioproses merupakan bagian dari
bioteknologi. Spektrum bioteknologi sangat luas, mencakup produksi dengan
terfermentasi, antibiotika, enzim, alkohol, pelarut organik dan lain-lain.
Mikroorganisme merupakan mahluk hidup yang populasinya sangat besar
dan kompleks. Spesiesnya yang berjumlah ratusan terdapat di bagian-bagian
tubuh manusia, makanan, hewan dan lain-lain. Bukan hanya terdapat pada
mahluk hidup, mikroorganisme juga terdapat ditanah, air dan udara. Dalam
kehidupan terkadang kita membutuhkan suatu mikroorganisme tertentu untuk
diisolasi atau dibiakkan.
Mikroba ada yang menguntungkan dan ada yang tidak menguntungkan.
Mikroba yang jahat (tidak menguntungkan) biasa disebut mikroba pathogen akan
selalu di hindari, karena membawa penyakit atau kondisi yang tidak menguntukan
manusia.
Mikroba yang baik akan menguntukan, karena dapat menghasilkan suatu
produk yang bermanfaat bagi manusia. Salah satu contoh pemanfaatannya yaitu
Fermentasi bahan pangan. Fermentasi yang sering kita jumpai yaitu fermentasi
susu, yang menghasilkan produk yoghurt.
Yoghurt adalah susu yang dibuat melalui proses fermentasi bakteri asam
laktat, yaitu Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus. Populasi
mikroba di udara sangat besar dan juga kompleks. Bagaimana kita bisa
mendapatkan bakteri Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophilus
untuk bisa kita jadikan produk ? untuk mendapatkan mikroba yang kita inginkan
perlu dilakukan Isolasi bakteri.
Isolasi bakteri adalah salah satu usaha untuk mendapatkan
mikroorganisme yang dapat dimafaatkan bagi kesejahteraan manusia. Salah
satunya bakteri asam laktat, kelompok bakteri yang dapat mengubah karbohidrat

1
(glukosa) menjadi asam laktat. Bakteri asam laktat berpotensi memberikan
dampak positif untuk kesehatan dan nutrisi manusia, bahkan bakteri asam laktat
dapat mengendalikan beberapa tipe kanker dan mengendalikan tingkat serum
kolestrol dalam darah.

1.2 Rumusan Masalah

1. Bagaimana cara untuk menemukan bakteri Streptococcus thermophilus dalam

yoghurt merk Calpico Frezz .
2. Bagaimana morfologi bakteri Streptococcus thermophilus yang terdapat pada
yogurt merk Calpico Frezz ?
3. Apakah isolat bakteri Streptococcus thermophilus yang diperoleh terdapat
bakteri Streptococcus thermophilus ?

1.3 Tujuan

1. Mengisolasi bakteri Streptococcus thermophilus dari yoghurt merk Calpico

Frezz.
2. Mengetahui morfologi bakteri Streptococcus thermophilus dari yoghurt merk
Calpico Frezz.
3. Memperoleh isolat bakteri berupa bakteri Streptococcus thermophilus.

2
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Yoghurt adalah bahan makanan yang berasal dari susu sapi, yang
merupakan hasil pemeraman susu dalam bentuk mirip bubur atau es krim yang
mempunyai rasa agak asam sebagai hasil fermentasi oleh bakteri-bakteri tertentu.
Pembuatannya telah berevolusi dari pengalaman beberapa abad yang lalu dengan
membiarkan susu yang tercemar secara alami menjadi masam pada suhu tinggi,
mungkin sekitar 40-50°C. Akhir-akhir ini ditemukan pula bahwa yoghurt dapat
pula dibuat dari susu skim, full krim atau bahkan dari kacang kedelai (disebut
Soyghurt).
Yoghurt dibuat dengan menambahkan bakteri yang menguntungkan ke
dalam susu yang tidak dipasteurisasi (untuk mengatur keseimbangan antara
bakteri dan enzim dari susu) pada suhu dan kondisi lingkungan yang dikontrol.
Bakteri akan mengolah gula susu alami menjadi asam laktat. Hal itu akan
meningkatkan keasaman sehingga menyebabkan protein susu menyusut menjadi
masa yang padat atau kental. Peningkatan keasaman (pH 4-5) juga mencegah
proliferasi (perbanyakan sel) dari bakteri patogen lainnya.
Umumnya kultur yoghurt melibatkan dua atau lebih bakteri yang berbeda
untuk proses fermentasi, biasanya yaitu Streptococcus salivarius dan
Streptococcus thermophilus dan genus Lactobacillus, seperti L.acidophilus,
L.bulgaricus, L.casei dan L.bifidus. Karena kultur yoghurt mengandung enzim-
enzim yang dapat memecah laktosa, beberapa individu yang menderita lactose
intolerant dapat menikmati yoghurt tanpa efek yang merugikan. Secara nutrisi,
yoghurt memang kaya akan protein dan beberapa vitamin B serta mineral penting
lainnya.
Dalam pembuatan yoghurt secara alam pembuatan yoghurt secara alami,
susu yang akan difermentasi dipanaskan samapai 900C selama 15 – 30 menit,
kemudian didinginkan sampai 430C, diinokulasikan dengan 2% kultur campuran
Lactobacillus bulgaricus dan Streptococcus thermophillus dan dibiarkan pada
suhu ini selama kira-kira 3 jam sampai tercapai kemasan yang dikehendaki 0,85

3
-0,90% dan pH 4,0 – 4,5 kemudian produk didinginkan samapai 50C untuk
dikemas.
Streptococcus thermophillus adalah bakteri asam laktat dan sebagai starter
untuk pembuatan yogurt, berbentuk bulat dan berantai. Bakteri ini tergolong
homofermentatif yaitu bakteri yang dalam proses fermentasinya menghasilkan
lebih dari 85% asam laktat, sedangkan suhu optimum pertumbuhannya antara 37-
42°C , dengan pH optimum 6,5 , tidak tumbuh pada 10°C dan tidak tahan pada
konsentrasi garam. Pementukan asam laktat dari laktosa digunakan sebagai
sumber energi dan karbon selama pertubuhan bakteri dalam proses fermentasi
sehingga pH akan turun. Turunnya pH sangat berpengaruh terhadap kasein
sebagai bagian protein yang terbanyak dalam air susu, yang menyebabkan kasein
ini tidak stabil dan terkoagulasi (Helferich dan Westhoff, 1980).
Untuk isolasi bakteri asam laktat dapat digunakan Nutrien Agar sebagai
media tumbuh. Nutrien agar adalah medium umum untuk uji air dan produk dairy.
Media ini merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan
agar. Na merupakan salah satu media yang umum digunakan dalam prosedur
bakteriologi seperti uji biasa dari air, sewage, produk pangan, untuk membawa
stok kultur, untuk pertumbuhan sampel pada uji bakteri, dan untuk mengisolasi
organisme dalam kultur murni. Untuk komposisi nutrien agar adalah eksrak beef
10 g, pepton 10 g, NaCl 5 g, air desitilat 1.000 ml dan 15 g agar/L. Agar
dilarutkan dengan komposisi lain dan disterilisasi dengan autoklaf pada 121°C
selama 15 menit (Perwira, 2013).
Isolasi sendiri merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memisahkan
salah satu jenis bakteri yang kita inginkan dari bakteri yang lainnya sehingga kita
bisa mendapatkan kultur atau biakan yang lebih murni dari bakteri yang kita
inginkan tersebut. Teknik isolasi yang sering digunakan diantaranya adalah
dengan penggoresan, tuang, sebar dan mikromanipulator (Bukle, 2001).
Isolasi bakteri membutuhkan banyak syarat baik teknis maupun non
teknis. Bakteri merupakan makhluk hidup yang sangat sensitif dengan lingkungan
tempat tinggalnya, oleh karena itu persyaratan lingkungan yang menguntungkan
harus terpenuhi agar isolasi yang kita lakukan berhasil. Hal yang harus
diperhatikan diantaranya adalah suhu, pH, AW, sumber nutrisi yang banyak

4
terdapat dalam media agar yang kita gunakan dan lain sebagainya. Jika mereka
sudah mendapatkan lingkungan yang optimum untuk hidup dan berkembangbiak
maka kemungkinan besar isolasi yang kita lakukan akan berhasil (Adams, 2000).
Teknik isolasi mikroba digunakan untuk memisahkan bakteri dari
kumpulan bakterri dan mendapatkan bakteri yang murni dari jenis yang kita
inginkan. Tujuan utama dari penggoresan dalam isolasi bakteri adalah untuk
menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah dengan baik dari suspensi sel
yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan
waktu, tapi memerlukan ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan
yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah (Winarni, 2004).
Dikenal beberapa cara atau metode untuk memperoleh biakan murni dari
suatu biakan campuran. Dua diantaranya yang paling sering digunakan adalah
metode cawan gores dan metode cawan tuang. Yang didasarkan pada prinsip
pengenceran dengan maksud untuk memperoleh spesies individu. Dengan
anggapan bahwa setiap koloni dapat terpisah dari satu jenis sel yang dapat
diamati (Afrianto, 2004).
Biakan murni diperlukan dalam berbagai metode mikrobiologis, antara
lain digunakan dalam mengidentifikasi mikroba. Untuk mengamati ciri-ciri
kultural morfologi, fisiologi dan serologi dibutuhkan mikroba yang berasal dari
satu spesies (Dwidjoseputro, 2005).
Menurut Hadioetomo (1993), ada dua metode yang dilakukan untuk
memperoleh biakan murni yaitu :
1. Metode cawan gores
Metode ini mempunyai dua keuntungan, yaitu menghemat bahan dan
waktu. Metode cawan gores yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan
menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang diinginkan.
2. Metode cawan tuang
Cara lain untuk memperoleh koloni murni dari populasi campuran
mikroorganisme adalah dengan mengencerkan spesimen dalam medium agar yang
telah dicairkan dan didinginkan ( ±50 oC ) yang kemudian dicawankan. Karena
konsentrasi sel-sel mikroba di dalam spesimen pada umunya tidak diketahui
sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga

5
sekurang-kurangnya satu di antara cawan tersebut mengandung koloni terpisah di
atas permukaan ataupun di dalam agar. Metode ini memboroskan bahan dan
waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang tinggi.
Metode cawan gores memiliki dua keuntungan yaitu menghemat bahan
dan waktu. Namun untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan
yang lumayan yang biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores
yang dilaksanakan dengan baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya
mikroorganisme seperti yang diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum
sekali dilakukan oleh para mahasiswa yang baru mulai mempelajari mikrobiologi
ialah tidak memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik-baiknya untuk
digores sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan
cenderung untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan
pemisahan sel-sel yang digoreskan (Ratna, 1990).
Menurut Dwidjoseputro (1980), sifat-sifat koloni yang tumbuh pada agar-
agar di cawan dan pada agar-agar miring adalah sebagai berikut :
1. Sifat-sifat koloni pada agar-agar di cawan mengenai bentuk, permukaan dan
tepi. Bentuk koloni yaitu bundar, bundar dengan tepian karang, bundar dengan
tepian timbul, keriput, konsentria, tak beraturan dan menyebar, berbenang-benang,
bentuk L, bundar dengan tepian menyebar, filiform, rizoid, dan kompleks. Tepian
koloni berbentuk licin, berombak, bertekuk, tak beraturan, siliat, bercabang,
seperti wol, seperti benang, dan seperti ikat rambut. Macam-macam elevasi koloni
yaitu datar, timbul, cembung, seperti tetesan, seperti tombol, berbukit-bukit,
tumbuh ke dalam medium, dan seperti kawah.
2. Sifat-sifat koloni pada agar-agar miring. Sifat bentuk , tepian, dan elevasi sama
dengan sifat koloni pada cawan. Bentuk koloni yaitu bundar, bundar dengan
tepian karang, bundar dengan tepian timbul, keriput, konsentria, tak beraturan dan
menyebar, berbenang-benang, bentuk L, bundar dengan tepian menyebar, filiform,
rizoid, dan kompleks. Tepian koloni berbentuk licin, berombak, bertekuk, tak
beraturan, siliat, bercabang, seperti wol, seperti benang, dan seperti ikat rambut.
Macam-macam elevasi koloni yaitu datar, timbul, cembung, seperti tetesan,
seperti tombol, berbukit-bukit, tumbuh ke dalam medium, dan seperti kawah.

6
 Setelah mikroba ditumbuhkan pada media agar tabung maupun cawan dan
setelah inkubasi akan terlihat pertumbuhan bakteri dengan berbagai macam
bentuk, ukuran, sifat, dan berbagai ciri khas yang lain. Ciri-ciri ini akan
mengarahkan ke sifat-sifat mikroba tersebut pada media pertumbuhan, sehingga
pengamatan morfologi ini sangat penting untuk diperhatikan (Ratna,1990).
Bakteri yang memiliki flagella sering kali membentuk koloni yang
menyebar terutama jika menggunakan lempengan agar basah, untuk mencegah
menyebarnya koloni maka harus digunakan agar benar-benar kering (Djida,
N., 2000).
Selain teknik pertumbuhan bakteri atau teknik isolasi di atas, dikenal juga
adanya teknik isolasi mikroba yaitu inokulasi yang merupakan suatu teknik
pemindahan suatu biakan tertentu dari medium yang lama ke medium yang baru
dengan tujuan untuk mendapatkan suatu biakan yang murni tanpa adanya
kontaminasi dari mikroba yang lain yang tidak diiinginkan.
Berdasarkarkan hal tersebut di atas maka dilakukanlah praktikum ini untuk
mengetahui teknik dari isolasi dan inokulasi bakteri. Sebelum diinokulasi tangan
dan tempat kerja disemprot dengan alkohol dengan menggunakan metode aseptik,
jarum inokulasi disterilkan dengan membakarnya, dengan api sampai jarum
tersebut pijar (Pradika, 2008).
Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat
macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial
dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik
lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau
olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur
pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-
bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan
struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan
bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan
endospora, flagella dan pengecatan kapsul.
Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau
membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk
mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya

7
sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan
zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan
inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat.
Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena
selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk
mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri,
sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik
pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam
penelitian-penelitian mikrobiologi .
Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :
1. Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.
2. Memperjelas ukuran dan bentuk jasad
3. Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.
4. Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat
fisik dan kimia dapat diketahui.
· Langkah-langkah utama teknik pewarnaan
1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis
2. Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia
seperti sabun, formalin, fenol.
3. Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warna

Macam-Macam Pewarnaan
Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai
berikut :
1. Pewarnaan sederhana
Menggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan
hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang
paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil,
spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna
sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna
saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana
karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna

8
yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen
kromoforiknya bermuatan positif).
Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam
bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk
melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak
digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-
karbol (5 detik).

2. Pewarnaan differensial
Ø Pewarnaan differensial
Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti
pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Penjelasan sebagai berikut:
Ø Pewarnaan Gram
Pewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk
membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan
gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini
diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram
(1853–1938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk
membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae.
Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua,
yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri
terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi
dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada
mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.
Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus
Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri
dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di
dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak
permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak
terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.
Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :
o Zat warna utama (violet kristal)
o Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan
warna utama.
o Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang
digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.

9
 o Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali
sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan denga alcohol.
Bakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna
metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan
mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol,
sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna
penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua
bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini
berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan
struktur dinding sel mereka.
Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu
1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.
2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.
3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.
4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin
Perbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada
komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel
dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat
lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol
memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal
yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative
lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).
Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk
membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat
dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:
Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:
· Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 – 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.
o Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan
terdapat didalam
o lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit ± 10% dari berat kering,
tidak mengandung asam tekoat.
o Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.
o Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal
violet.
o Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.
o Tidak resisten terhadap gangguan fisik.
o Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat
o Peka terhadap streptomisin

10
 o Toksin yang dibentuk Endotoksin
Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:
o Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau
monolayer.
o Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan
ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari
50% berat ringan. Mengandung asam tekoat.
o Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.
o Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungu kristal.
o Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.
o Lebih resisten terhadap gangguan fisik.
o Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut
o Tidak peka terhadap streptomisin
o Toksin yang dibentuk Eksotoksin Endotoksin

3. Pewarnaan khusus untuk melihat struktur tertentu : pewarnaan flagel,

pewarnaan spora, pewarnaan kapsul.
Ø Pewarnaan Spora
Spora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa,
diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora
yang paling banyak digunakan.
Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores,
perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam
spora, seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol
fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari
Mycobacterium .
Ø Pewarnaan flagel
Pewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang
tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.
Ø Pewarnaan kapsul
Pewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan
tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul,
karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga
memberi warna pada latar belakang. Yang berwana biru gelap.

11
 BAB III
METODOLOGI

3.1 Pembuatan NA (Nutrien Agar)

3.1.1 Alat dan Bahan
Alat:
 Kertas Timbang 1 buah
 Neraca Analitik 1 buah
 Sendok 1 buah
 Cawan petri 2 buah
 Erlenmeyer 1 buah
 Gelas Ukur 25 ml 1 buah
Bahan :

12
  Ekstrak sapi 3 gram
 Pepton 5 gram
 Agar 15 gram
 Aquadest 1000 ml

3.1.2 Cara Kerja

1. Menyiapkan alat dan bahan yang diperlukan
2. Menimbang pepton 1 gram dan agar 3 gram
3. Menyiapkan kaldu daging sebanyak 200 ml, ukur dengan gelas ukur
100 ml sebanyak 2 kali
4. Memasukkan kaldu daging 200 ml dari gelas kimia 200 ml kedalam
Erlenmeyer 250 ml
5. Menambahkan agar 3 gram dan pepton 1 gram
6. Meletakkan campuran pada Erlenmeyer 250 ml diatas hot plate
7. Memasukkan megnetik stirrer dan didihkan
8. Mengukur pH lauratan dengan kertas pH
9. Mensterilkan dalam autoclave

3.2 Metode Cawan Tuang

3.2.1 Alat dan Bahan
Alat :
 Cawan petri steril 3 buah
 Tabung reaksi 8 buah
 Pembakaran spirtus 1 buah
 Korek api 1 buah
 Pipet mikro 100 – 1000 µL 1 buah
 Tip pipet mikro steril 5 buah
 Pipet ukur steril 10 ml 1 buah
 Ball pipet 1 buah
 Vortex mixer 1 buah
 Incubator oven 1 buah

13
  Autoclave 1 buah
Bahan :
 Air Steril
 Ethanol 70%
 Biakan asam laktat 1 mL
 Media agar NA 100 mL

3.2.2 Cara Kerja

1. Memberi label pada 6 tabung reaksi steril masing-masing 10 -1, 10-2,
10-3,10⁻⁴,10⁻⁵, dan 10⁻⁶
2. Memberi label pada cawan petri masing-masing 10-1, 10-2, 10-3,
10⁻⁴,10⁻⁵, dan 10⁻⁶
3. Memanaskan media NA beku hingga mencair.
4. Mendingikannya sampai kira-kira suhunya sekitar 450-500C
5. Memasukkan aquades steril ke dalam tabung reaksi dari yang berlabel
10-1 hingga 10⁻⁶
6. Memipet 1 mL suspensi biakan secara aseptik dan memasukkan ke
dalam tabung reaksi yang berlabel 10-1 ,kemudian kocok tabung reaksi
yang berlabel 10-1 dengan menggunakan vortex mixer.
7. Memipet 1 mL suspensi dari tabung reaksi 10-1 dan masukkan ke
dalam tabung reaksi 10-2,kemudian kocok tabung reaksi 10-2 dengan
menggunakan vortex mixer. Lakukan hal yang sama hingga tabung 10-
6.

8. Memipet 1 mL sampel dari masing-masing tabung tersebut kemudian

masukkan ke dalam cawan petri.
9. Menambahkan agar cair yang bersuhu sekitar 450-500 C ke dalam
cawan petri secara aseptik dan tunggu hingga beku
10. Memasukkan cawan petri ke dalam inkubator oven dalam posisi
terbalik
11. Memasukkan cawan petri ke dalam inkubator oven dalam posisi
terbalik
12. Mengamati koloni yang muncul

14
3.3 Cawan Gores
3.3.1 Alat dan Bahan
Alat :
 Cawan petri steril 2 buah
 Lup inokulasi 2 buah
 Pembakar spiritus 1 buah
 Botol semprot 1 buah
 Inkubator 1 buah
Bahan :
 Media agar NA steril 100 mL
 Biakan bakteri secukupnya

3.3.2 Cara Kerja

1. Menyiapkan cawan petri kering dan steril
2. Mengisi ½ bagian dari kedalaman cawan petri dengan media agar NA
3. Menunggu hingga agar NA beku
4. Memijarkan lup inokulasi
5. Menggoreskan lup inokulasipada agar dalam cawan petri yang berisi
biakan bakteri, tutup cawan di buka secukupnya
6. Menutup cawan petri dan membakar mulutnya
7. Menggoreskan biakan bakteri pada cawan petri yang berisi media agar
NA dengan membentuk pola zig zag dimulai dari sektor 0 hingga
sektor 3
8. Mensterilkan jarum ose dengan cara di bakar dengan pembakar
spiritus
9. Membungkus cawan petri dan menginkubasi cawan petri dengan
posisi terbalik dalam inkubator oven pada suhu yang sesuai selama
2x24 jam

3.4 Metode Agar Miring

3.4.1 Alat dan Bahan

15
Alat :
 Tabung reaksi steril 2 buah
 Rak tabung reaksi 1 buah
 Kapas 2 buah
 Lup inokulasi 2 buah
 Pembakar spiritus 1 buah
 Korek api 1 buah
 Inkubator oven 1 buah
Bahan :
 Media agar NA 100 mL

 Biakan dari hasil isolasi cawan gores secukupnya

 Etanol 70% secukupnya

3.4.2 Cara Kerja

1. Menyiapkan tabung reaksi kering dan steril lengkap dengan sumbat
kapasnya.
2. Memanaskan bibir tabung reaksi dengan api pembakar spiritus.
3. Menuangkan media agar NA ke dalam tabung reaksi hingga 1/3 tinggi
tabung reaksi.
4. Memanaskan lagi bibir tabung lalu tutup dengan sumbat kapas.
5. Menyimpan dalam posisi miring, atur sedemikian rupa hingga media
agar di dasar tabung tidak terlalu tebal dan ujung agar miring cukup
jauh dari mulut tabung.
6. Setelah agar miring jadi, kemudian pegang cawan petri berisi isolat di
tangan kiri dan lup inokulasi di tangan kanan. Pijarkan lup inokulasi
hingga memerah, kemudian panaskan bibir cawan petri dalam
beberapa putaran.
7. Menggerakkan ibu jari tangan kiri ke arah atas sedemikian hingga
tutup cawan petri terangkat sedikit dan tahan dengan telunjuk dan jari
tengah tangan kiri.

16
 8. Mengambil satu lup biakan isolat yang sudah dipilih dan cepat tutup
cawan petri. Jangan lupa untuk memanaskan sekali lagi bibir cawan
petri.
9. Memegang tabung reaksi dengan tangan kiri dan lup inokulasi di
tangan kanan. Buka tutup kapasnya dengan kelingking tangan kanan
dan jepitkan ke telapak tangan kanan.
10. Memanaskan bibir tabung reaksi dalam beberapa putaran, lalu
masukkan lup inokulasi dan goreskan agar miring dalam tabung reaksi
dengan pola zig zag.
11. Memanaskan bibir tabung sebelum kapasnya ditutupkan lagi. Lalu
inokulasi selama 2x24 jam dalam inkubator oven pada suhu yang
sesuai.
12. Memijarkan lup inokulasi sebelum disimpan.

3.5 Pewarnaan Negatif

3.5.1 Alat dan Bahan
Alat :
 Mikroskop 1buah
 Kaca preparat 1buah
 Kaca penutup 1buah
 Lup inokulasi 1buah
 Pembakaran spirtus 1buah
 Penjepit kayu 1buah
 Rak tabung reaksi 1buah
 Tissue secukupnya
Bahan :
 Biakan bakteri murni secukupnya
 Larutan nigrosine secukupnya
 Etanol 70% secukupnya

3.5.2 Cara kerja :

17
 1. Membersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian
difiksasi di atas bunsen
2. Memijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi
juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Memijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu
diratakkan di atas preparat glass
4. Mengeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Meneteskan larutan zat warna tinta cina 1 tetes
6. Mengeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Mencuci dengan air mengalir
8. Mengeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9. Mengamati dibawah mikroskop

3.6 Pewarnaan Sederhana

3.6.1 Alat dan Bahan
Alat :
 Gelas benda 1buah
 Lup inokulasi 1buah
 Pembakaran spiritus 1buah
 Mikroskop 1buah
 Bak pewarna 1buah
 Botol semprot 1buah
 Penjepit kayu 1buah
 Kertas serap / tissue secukupnya
Bahan
 Air steril secukupnya
 Alkohol 70% secukupnya
 Larutan zat warna biru metilene Loffler secukupnya
 Larutan zat Carbol Fuchsin secukupnya
 Bakteri biakan murni secukupnya

3.6.2 Cara kerja

1. Membersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi

di atas bunsen

18
 2. Memijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi
juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Memijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu
diratakkan di atas preparat glass
4. Mengeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Meneteskan larutan zat warna crystal violet sebanyak 1 atau 2 tetes
6. Mengeringkan dan dianginkan selama 1 menit
7. Mencuci dengan air mengalir
8. Mengeringkan preparat dengan dianginkan, dan
9. Mengamati dibawah mikroskop karakteristik dan bentuk bakteri

3.7 Pewarnaan Gram

3.7.1 Alat dan Bahan
Alat
 Gelas benda 1buah
 Lup inokulasi 1buah
 Pembakaran spirtus 1buah
 Mikroskop 1buah
 Bak pewarna 1buah
 Botol semprot 1buah
 Penjepit kayu 1buah
 Kertas serap / tissue secukupnya
Bahan
 Crystal Violet secukupnya
 Larutan KI secukupnya
 Alkohol 95% p.a secukupnya
 Safranine secukupnya
 Larutan Iodine secukupnya
 Aquades secukupnya

3.7.2 Cara kerja

1. Membersihkan preparat glass dengan alkohol 70% kemudian difiksasi

di atas bunsen

19
 2. Memijarkan jarum ose kemudian dicelupkan ke aquades dan diberi
juga sedikit aquades pada preparat glass menggunakan jarum ose
3. Memijarkan lagi jarum ose dan diambil bakteri dari media lalu
diratakkan di atas preparat glass
4. Mengeringkan dan dianginkan preparatnya
5. Meneteskan larutan zat warna crystal violet 2-3 tetes dan didiamkan
selama 1 menit
6. Mengeringkan dan dianginkan preparatnya
7. Mencuci dengan air mengalir dan dikeringkan
8. Meneteskan dengan larutan Lugol dan dibiarkan selama 1 menit lalu
dicuci dengan air mengalir dan diangin keringkan
9. Kemudian dicuci dengan dengan alkohol 95% selama 30 detik, lalu
dicuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
10. Memberi larutan basic fuchsin atau safranin selama 2 menit
11. Mencuci dengan air mengalir dan dikering anginkan
12. Mengamati dibawah mikroskop

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

1.1 Hasil Pengamatan

Cawan Tuang
Hasil Pengamatan Literatur Keterangan

Pengenceran 10-2
Jumlah koloni 70
Bentuk : Bundar
Tepian : Licin

20
 Elevasi : Timbul

Source : journal.unhas.ac.id
Pengenceran 10-4
Jumlah koloni 4

Bentuk : Bundar
Tepian : Licin
Elevasi : Timbul

Pengenceran 10-6
Jumlah koloni
tidakbisa dihitung

Bentuk : Bundar
Tepian : Licin
Elevasi : Timbul

Pengamatan dan
pengecekan bakteri
pada cawan tuang
sebelum digoreskan
pada cawan gores.
Hasil pengamatan
yaitu bakteri
Streptococcus
thermophilus.

21
 Colony Counter
Hasil Pengamatan Literatur Keterangan

Terdapat 70 koloni

Source:
www.coleparmer.com

Cawan Gores
Hasil Pengamatan Literatur Keterangan
Cawan gores A
Tumbuh pada sektor
0,1,2,3
Bentuk: Tak Beraturan
Tepian: Licin
Elevasi: Timbul
Source:
mulyadiveterinary.word
press.com
Cawan gores B
Tumbuh pada sektor 0
Bentuk : Tak Beraturan
Tepian : Licin
Elevasi : Timbul

Agar Miring

22
 Hasil Pengamatan Literatur Keterangan

Agar Miring A
Bentuk: Tak Beraturan
Tepian: Licin
Elevasi: Timbul

Source:
mulyadiveterinary.wordpress
.com
Agar Miring B
Bentuk: Tak Beraturan
Tepian: Licin
Elevasi: Timbul

Pewarnaan
Hasil Pengamatan Literatur Keterangan
Pewarnaan negatif dengan
nigrosin.
Perbesaran 1000x
Bentuk : coccus
Streptococcus thermophilus
Warna Bakteri: Tidak
Source:
berwarna
ferrydwirestuhendra.blogspot.co
m

23
 Pewarnaan sederhana dengan
methylene blue.
Perbesaran 400x
Bentuk : coccus
Streptococcus thermophilus
Warna Bakteri : Biru

Source: analiskesehatan-
indonesia.blogspot.com
Pewarnaan sederhana dengan
carbol fuchsin. Perbesaran
400x.
Bentuk : coccus
Streptococcus thermophilus
Warna Bakteri : merah
Source:
goresantintaanakrantau.blogspot.c
om
Pewarnaan gram dengan
crystal violet, iodine, safranin
Perbesaran 400x
Bentuk : coccus
Streptococcus thermophilus
Warna Bakteri :Ungu

Source:
goresantintaanakrantau.blog
spot.com

24
1.2 Pembahasan
Praktikum kali ini akan dilakukan isolasi bakteri asam laktat pada yoghurt.
Yogurt yang digunakan bermacam-macam antara lain yogurt cup, activia, dan
yogurt botol. Kami mengisolasi bakteri dari yoghurt dengan merk Calpico Frezz
dengan komposisi sebagai berikut :

Gambar. 1.1. Komposisi Calpico Frezz

Telah diketahui bahwa pada yoghurt terdapat proses fermentasi yang
dilakukan oleh bakteri asam laktat (BAL). Bakteri asam laktat (BAL) adalah
kelompok bakteri gram-positif yang tidak membentuk spora dan dapat

25
memfermentasikan karbohidrat untuk menghasilkan asam laktat. Berdasarkan
taksonomi, terdapat sekitar 20 genus bakteri yang termasuk BAL. Beberapa BAL
yang sering digunakan dalam pengolahan pangan adalah Aerococcus,
Bifidobacterium, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus,
Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,
Vagococcus, dan Weissella. Contoh produk makanan yang dibuat menggunakan
bantuan BAL adalah yogurt, keju, mentega, sour cream (susu asam), dan produk
fermentasi lainnya. Dalam pengolahan makanan, BAL dapat melindungi dari
pencemaran bakteri patogen, meningkatkan nutrisi, dan berpotensi memberikan
dampa positif bagi kesehatan manusia. Untuk memisahkan dan menyimpan kultur
bakteri tersebut perlu dilakukan isolasi untuk mendapatkan strain murni dari
mikroba tersebut. Strain murni tersebut nantinya bisa digunakan untuk pembuatan
yoghurt kembali setelah diaktivasi. Pada isolasi bakteri asam laktat ini ada dua
metode yang dipakai, yaitu metode tuang dan metode gores. Sebelumnya harus
terlebih dahulu membuat NA sebagai media tumbuhnya bakteri. Tahapan-tahapan
pengerjaan isolasi bakteri dari yoghurt sebagai berikut :

A. Pembuatan Nutrient Agar

Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-
molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan
juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya (Indra, 2008).
Di dalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri
khususnya dalam skala laboratorium, maka terlebih dahulu kita harus dapat
menumbuhkan mereka dalam suatu biakan yang mana di dalamnya hanya terdapat
bakteri yang kita butuhkan tersebut tanpa adanya kontaminasi dari mikroba lain.
Biakan yang semacam ini biasanya dikenal dengan istilah biakan murni. Untuk
melakukan hal ini, haruslah di mengerti jenis- jenis nutrien yang disyaratkan
bakteri dan juga macam ligkungan fisik yang menyediakan kondisi optimum bagi
pertumbuhan bakteri tersebut (Pelczar, 1986).

26
 Media NA adalah medium yang digunakan untuk pertumbuhan mayoritas
dari mikroorganisme yang tidak selektif dalam artian mikroorganisme hetrotrof.
NA merupakan media sederhana yang dibuat dari ekstrak beef, pepton, dan agar.
NA merupakan salah satu media umum yang digunakan dalam prosedur
bakteriologi, seperti untuk pertumbuhan sampel uji bakteri dan untuk mengisolasi
mikroorganisme dalam kultur murni (Sandjaja, 2004).
Pada praktikum kali ini digunakan NA yang berasal dari ekstrak daging.
Kami membuat larutan NA sebanyak 2 liter dan kemudian dibagi pada 8
kelompok, setiap kelompok mendapatkan larutan sebanyak 250 ml. Daging yang
dibutuhkan untuk membuat 2 liter larutan NA adalah 6 gram, bahan-bahan lain
yang dibutuhkan untuk membuat NA adalah pepton sebanyak 10 gram, bubuk
agar sebanyak 30 gram. Pertama daging 6 gram direbus sampai mendidih supaya
kaldu yang ada pada daging keluar dan dilakukan penyaringan agar daging yang
masih tersisa terpisah sehingga yang diperoleh hanya kaldu daging. Kemudian
kaldu daging ditambahkan pepton 10 gram, agar bubuk 30 gram yang telah
dilarutkan, dan aquades secukupnya. Untuk memperoleh hasil yang baik ,larutan
NA dipanaskan diatas hot plate sambil diaduk. Tujuan dari pemanasan dan
pengadukan ini adalah untuk menghomogenkan NA dengan aquades, dimana
dengan pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dan Aquades. Setelah
dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning
jernih (bening) ini menandakan larutan telah homogen. Setelah itu larutan NA
disterilisasi dahulu dengan menggunakan autoclave dan sumbat mulut
erlenmenyer dengan menggunakan kapas agar mengurangi resiko terjadinya
kontaminasi. Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi,
yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan.
Setelah itu, agar dinginkan dan siap digunakan untuk media dalam isolasi
bakteri.

27
 Gambar 1.2 Media NA
Medium NA berdasarkan konsistensinya merupakan medium yang bentuknya
padat. Berdasarkan susunan kimiawinya, medium ini merupakan organik non
sintetik karena disusun dari bahan-bahan organik. Medium NA berfungsi untuk
menumbuhkan bakteri pada permukaan sehingga mudah diisolasi dan di
identifikasi.

B. Sterilisasi
Sterilisasi adalah suatu proses di mana kegiatan ini bertujuan untuk
membebaskan alat ataupun bahan dari berbagai macam mikroorganisme. Suatu
bahan bisa dikatakan steril apabila bebas dari mikroorganisme hidup yang patogen
maupun tidak baik dalam bentuk vegetatif maupun bentuk non vegetatif (spora)
(Subaghdja, 2010).
Sterilisasi adalah suatu proses untuk membunuh semua jasad renik yang
ada, jika ditumbuhkan di dalam suatu medium tidak ada jasad renik yang dapat
berkembang baik. Sterilisasi harus dapat membunuh renik yang paling tahan
panas yaitu spora bakteri (Fardiaz, 1992).
Adanya pertumbuhan mikroorganisme menunjukkan bahwa pertumbuhan
bakteri masih berlangsung dan tidak sempurnanya proses sterilisasi. Jika sterilisasi
berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk paling resisten
dari kehidupan mikrobia akan diluluhkan (Lay dan Hatowo, 1992).

28
 Sterilisasi dalam bidang mikrobiologi merupakan suatu upaya atau metode
yang bertujuan untuk membebaskan alat-alat atau bahan/sample secara lengkap
dari dekontaminasi segala macam bentuk kehidupan mikroorganisme lain.
Sterilisasi ini penting dilakukan dalam praktikum mikrobiologi, hal ini
dikarenakan agar bahan atau peralatan yang digunakan tersebut tidak didapatkan
kehadiran mikroorganisme lain yang tidak diinginkan yang akan mengganggu
atau merusak media ataupun mengganggu kehidupan dan proses yang sedang
dikerjakan sehingga pelaksanaan praktikum dapat berjalan dengan lancar.

Gambar 1.3. Autoclave

Sterilisasi yang digunakan dalam praktikum ini adalah pemanasan dengan
uap air panas bertekanan. Cara ini menggunakan mesin autoclave yang dapat
mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang menggunakan tekanan 15 psi
(1,02 atm) dan suhu 1210C. Dengan tekanan dan suhu tersebut serta dilakukan
selama 30 menit menyebabkan endospora Bacillus stearothermophillus rusak.
Alat dan media yang akan disterilkan, yaitu : tabung reaksi, pipet ukur, cawan
petri, aquades, nutrient agar, dan tip. Dalam proses sterilisasi memilih gambar
erlenmeyer yang digunakan untuk mensterilkan alat dan media. Setelah itu
memilih program sesuai dengan kebutuhan. Waktu dan tekanan akan mengalami
kenaikan sesuai dengan program yang diatur. Proses sterilisasi berlangsung saat
lampu steril menyala serta diiringi penurunan suhu, waktu, dan tekanan. Jika
sterilisasi telah selesai angkat alat dan media, kemudian masukkan ke dalam oven
untuk proses sterilisasi dengan panas kering selama 1x24 jam.

C. Pengenceran
Pengenceran adalah melarutkan atau melepasan mikroba dari substratnya
ke dalam air sehingga lebih mudah penanganannya. Tujuan pengenceran yaitu

29
untuk mengurangi kepadatan bakteri yang ditanam (Fais, 2009). Pengenceran
merupakan proses yang dilakukan untuk menurunkan atau memperkecil
konsentrasi larutan dengan menambah zat pelarut ke dalam larutan sehingga
volume larutan menjadi berubah (Nurohaianah et al, 2007).
Larutan yang digunakan untuk pengenceran harus memiliki sifat osmotik
yang sama dengan keadaan lingkungan asal mikroba untuk menghindari rusaknya
sel, selain itu juga dijaga agar tidak terjadi perbanyakan sel selama pengenceran.
Pengenceran yang dilakukan dalam percobaan ini adalah pengenceran desimal
yaitu 10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6 dan 10-7
Sampel yang kami ambil adalah yoghurt yang diencerkan dalam suatu
tabung . Dari hasil pengenceran ini kemudian di ambil kira- kira 1 mL untuk
diencerkan lebih lanjut. Pengenceran yang kami buat sebanyak 6 kali mulai dari
10-1,10-2,10-3,10⁻⁴,10⁻⁵, dan 10⁻⁶ kemudian masing-masing kelompok mengambil
pengenceran untuk dimasukkan pada 3 tabung. Pengenceran ini dilakukan untuk
mendapatkan bakteri dengan menggunakan micro pipette dan tip. Kelompok kami
menggunakan pengenceran 10-2, 10-4, dan 10-6 yang akan digunakan di cawan
tuang.

Gambar 1.4 Proses Pengenceran

D. Cawan Tuang dan Colony Counter

Terdiri atas penginokulasian biakan campuran kedalam tabung uji yang
mengandung agar mencair yang telah didinginkan pada suhu 450c. isinya diaduk

30
untuk memencarkan bakteri keseluruh medium. Campuran itu kemudian
ditungkan kedalam cawan petri steril dan dibiarkan padat pertumbuhan koloni
terjadi baik dalam medium tujuan pada kedua proses ialah untuk memisahkan
bakteri satu sama lain sehingga sel-sel itu akan tumbuh menjadi koloni-koloni
yang terpisah didalam medium yang padat. Kemudian dapat diambil sel-sel dari
satu koloni untuk mendapatkan biakan murni. Dalam praktek, sering piringan
kedua digores kembali dengan organisme yang berasal dari koloni yang diisolasi
untuk menjamin bahwa hasil yang diperoleh adalah biakan murni.
Sebelum diinokulasi tangan dan tempat kerja disemprot dengan alkohol
dengan menggunakan metode aseptik, jarum inokulasi disterilkan dengan
membakarnya, dengan api sampai jarum tersebut pijar (Pradika, 2008).
Dalam praktikum, cawan petri sejumlah 7 dengan menyisakan 3 cawan
yang tidak diberi nutrient agar untuk media cawan tuang. Untuk cawan tuang
digunakan 3 cawan petri sedangan cawan gores sejumlah 3 cawan gores dan 1
cawan petri digunakan untuk blanko. Langkah pertama dalam isolasi media cawan
tuang adalah menuangkan bakteri dari proses pengenceran dengan menggunakan
micro pipette dan tip. Selanjutnya menuangkan nutrient agar sebanyak sepertiga
dari cawan. Kemudian cawan petri diputar searah jarum jam sebanyak 5 kali dan
berlawanan arah jarum jam sebanyak 5 kali, kemudian putar cawan petri
membentuk angka delapan sebanyak 5 kali. Setelah itu diamkan hingga NA
membeku.
Kemudian cawan tuang diinkubasi ke dalam oven pada suhu 400C selama
2x24 jam. Tujuannya untuk mempercepat pertumbuhan bakteri dalam cawan petri.
Selanjutnya, melihat hasil biakan yang telah diinkubasi dalam oven 2x24 jam
yang lalu. Hasil dari biakan kami mengalami pertumbuhan pada pengenceran 10 -2
dan 10-6 , sedangkan pada pengenceran 10-4 tidak mengalami pertumbuhan. Maka
dari itu kami memindahkan cawan yang berisi bakteri maupun yang tidak
Di dalam cawan tuang terdapat jumlah bakteri yang beragam. Pada
pengenceran 10-2 , cawan berisi bakteri dan terdapat kontaminan. Hal ini bisa
disebabkan karena kami kurang aseptis dalam mengisolasi biakan ke dalam cawan
tuang. Selanjutnya , cawan yang berisi biakan pada pengenceran 10-4 mengalami
pertumbuhan sedikit setelah di masukkan ke dalam box. Sedangkan pada

31
pengenceran 10-6 pertumbuhan bakteri dalam cawan sangat banyak. Karena
pengenceran 10-4 dan pengenceran 10-6 jumlah bakteri kurang memenuhi syarat ,
maka kami memilih pengenceran 10-2 untuk penghitungan jumlah bakteri dalam
colony counter.
Hasil yang didapat pada pengenceran10-4 dan 10-6 tidak sesuai dengan
prinsip pengenceran seperti yang dikatakan oleh Ferdias (1992), yaitu semakin
banyak jumlah pengenceran yang dilakukan, semakin sedikit jumlah mikroba
yang tumbuh. Seharusnya jumlah bakteri pada pengenceran 10-4 lebih banyak
dibandingkan dengan jumlah bakteri pada pengenceran 10-6 karena suspensi
yoghurt dari pengenceran 10-4 lebih besar konsentrasinya dibanding pengenceran
10-6.
Kesalahan tersebut bisa saja disebabkan oleh kesalahan yang terjadi saat
proses praktikum, baik pada saat melakukan pengenceran, maupun pada saat
penghomogenan suspensi dengan media di cawan petri.
Bentuk elevasi pada koloni cawan tuang memiliki bentuk yang bundar,
berwarna putih kekuningan, memiliki tepian yang licin dan memiliki elevasi
timbul pada permukaan media NA.

Gambar 1.5 Pengenceran 10-2 Gambar 1.6 Pengenceran 10-4

32
 Gambar 1.7 Pengenceran 10-6
Untuk metode cawan gores, hasil pengenceran yang digunakan adalah 10-
2
, karena pada pengenceran tersebutlah yang jumlah koloninya memenuhi syarat
untuk diambil koloninya dan diisolasi di cawan gores.
Seperti pada gambar di bawah ini adalah hasil yang didapatkan dalam
colony counter sebanyak 70. Dalam penghitungan dijabarkan sebagai berikut :
1
Koloni per ml = x jumlah koloni per cawan
faktor pengenceran
1
= 10−2 x 70 koloni

= 70 x 102 koloni/ml

Gambar 1.8 Perhitungan Bakteri Pada Colony Counter

Sebelum melakukan penggoresan pada cawan gores, kami mengecek
koloni bakteri yang terdapat pada cawan tuang, dan setelah dicek pada mikroskop,
bakteri yang ditemukan adalah Streptococcus thermophilus.

Gambar 1.9 Hasil bakteri Streptococcus pada cawan tuang

E. Cawan Gores

33
 Isolasi mikroba dengan cara penggoresan (spred plate). Tujuan utama dari
penggoresan ini adalah untuk menghasilkan koloni-koloni bakteri yang terpisah
dengan baik dari suspensi sel yang pekat. Cara ini lebih menguntungkan bila
ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tapi memerlukan keterampilan yang
diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni
yang terpisah. Cara penggoresan dapat dilakukan dengan cara ujung kawat
imokulasi yang membawa bakteri digesekkan atau digoreskan dengan bentuk zig-
zag pada permukaan agar-agar dalam cawan Petri sampai meliputi seluruh
permukaan. Untuk memperoleh hasil yang baik diperlukan keterampilan, yang
biasanya diperoleh dari pengalaman. Metode cawan gores yang dilakukan dengan
baik kebanyakan akan menyebabkan terisolasinya mikroorganisme yang
diinginkan. Dua macam kesalahan yang umum sekali dilakukan adalah tidak
memanfaatkan permukaan medium dengan sebaik- baiknya untuk digores
sehingga pengenceran mikroorganisme menjadi kurang lanjut dan cenderung
untuk menggunakan inokulum terlalu banyak sehingga menyulitkan pemisahan
sel-sel yang digores (Suriawiria,2005).
Teknik streak plate (cawan gores) adalah suatu teknik di dalam
menumbuhkan mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menstreak
(menggores) permukaan agar dengan jarum ose yang telah diinokulasikan dengan
kultur bakteri. Dengan teknik ini mikroorganisme yang tumbuh akan tampak
dalam goresan-goresan inokulum bekas dari goresan ose . Cara ini dilakukan
dengan membagi cawan petri menjadi 4 sektor .Ose steril yang telah disiapkan
dilekatkan pada sumber isolat, kemudian menggoreskan ose tersebut pada cawan
berisi media steril. Goresan dapat dilakukan 3-4 kali membentuk garis horisontal
di satu sisi cawan. Ose disterilkan lagi dengan api bunsen, setelah kering ose
tersebut digunakan untuk menggores goresan sebelumnya pada sisi cawan kedua.
Langkah ini dilanjutkan hingga keempat sisi cawan tergores. Pada metode ini,
goresan di sisi pertama diharapkan koloni tumbuh padat dan berhimpitan,
sedangkan pada goresan sisi kedua, koloni mulai tampak jarang dan begitu pula
selanjutnya, sehingga didapatkan koloni yang tampak tumbuh terpisah dengan
koloni lain. Seluruh proses dilakukan secara aseptik agar tidak terjadi

34
kontaminasi. Kami melakukan metode cawan gores pada dua cawan petri
kemudian diinkubasi selama 2 hari ( 2 x 24 jam ).

Gambar 1.10 Gambar 1.11

Proses isolasi cawan gores
Hasil yang didapatkan setelah 2 hari diinkubasi adalah pada cawan petri A
koloni tumbuh pada semua sektor sedangkan pada cawan petri B koloni yang
tumbuh hanya pada sektor 0, hal ini disebabkan karena pada saat menggoreskan
biakan ose kurang menyentuh nutrient agar.
Bentuk elevasi pada koloni cawan gores memiliki bentuk yang tak
beraturan, berwarna putih kekuningan, memiliki tepian yang licin dan memiliki
elevasi timbul pada permukaan media NA.

Gambar 1.12 Gambar 1.13

Hasil cawan gores cawan petri A Hasil cawan gores cawan petri B

F. Agar Miring
Agar nutrient miring berfungsi untuk menumbuhkan dan menumbuhkan
dan menyimpan biakan murni sebagai stok biakan murni. Agar nutrient miring

35
diletakan miring karena berfungsi untuk memperluas permukaan sehingga banyak
bakteri yang tumbuh. Keuntungan media agar miring ini adalah luas permukaan
yang kecil sehingga peluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang
untuk digunakan strain murni (indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya
memuat sedikit mikroorganisme. Media agar untuk bakteri digunakan media NA
(Nutrien agar) karena yang komposisinya ekstrak daging sapi didalamnya
mengandung protein, karbohidrat, vitamin dan sedikit lemak juga terdapat adanya
beberapa factor pertumbuhan yang tidak mampu mensintesis mikroorganisme,
(Waluyo,L,2005).
Bahan pembuatan untuk agar nutrient miring adalah agar nutrient merupakan
bahan umum.setelah agar nutrient mendidih harus siap diletakkan 6 ml ke dalam
tiap tabung reaksi dengan cepat agar menghindari agar cepat beku supaya tidak
sulit ketika dimasukan. Setelah itu tabung reaksi ditutup dan dimiringkan. Jika
media agar miring telah beku maka agar miring siap digoreskan dengan
menggunakan ose. Sebelum melakukan pengambilan inokulum dari hasil metode
cawan gores mula-mulanya kami mengecek keadaan media agar miringnya dan
kami memastikan tidak ada kontaminan di dalam agar tersebut. Setelah
memastikan bahwa media agar miting tidak terjadi kontaminan maka kami mulai
melakukan pemindahan bakteri dari cawan gores ke agar miring dengan
menggunakan ose kemudian kami menggoreskan agar miring dengan pola zig zag.
Arah zigzag di gunakan supaya memungkinkan koloni terbentuk tersebar merata
dan tampak jelas serta tidak bertumpuk dari koloni yang akan terbentuk. Kami
melakukan penggoresan pada agar miring dengan aseptis (dekat dengan bunsen)
setelah selesai mulut tabung reaksi dipanaskan di bunsen kemudian sumbat mulut
tabung reaksi dengan menggunakan kapas supaya tidak ada mikroorganisme lain
yang masuk dalam media agar miring.

36
 Gambar 1.14 Gambar 1.15
Proses isolasi agar miring

Hal ini bertujuan agar kecil kemungkinan terjadinya kontaminasi. Setelah

selesai agar miring disimpan di tempat inkubasi selama 2 hari (2 x 24 jam).
Setelah 2 hari hasil yang didapatkan adalah terdapat bakteri yang tumbuh pada
media agar miring.

Gambar 1.16 Agar Miring

G. Pewarnaan
Mikroba yang ada di alam ini mempunyai morfologi, struktur dan sifat-
sifat yang khas, begitu pula dengan bakteri. Bakteri yang hidup hampir tidak
berwarna dan kontas dengan air, dimana sel-sel bakteri tersebut disuspensikan.
Salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk
diidentifikasi ialah dengan metode pengecatan / pewarnaan. Hal tersebut berfungsi

37
untuk mengetahui sifat fisiologisnya yang mengetaui reaksi dinding sel bakteri
melalui serangkaian pengecatan.
Berbagai macam tipe morfologi bakteri ( kokus, basil, spirillum dan
sebagainya) :
Bakteri berbentuk bulat ( bola )
Bakteri bulat dinamakan juga kokus (coccus) dapat dibedakan atas :
a.Monokokus : Bakteri yang berbentuk bola tunggal,misalnya neisseria
gonorrhoeae,penyebab penyakit kencing nanah.
b.Diplokokus : Bakteri berbentuk bola yang bergandengan dua–dua,
c.Sarkina : Bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat- empat,sehingga
bentuknya mirip kubus.
d.Sterpkokus : Bakteri bentuk bola yang berkelompok memenjang membentuk
rantai.
e.Stafilokokus : Bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelompok
sel tidak teratur,sehingga bentuknya mirip dongkolan buah anggur.
Bakteri berbentuk batang
Bakteri berbentuk batang dinamakan basilus (bacillus yang berarti batang).
Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas :
a.Basil tunggal : Bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal misalnya
salmonella typhi,penyebab penyakit tifus.
b.Diplobasil : Bakteri berbentuk batang yang bergandengan dua–dua.
c.Sterptobasil: Bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang
membentuk rantai misalnya bacillus anthracis,penyebab penyakit antraks.
Bakteri berbentuk melilit,yang dinamakan spirillum atau spiral. Ada 3 macam
bentuk spiral,yaitu sebagai berikut :
a.Spiral:golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral,misalnya spirillum. Sel
tubuhnya umumnya kaku.
b.Vibrio atau bentuk koma yang dianggap sebagai bentuk spiral tak
sempurna,misalnya vibrio cholerae. Penyebab penyakit kolera.
c.Spirochaeta:golongan bakteri berbentuk spiral yang bersifat lentur pada saat
bergerak,tubuhnyan dapat memenjang dan mengerut (Drs.Koes Irianto,2006;56).

38
Berbagai macam morfologi pewarnaan ini dapat dibedakan dengan menggunakan
pewarnaan. Dalam praktikum,ada 3 macam perwarnaan yang dilakukan antara
lain :
 Pewarnaan Negatif
Pewarnaan negatif bukan digunakan untuk mewarnai bakteri tetapi
mewarnai latar belakangnya menjadi hitam gelap. Zat warna tidak akan mewarnai
sel melainkan mewarnai lingkungan sekitarnya, sehingga sel tampak transparan
dengan latar belakang hitam. Pewarnaan negatif atau pewarnaan asam dapat
terjadi karena senyawa pewarna bermuatan negatif. Dalam kondisi pH mendekati
netral, dinding sel bakteri cenderung bermuatan negatif sehingga pewarna asam
yang bermuatan negatif akan ditolak oleh dinding sel. Oleh karena itu, sel menjadi
tidak berwarna. Contoh pewarna yang bisa digunakan yaitu tinta cina, larutan
nigrosin, asam pikrat dan eosin. Teknik ini digunakan untuk menentukan
morfologi dan ukuran sel. Pada pewarnaan ini olesan tidak mengalami pemanasan
atau perlakuan yang keras dengan bahan-bahan kimia, maka terjadinya
penyusutan dan salah satu bentuk agar kurang sehingga penentuan sel dapat
diperoleh dengan lebih tepat. Metode ini menggunakan cat nigrosin atau tinta cina
(Hadiotomo, 1990).
Dengan menggunakan teknik pewarnaan negatif, dimana hanya
lingkungannya yang diwarnai, terdapat bakteri pada kotoran tesebut berbentuk
coccus.
Faktor yang mempengaruhi pewaraan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Suatu
preparat yang sudah suatu zat warna, kemudian dicuci dengan asam encer.bakteri-
bakteri seperti ini dinamakan bakteri tahan asam, dan hal ini merupakan ciri yang
khas bagi suatu spesies.

Gambar 1.17 Proses perwarnaan negatif

39
 Pada saat mertakan tinta di objek glas menggunakan tepi pada objek glass
tersebut. Rata atau tidaknya bakteri itu tergantung pada keampuan mahasiswa
dalam meratakannya, juga mengenai cepat lambatnya ditemukan bakteri
tergantung skill mahasiswa dalam penggunaan mikroskop.

Gambar1.18 Pewarnaan Negatif bakteri Streptococcus thermophilus

Gambar diatas merupakan Streptococcus thermophilus pada pewarnaan
Negatif yang ditemukan dibawah mikroskop perbersaran 1000x, Pengamatan
diawali dengan mengoleskan isolat bakteri (Streptococcus thermophilus) dengan
tujuan agar isolat bakteri dapat merata dikaca preparat dan meneteskan aquades
steril, dan diberi zar warna nigrosin dioleskan keseluruh kaca preparat. Tujuan di
beri zat warna nigrosin adalah untuk mempermudah melihat bakteri. Kemudian
difiksasi, tujuan melalukan fiksasi adalah melekatkan mikroorganisme di kaca
preparat. Pengamatan bisa dilakukan dengan perbesaran 40-1000x pada
perbesaran 40-100x hanya untuk menfokuskan garis tepi , diperbesaran 400-1000
sudah terlihat bakteri Streptococcus thermophilus . Diperbesaran 400 kurang
begitu jelas kemudian pada perbesaran 1000x terlihat jelas bentuk dari bakteri
Streptococcus thermophilus yang memiliki morfologi benbentuk bola/ bulat
(coccus) dan bakteri bentuk bola yang berkelompok memenjang membentuk
rantai (streptococcus)
 Pewarnaan Sederhana
Pewarnaan sederhana merupakan pewarnaan yang paling umum
digunakan. Berbagai macan tipe morfologi bakteri (coccus, bacillus, spirilum,

40
dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu
mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja.
Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarnaan-pewarnaan
sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-
zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin
(komponen kromotofiknya bermuatan positif).
Pada pewarnaan sederhana, bakteri diwarnai oleh reagen tunggal.
Pewarnaan dasar dengan kromogen (zat warna) muatan positif disarankan selama
asam nukleat bakteri dan komponen dinding sel membawa muatan negatif yang
menyerap dengan kuat dan mengikat kation kromogen perlu diperhatikan lamanya
waktu pewarnaan tergantung pada jenis pewarnaan yang digunakan. Misalnya
metilen blue terserap selama 2-3 menit, dengan demikian bakteri yang terdapat
pada sampel akan menyerap zat warna yang diberikan. Pengecetan sederhana
digunakan untuk memperlihatkan atau memperjelas kontras antara sel dan latar
belakangnya sehingga dapat mempertajam bentuk dari sel-sel mikroba itu sendiri,
dengan cara mewarnai sel-sel mikroba dengan zat warna khususnya warna Kristal
Violet.

Gambar 1.19 Proses pengambilan bakteri dari agar miring

Gambar 1.20 Proses pewarnaan bakteri dengan methylene blue

41
 Gambar 1.21 Proses pewarnaan bakteri dengan karbol-fuchsin
Tujuan dari pewarnaan sederhana adalah mengidentifikasi morfologi sel
bakteri dengan menggunakan zat warna tunggal. Prinsipnya yaitu pewarnaan ini
hanya menggunakan satu macam zat warna saja. Sebelum zat warna difiksasi
terlebih dahulu pewarnaan ini dipakai untuk melihat bentuk-bentuk bakteri. Zat
warna yang di gunakan adalah Methylen blue, Crystal violet, basic fuchin atau
safranin. Fungsi zat warna: Crystal violet merupakan pewarna primer (utama)
yang akan memberi warna mikrioorganisme target. Crystal violet bersifat basa
sehingga mampu berikatan dengan sel mikroorganisme yang bersifat asam
(Sutedjo, 1991).

Gambar 1.22. Pewarnaan Sederhana dengan Methylene blue bakteri

Streptococcus thermophilus
Gambar di atas adalah bakteri Streptococcus thermophilus yang dilihat di
bawah mikroskop dengan perbersaran 400x. Hal pertama yang dilakukan adalah
sterilisasi kaca objek yaitu memberi alcohol 70 %.Tujuan disterilisasi adalah
untuk memusnahkan semua mikroorganisme. Kemudian mengoleskan bakteri

42
menggunakan ose. Ose harus di fiksasi di api pembakaran (spirtus) bertujuan
untuk mematikan bakteri. Kemudian melakukan pengolesan bakteri.
Pada praktikum proses fiksasi sangatlah penting. Fiksasi bertujuan agar
melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya. Kemudian
pemberian warna menggunakan Methylene Blue , zat warna tersebut bersifat
asam, Methylene Blue adalah pewarna yang biasa dipakai dalam pewarnaan
umum. Biasanya hanya membedakan sel bakteri dengan latar belakangnya.
Methylene Blue memberikan warna biru cera yang begradasi dari biru muda
sampai biru agak tua seperti pada gambar diatas. Bakteri di atas merupakan
streptococcus thermophiles yang tampak berbentuk bulat (kokus) yang
bergandengan membentuk rantai (streptococcus) metilen blue terserap selama 2-3
menit, dengan demikian bakteri yang terdapat pada sampel akan menyerap zat
warna yang diberikan seperti gambar diatas.

Gambar1.23 . Pewarnaan Sederhana dengan Karbol-fuchsin bakteri

Streptococcus thermophilus
Gambar di atas adalah bakteri Streptococcus thermophilus yang dilihat di
bawah mikroskop dengan perbersaran 400x. Bewarna merah karena menggunakan
Karbol-fuchsin. Hal pertama yang dilakukan adalah sterilisasi kaca objek sama
seperti pada bakteri pewarnaan sederhana dengan Methylene Blue ., hanya yang
beda pada pemberian warna. Pada pewarnaan sederhana ini menggunakan zat
warna Karbol-fuchsin yang mempunyai warna merah. Bakteri di atas merupakan
streptococcus thermophiles yang mempunyai morfologi tampak berbentuk bulat
(kokus) yang bergandengan membentuk rantai (streptococcus)
 Pewarnaan Gram

43
 Pewarnaan Gram (metode Gram) adalah suatu cara untuk mewarnai sel
bakteri menggunakan zat warna berupa Gram, untuk lebih mudah
diamati dibawah mikroskop untuk mengetahui sifat fisiologisnya. Empat bahan
reaksi yang digunakan untuk pewarnaan Gram yaitu:
1. Carbol gentian violet, pewarna pertama (warna ungu).
2. Iodium, pewarna untuk mempertajam pewarna pewarna pertama (suatu
kompleks dengan crystal violet).
3. alkohol, penghilang warna.
4. Safranin, suatu counterstain.
Setelah melakukan berbagai proses pengecatan diatas maka bakteri dapat
dibagi menjadi dua katagori utama yaitu bakteri Gram positif dan bakteri Gram
negatif
a. Bakteri Gram Negatif
Bakteri gram negative adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat
warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram positif akan
mempertahankan warna ungu gelap setelah dicuci dengan alcohol, sementara
bakteri gram negative tidak.
b. Bakteri Gram Positif
Bakteri gram positif adalah bakteri yang mempertahankan zat warna metil
ungu sewaktu proses pewarnaan Gram. Bakteri jenis ini akan berwarna biru atau
ungu di bawah mikroskop, sedangkan bakteri gram negative akan berwarna merah
muda. Perbedaan klasifikasi antara kedua jenis bakteri ini terutama didasarkan
pada perbedaan struktur dinding sel bakteri (Aditya,2010).

Gambar 1.24 Proses pengambilan bakteri dari agar miring

44
 Gambar 1.25 Proses pewarnaan bakteri dengan kristal violet dan iodin

Gambar 1.26 Proses pewarnaan bakteri dengan safranin

Gambar1.27 Pewarnaan Gram Positif pada Streptococcus thermopilus

Gambar di atas adalah Streptococcus thermopilus pada pewarnaan gram
positif di bawah mikroskop pada perbesaran 400x, Pada praktikum kali ini
dilakukan teknik pewarnaan yaitu pewarnaan pada bakteri. Diawali dengan
mengoleskan isolat bakteri (Streptococcus thermopilus) dengan tujuan agar isolat
bakteri dapat merata dikaca preparat. Lalu dilakukan fiksasi untuk melekatkan
mikroorganisme di kaca preparat. Sedangkan pemberian Iodium bertujuan untuk
memperkuat warna pada bakteri. Alkohol 96% berfungsi sebagai pemucat atau
peluntur warna pada bakteri. Dan tahap terakhir yaitu pemberian safranin yang
berfungsi untuk memberi warna kembali pada bakteri yang telah kehilangan
warna pada proses pemucatan dengan menggunakan alkohol. Pada bakteri di
preparat menunjukkan warna ungu. Hal ini membuktikan bahwa bakteri di

45
preparat merupakan bakteri gram positif dikarenakan pada bakteri ini
mengandung banyak peptidogligan sehingga mudah berikatan dengan kristal
ungu. Jika berwarna merah muda menunjukan bakteri gram negatif dikarenakan
pada bakteri tersebut mengandung banyak lipid sehingga mudah berikatan dengan
safranin.
Hasil uji bakteri agar miring atau Streptococcus thermopilus dapat
mempertahankan warna primernya walaupun mengalami dekolorisasi(pencucian)
ketika ditambahkan alkohol sehingga bakteri Streptococcus
thermopilus merupakan kelompok bakteri gram positif. Prinsip pewarnaan gram
didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel sehingga menyebabkan
perbedaan reaksi dengan perbedaan permeabilitas zat warna dan penambahan
larutan pencuci (Dwidjosapuro 2005).
BAB V
KESIMPULAN

1. Isolasi mikroba dilakukan untuk memisahkan atau memindahkan mikroba

tertentu dari lingkungannya, sehingga diperoleh kultur murni atau biakan
murni.
2. Beberapa cara yang dilakukan untuk mengisolasi mikrooraganisme antara cara
goresan (streak plate), cara taburan/tuang (pour plate), cara sebar (spread
plate), cara pengenceran (dilution plate) serta micromanipulator.
3. Streptococcus thermophilus adalah bakteri anaerob fakultatif gram positif.
Bakteri ini memiliki bentuk sel yang bulat atau elips dengan diameter 0,7-0,9
run, tumbuh secara berpasangan atau berbentuk rantai pendek. Suhu
pertumbuhan optimum untuk Streptococcus thermophilus adalah 37-42°C.

46
 DAFTAR PUSTAKA

Adams, M.R. 2000. Food Microbiology. University of Surrey. Guildford. New

York
Afrianto. 2004. Mikrobiologi Praktek (isolasi bakteri). PT. Gramedia : Jakarta
Amano, Rahayu E. 1962. Potensi Bakteri Asam Laktat di Bidang Industri Pangan.
Prosiding Seminar Ilmiah TahunanPerhimpunan Mikrobiologi
Indonesia
Anonim.2013. Bakteri Asam Laktat.
https://id.wikipedia.org/wiki/Bakteri_asam_laktat_html.
Diakses pada tanggal 15 November 2015.
Anonim. 2012. Mikrobiologi Teknik Isolasi.
http://disachem.blogspot.co.id/2012/04/laporan-mikrobiologi-teknik-
isolasi.html.
Diakses pada tanggal 15 November 2015
Anonim. 2014. Mikrobiologi Isolasi.
http://www.kimia.clas.web.id/2014/11/mikrobiologi-isolasi.html.
Diakses pada tanggal 16 November 2015
Belitz dan Grosch. 1987. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Fakultas MIPA.
Universitas Pendidikan Indonesia. Bandung

47
Buckle. 2007. MikrobiologiTerapan. Universitas Gajah Mada: Yogyakarta
Djoko. 2010.Isolasi Mikroorganisme.

http://jokodjozhu15.blogspot.co.id/2013/05/isolasimikroorganisme.html
Diakses pada tanggal 15 November 2015
Dwidjoseputro, S. 1992. Mikrobiologi Pangan. Gramedia Pustaka Utama. Jakarta.
Fardiaz, S.1992. Mikrobiologi Pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hasrah, Harris.2015. Isolasi Mikroba
http://hasrahhariss.blogspot.co.id/2015/09/isolasi-mikroba.html
Diakses pada tanggal 16 November 2015
Jutono. 1972. Dasar-dasar Mikrobiologi Umum. Departemen Mikrobiologi
Fakultas
Pertanian UGM. Yogyakarta
Plezar.2006. Dasar-Dasar-Mikrobiologi. Jakarta : UI Press
Soeharsono, Sardjono, Wibowo, Djoko, Margino, Sabastian, Rahayu, Endang,
Sutriswati. 2010. Mikrobiologi Pangan. Yogyakarta : Pusat Antar
Universitas-Pangan dan Gizi Universitas Gadjah Mada Press
Yazuro.2012. Inokulasi Bakteri.
http://yazura08.blogspot.co.id/2012/03/laporan-inokulasi-bakteri.html
Diakses pada tanggal 16 November 2015

48