PRAKTIKUM I

PENGENALAN BAHAN BERBAHAYA DAN

PENGGUNAAN ALAT LABORATORIUM

Latar Belakang
Pengenalan bahan yang berbahaya dan alat yang sering digunakan dalam mengerjakan
penelitian yang berhubungan dengan analisis molekuler kepada mahasiswa sangatlah penting
untuk memberikan pemahaman dan keterampilan dasar yang harus dimiliki mahasiswa.
Pengetahuan tentang penggunaan alat penting untuk menghindari terjadinya kesalahan yang
dapat merugikan pada saat penelitian. Keberhasilan dalam melakukan teknologi DNA
rekombinan harus disertai dengan kemampuan menggunakan alat yang memiliki ketelitian
yang sangat kecil (mikro) seperti pipet mikro. Selain itu, beberapa alat yang sering digunakan
dalam isolasi DNA dan analisis molekuler seperti sentrifuse, spektrofotometer, laminar,
timbangan analitik, gel elektroforesis dan thermocyclers/ thermal cycler.
Pengetahuan tentang bahan berbahaya di laboratorium memungkinkan untuk
menghindari kesalahan penggunaan bahan berbahaya yang berakibat terhadap kesehatan.
Pada dasarnya semua alat dan bahan serta larutan yang digunakan harus dalam keadaan steril.
Sterilisasi bahan dan alat dapat dilakukan dengan menggunakan autoclave pada suhu 120 ͦ C,
selama 20 menit. Keamanan pada saat bekerja di laboratorium disarankan untuk
menggunakan jas laboratorium.
Tujuan Praktikum
Tujuan praktikum ini yaitu untuk memberikan informasi kepada mahasiswa mengenai
bahan yang berbahaya yang digunakan dalam analisis molekuler. Selain itu, mahasiswa
mengetahui dan memahami cara penggunaan alat laboratorium yang biasa digunakan untuk
analisis molekuler. Serta mengetahui perhitungan dasar dalam membuat suatu larutan buffer
atau bahan kimia.
Bahan Berbahaya
Bahan berbahaya dalam praktikum atau penelitian yang berhubungan dengan analisis
DNA atau RNA : Phenol, Ethidium Bromide, DEPC (Diethyl pyrocarbonate), Ether, Asam
pekat (asam asetat, HCl, dll). Bahan-bahan berbahaya tersebut harus dihindarkan dari
sentuhan kulit. Apabila kulit tersentuh dengan bahan berbahaya tersebut, basuhlah dengan air
sampai bersih (hindari mengelap langsung dengan kertas atau kain). Bahan-bahan kimia yang
berbahaya dapat diambil dengan pipet yang dilengkapi dengan alat pembantu pengisapan
(hindari mengisap pipet dengan mulut untuk mengambil cairan kimia). Berikut beberapa
simbol yang terdapat pada bahan berbahaya di laboratorium.
 Gambar 1. Simbol Bahan Kimia
Cara Penggunaan Alat
1. Pipet Mikro
Analisis mikro merupakan analisis yang banyak digunakan dalam penelitian
laboratorium Bioteknologi. Salah satu alat yang banyak digunakan dalam analisis mikro
adalah pipet mikro. Pipet mikro sangat diperlukan untuk mengambil larutan atau suspensi
dengan ketepatan yang tinggi dan volume yang relatif kecil. Pipet mikro dibedakan
berdasarkan kisaran volume yang tercantum (P2 μl, P10 μl, P100 μl, P200 μl, P500 μl,
P1000 μl, P5000 μl). Angka yang tercantum di pipet mikro menunjukkan volume maksimum
yang dapat diambil. Berikut contoh gambar dari pipet mikro bisa dilihat pada Gambar 2.

Gambar 2. Pipet Mikro

Pipet mikro digunakan sesuai dengan kebutuhan dan penggunaannya berdasarkan
volume cairan yang akan diambil. Misalnya, apabila ingin mengambil larutan dengan volume
70 μl maka pipet mikro yang digunakan yaitu P100 μl. Pengambilan volume sebanyak 70 μl
juga dapat menggunakan pipet mikro dengan volume P200 μl dan P1000 μl, namun hasilnya
kurang akurat. Selain itu, juga dapat digunakan pipet mikro dengan volume P2 μl atau P10 μl,
tetapi akan mengakibatkan kesalahan yang cukup besar karena pengambilan akan dilakukan
berulang kali. Hindari pengambilan yang berulang-ulang untuk menghindari kesalahan dalam
pemipetan.
Pipet mikro dilengkapi dengan ujung pipet (tip). Tip dibedakan berdasarkan volume
yang dapat ditampung oleh pipet mikro. Pada umumnya, setiap jenis tip memiliki warna yang
berbeda sesuai dengan volume pipet mikro. Terdapat 3 warna yang berbeda yaitu biru,
kuning dan jernih (putih). Tip yang berwarna biru biasanya digunakan untuk P500 μl dan
P1000 μl. Tip yang berwarna kuning digunakan untuk P20 μl, P100 μl dan P200 μl. Tip yang
berwarna jernih (putih) digunakan untuk P2 μl dan P10 μl. Pengambilan larutan dengan
menggunakan tip yang dalam keadaan steril/bersih. Gambar 3 menunjukkan salah satu contoh
gambar dari tip yang digunakan untuk pipet mikro.

Gambar 3. Tip Pipet Mikro

Prosedur pemakaian pipet mikro :
1. Pipet mikro mempunyai skala (ukuran) yang bisa diubah dengan cara memutar. Ukuran
yang tertera pada pipet mikro terdiri dari 3 digit. Contoh, untuk pipet mikro ukuran 20 μl
maka digit pertama untuk puluhan, digit kedua untuk satuan dan digit ketiga untuk
desimal. Atur skala pipet mikro berdasarkan jumlah cairan yang akan diambil,
- Ambil larutan air dengan volume 150 μl
- Ambil larutan air dengan volume
2. Memasukkan tip ke ujung pipet. Jenis tip yang digunakan berdasarkan ukuran pipet mikro,
3. Pengambilan cairan dengan menggunakan pipet mikro dilakukan dengan menekan
(tekanan pertama) bagian atas pipet mikro sebelum menyentuh cairan, setelah ujung tip
menyentuh cairan penekanan dilepas secara perlahan-lahan sehingga cairan tersedot,
4. Melepaskan cairan dari ujung tip dilakukan dengan menempelkan ujung tip pada
permukaan tabung kemudian dilakukan penekanan (sampai tekanan kedua) pada bagian
atas pipet secara perlahan,
5. Melepaskan tip pipet mikro dengan cara menekan bagian belakang pipet.

Gambar 4. Bagian-Bagian Pipet Mikro

2. Sentrifuse
Sentrifuse merupakan alat yang digunakan untuk mengendapkan suatu zat terlarut
seperti DNA, RNA, sel dengan komponen penyusunnya. Prosedur umum yang perlu
diperhatikan dalam menggunakan sentrifuse yaitu kesetimbangan dari alat dan bahan yang
akan disentrifugasi. Pemilihan jenis sentrifuse ditentukan dengan tujuan pemakaian. Cairan
yang mempunyai volume sedikit (kurang dari 1,5 ml) disentrifugasi menggunakan sentifuse
mikro (microcentrifuge). Sentrifuse mikro juga dapat dibedakan ke dalam sentrifuse yang
berpendingin (refrigerated microcentrifuge) dan tidak berpendingin. Mikrosentrifuse dapat
dibedakan berdasarkan kecepatan putaran rotornya. Semakin cepat putarannya maka
kemampuan suatu partikel untuk mengendap semakin mudah. Kecepatan suatu putaran
(khususnya sentrifuse) diukur dengan satuan x g (gravitasi) atau rpm (putaran per menit).
 Sentrifuse makro merupakan sentrifuse yang bisa memisahkan molekul dengan jumlah
cairan lebih dari 10 ml. Sentrifuse makro dibedakan ke dalam sentrifuse berpendingin dan
tidak berpendingin. Sentrifuse makro juga dibedakan berdasarkan kecepatan putaran
maksimum rotornya. Sentrifuse dengan kecepatan tinggi disebut sentrifuse ultra
(ultracentrifuge) yang biasanya berpendingin. Berikut dapat dilihat Gambar 5 yang
menampilkan gambar sentrifuse.

Gambar 5. Sentrifuse
Prosedur pemakaian sentrifuse :
- Pastikan sambungan listrik telah terhubung dengan sentrifuse
- Tekan saklar “Power” untuk menghidupkan sentrifuse
- Tekan “Door” untuk membuka sentrifuse
- Masukkan sampel ke dalam sentrifuse dalam keadaan seimbang, baik dari segi posisi
penempatan sampel dan volume sampel
- Sentrifuse ditutup “Lock”, dengan memutar penutup sentrifuse sesuai dengan tanda panah
yang ada (pastikan penutupnya sudah tertutup rapat “Lock”)
- Pada menu layar tekan “Select” kemudian tentukan berapa besar angka rpm (12.000 rpm)
- Tekan “Select” kemudian tentukan suhu yang digunakan (4 C)
- Tekan “Select” kemudian tentukan timer yang dibutuhkan (15 menit)
- Tekan “Star” untuk memulai proses pemisahan molekul
- Setelah selesai, pastikan angka rpm menunjukkan angka nol
- Tekan “Door” untuk membuka penutup sentrifuse
- Angkat sampel yang sudah dipisahkan di dalam sentrifuse
- Tekan saklar “Power” untuk mematikan sentrifuse
3. Laminar Air Flow
Laminar Air Flow (LAF) merupakan ruang steril yang memiliki dua tipe aliran udara
yaitu horizontal dan vertikal untuk menjaga kondisi dalam ruangan tetap steril. Aliran udara
pada laminar mengarah ke spesimen dan jauh dari pengguna, sehingga memberikan
perlindungan tertinggi kepada pengguna yang rentan terhadap kontaminasi dari udara yang
dihasilkan saat menangani patogen berbahaya, bakteri, virus dan lain-lain. Selain itu,
menghindari kontaminasi pada spesimen yang dikerjakan dari patogen tertentu yang bisa
terkontaminasi melalui udara. Penggunaan Laminar Air Flow harus dipisahkan bagi
pekerjaan yang membutuhkan sterilitas tinggi (seperti kultur sel dan kultur jaringan) dengan
Laminar Air Flow yang digunakan dalam pekerjaan menggunakan mikroba (bakteri, jamur,
virus) untuk mencegah terjadinya kontaminasi.

Gambar 6. Laminar Air Flow

Prosedur penggunaan Laminar Air Flow (LAF) untuk bakteri dan yeast :
- Pastikan sambungan listrik telah terhubung dengan LAF
- Dianjurkan untuk menyalakan lampu UV 30 menit sebelum pekerjaan inokulasi dimulai.
Caranya dengan menekan tombol UV yang ada dibagian atas depan LAF
- Tekan lampu penerang melalui tombol LAMP
- Buka kaca LAF dengan mengangkat handle ke atas
- Semprot bench/meja kerja dengan alkohol 70%, kemudian usap dengan tissue
- Masukan media, bahan, dan alat-alat untuk pekerjaan inokulasi ke atas meja steril
- Setelah selesai, pindahkan ke luar semua bahan dan barang dari meja serta bersihkan
selalu kotoran seperti tumpahan media atau media agar sehingga meja selalu steril
- Sekali lagi semprot meja LAF dengan alkohol 70%, usap dengan tissue
- Matikan lampu dan fan, kemudian tekan lampu UV selama 30 menit
- Isi LOGBOOK
Prosedur penggunaan Laminar sederhana di laboratorium :
- Semprot bench/meja kerja dengan alkohol 70%, kemudian usap dengan tissue
- Alat yang ada di laminar harus tetap berada di dalam laminar
- Masukkan cawan petri ke dalam laminar, sebelum itu disemprot menggunakan alkohol
- Melakukan inokulasi bakteri
- Keluarkan alat dan bahan yang sudah digunakan dalam laminar
- Semprot bench/meja kerja dengan alkohol 70%, kemudian usap dengan tissue
4. Spektrofotometer UV /VIS
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur absorban suatu sampel dengan
menggunakan panjang gelombang. Spektrofotometer UV-Vis merupakan gabungan antara
spektrofotometer UV dan Visible. Spektrofotometer UV-Vis merupakan teknik analisis
spektroskopik yang memakai sumber REM (radiasi elektromagnetik) ultraviolet dekat (190-
380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai instrumen spektrofotometer.
Spektrofotometer UV-Vis menggunakan dua buah sumber cahaya yaitu sumber cahaya UV
dan sumber cahaya Visible. Larutan yang dianalisis diukur melalui serapan sinar ultra violet.
Konsentrasi larutan yang dianalisis akan sebanding dengan jumlah sinar yang diserap oleh zat
yang terapat dalam larutan tersebut. Spektrofotometer UV-Vis melibatkan energi elektronik
yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih
banyak dipakai untuk analisis kuantitatif DNA/RNA dibandingkan analisis kualitatif
DNA/RNA.
 Gambar 7. Spektrofotometer UV-Vis

 Bagian-bagian Spektrofotometer UV-Vis :

a. Sumber cahaya
Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki pancaran radiasi yang stabil dan
intensitasnya tinggi. Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam :
- Lampu Tungsten (Wolfram) : Lampu ini digunakan untuk mengukur sampel pada
daerah tampak. Bentuk lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa. Memiliki
panjang gelombang antara 350-2200 nm. Spektrum radiasianya berupa garis lengkung.
Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian
- Lampu Deuterium : Lampu ini dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm.
Spektrum energi radiasinya lurus dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak
pada daerah UV. Memiliki waktu 500 jam pemakaian.
b. Monokromator
Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi cahaya
tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu. Bagian-bagian
monokromator yaitu :
- Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya
didapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis
- Grating (kisi difraksi) memberi keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi
sinar akan disebarkan merata dengan pendispersi yang sama. Hasil dispersi akan lebih
baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum
- Celah optis digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis dari sumber radiasi.
Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui
prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan
- Filter berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan
merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih
c. Kompartemen sampel
Kompartemen sampel digunakan sebagai tempat diletakkannya kuvet. Kuvet merupakan
wadah yang digunakan untuk menaruh sampel yang akan dianalisis. Pada spektrofotometer
double beam, terdapat dua tempat kuvet. Satu kuvet digunakan sebagai tempat untuk
menaruh sampel, sementara kuvet lain digunakan untuk menaruh blanko. Sementara pada
spektrofotometer single beam, hanya terdapat satu kuvet.
Kuvet yang baik harus memenuhi beberapa syarat sebagai berikut :
- Permukaannya harus sejajar secara optis
- Tidak berwarna sehingga semua cahaya dapat ditransmisikan
- Tidak ikut bereaksi terhadap bahan-bahan kimia
- Tidak rapuh
- Bentuknya sederhana
d. Detektor
Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan. Sinar kemudian diubah
menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder dan ditampilkan dalam bentuk
angka-angka pada reader (komputer).
e. Visual display
Merupakan sistem baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik dalam bentuk %
transmitan maupun absorbansi.
 Instruksi Kerja Spektrofotometer UV-Vis :
a. Cara menghidupkan
- Hubungkan alat Spektrofotometer UV-VIS ke sumber listrik
- Tekan tombol “Power” berwarna di depan alat
- Tunggu hingga proses loading selesai dan layar monitor menunjukan menu utama
b. Cara menggunakan
- Masukkan cuvet blanko ke bagian belakang cuvet stand, dan cuvet sample ke bagian
depan cuvet stand (spektrofotometer double beam)
- Masukkan cuvet blanko ke bagian belakang cuvet stand, tekan tombol “auto zero”
sampai muncul nilai absorbansi 0,000. Selanjutnya masukkan cuvet sample, tekan
tombol “star” catat nilai absorbansi (spektrofotometer single beam)
- Pilih menu pengujian yang diinginkan dan lakukan pengaturan pengujian
c. Cara mematikan
- Tekan “return” hingga kembali ke layar utama
- Matikan alat dengan menekan tombol “Power” pada bagian depan alat
 Gambar 8. Bagian-Bagian Spektrofotometer
5. Thermocyclers/ Thermal Cycler
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk menggandakan
suatu nukleotida secara in vitro. Empat komponen utama yang harus terdapat pada proses
PCR yaitu DNA cetakan, Primer, dNTP, Enzim DNA polimerase. Thermal Cycler
merupakan suatu alat yang digunakan dalam proses PCR yang dapat mengatur suhu sesuai
dengan urutan dan waktu yang diinginkan dalam tahapan penggandaan DNA secara in vitro.
Prosedur penggunaan Thermal Cycler :
- Membuat Reaction mixture
- Mesin thermal cycler dinyalakan dengan menekan tombol [ON]
- Tekan [OPEN] untuk memasukkan reaction mixture
- Mesin thermal cycler diatur agar dapat melangsungkan siklus PCR sebanyak yang
diinginkan
- Tampilan pada layar awal (home) yaitu [OPEN], [NEW]
- Membuat Folder untu kondisi PCR yang diinginkan :
 Tekan [NEW], Create folder “BIO”
 Input suhu, waktu dan berapa banyak siklus :
- Predenaturasi : 94 C, 5 menit
- Denaturasi : 94 C, 1 menit
- Annealing : 37 C, 3 menit
- Extension : 72 C, 2 menit
- Final Extension : 72 C, 5 menit
- Incubation : 20 C, 15 menit
 Tekan [SAVE] Contoh folder yang sudah dibuat “BIO”
- Membuat file dalam folder
 CREATE FILE
 Pilih folder yang telah dibuat sebelumnya misalnya “BIO”
 Tekan [OPEN]
 Tekan [NEW], Create file “ BIO1”
 Tekan [SAVE] “Yes” atau “Yes dan Run”
 Running
- Prosedur kalau kondisi PCR yang ingin digunakan sudah ada tersimpan dalam mesin
thermal cycler :
 Tekan [RUN]
 Pilih folder yang diinginkan misalnya “ABC”
 Tekan [OPEN]
 Pilih “ABC1”
 Tekan [OPEN]
 Tekan [STAR]
- Hasil PCR dapat divisualisasikan dengan menggunakan teknik elektroforesis.

Gambar 9. Thermal Cycler

6. Timbangan
Timbangan biasanya digolongkan berdasarkan kapasitas dan ketelitiannya. Timbangan
dengan ketelitian tinggi biasanya mempunyai kapasitas maksimum yang rendah, sebaliknya
timbangan dengan kapasitas maksimum tinggi mempunyai ketelitian rendah. Sebelum dan
sesudah penimbangan alat timbang harus dalam keadaan bersih. Penimbangan bahan kimia
sebaiknya diletakkan di atas kertas alumunium (aluminium foil) atau kertas minyak yang
bersih. Hindari meletakkan secara langsung bahan kimia di atas timbangan. Gunakan kertas
(aluminium foil) atau kertas minyak yang baru untuk setiap penimbangan. Alat bantu lain
yang bisa digunakan untuk mengambil bahan kimia berupa spatula harus dalam keadaan
bersih.

Gambar 10. Timbangan Analitik

7. Gel elektroforesis
Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan
listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk
dan ukuran . Elektroforesis dapat digunakan untuk pemisahan makromolekul (protein dan
asam nukleat). Posisi molekul yang memisah pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk
mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. Gel
poliakrilamida dan agarosa untuk pemisahan protein dan DNA. Penggunaan alat yang harus
diperhatikan kabel yang dihubungkan langsung dengan kutub negatif (hitam) dan kutub
positif (merah).

Gambar 11. Elektroforesis DNA dan Protein