Aplicación medica de la citogenética : cariotipo, cromatina sexual, FISH,

CGH
Cariotipo :
Es el ordenamiento de los cromosomas de una célula metafásica de acuerdo a su tamaño
y morfología. El cariotipo es característico de cada especie y, el humano tiene 46
cromosomas o 23 pares de cromosomas, organizados en 22 pares autosómicos y un par
sexual. (Hombre 46XY) (Mujer46 XX)

Los cromosomas son analizados en metafase.

Obtenidos de linfocitos, fibroblastos, células coriónicas, líquido
amniótico, células de médula ósea.
Detecta CNV mayores a 5-10 Mb.
Gran ventaja: determina alteraciones cromosómicas balanceadas
(translocaciones, inversiones)

Método de estudio del cariotipo

1. Toma de sangre periférica y separación de los glóbulos blancos (linfocitos T)
2. Incubación en presencia de productos que inducen a la mitosis (mitógenos), como
la fitohemoaglutinina. Los mitógenos se adicionan a las células para que éstas
crezcan adecuadamente hasta formar una monocapa. Después se recogen
separándolas del flask mediante un rascador.
3. Detención de la mitosis en la metafase (utilizando colchicina, que interfiere en la
polimerización de los microtúbulos del huso mitótico).
Tanto el paso de adición de mitógenos como la adición de colchicina son los pasos críticos
para el estudio del cariotipo.

4. Paso por un medio hipotónico que hace que las células se hinchen
5. Depositar una gota de la preparación entre porta y cubre (sobre el cual se hace
presión para dispersar los cromosomas)
6. Fijar, teñir y fotografiar los núcleos estallados (10-15; 30 en mosaicos). Se miran
de 10 a 15 núcleos porque puede haber muchos falsos positivos debido a que le
hemos añadido mitógenos (de manera que las células se dividen de forma rápida
y precipitada) y colchicina, los cuales pueden provocar mutaciones e
irregularidades en los cromosomas. Si los 10-15 núcleos no son iguales puede ser
debido a estas sustancias o a que nos encontremos delante de un organismo
mosaico (por lo que deberíamos mirar más núcleos)
7. Actualmente existen aparatos de captación y programas de análisis que elaboran
el cariotipo automáticamente con los datos obtenidos.
Es necesario realizar un recuento de, al menos, 12-25 células en metafase.
La poliploidía (más de dos conjuntos de cromosomas homólogos en las células) se produce
principalmente en las plantas. Ha sido de gran importancia en la evolución de estas según
Stebbins.
El término es principalmente usado cuando el número de cromosomas varía dentro del cruce
poblacional de especies. Esto puede también ser usado dentro de un grupo de especies
estrechamente relacionado.
Estas anomalías pueden ser numéricas (presencia de cromosomas adicionales) o
estructurales (translocaciones, inversiones a gran escala, supresiones o duplicaciones).

 Síndrome de Turner, donde solo hay un cromosoma X (45, X o 45 X0)

 Síndrome de Klinefelter, se da en el sexo masculino, también conocido como 47 XXY.
Es causada por la adición de un cromosoma X.
 Síndrome de Edwards, causado por una trisomía (tres copias) del cromosoma 18.
 Síndrome de Down, causado por la trisomía del cromosoma 21.
 Síndrome de Patau, causado por la trisomía del cromosoma 13.

Cromatina sexual:
Los Corpúsculos o cuerpos de Barr, también llamados cromatina sexual X, son una
masa heterocromática, plana y convexa, con un tamaño de 0,7x1,2 micras, que se
encuentran en el núcleo de las células somáticas de las hembras de algunos animales. Se
forman por la condensación de la cromatina sexual de uno de los cromosomas X, que se
inactiva debido al proceso llamado lionización en animales donde el sexo se determina con
la presencia o ausencia del cromosoma Y.
Fueron descubiertos por el canadiense Murray Barr y Ewart George Bertram en 1949,
quienes demostraron que es posible determinar genéticamente el sexo de un individuo
dependiendo de que exista o no esta masa de cromatina en la superficie interna de
la membrana nuclear (cromatina sexual).
El estudio de la cromatina sexual, en especial de células de la mucosa oral, nos permite
identificar la presencia del cromosoma X en recién nacidos con genitales externos no
definidos para obtener el diagnóstico de sexo en un individuo con Desórdenes del
desarrollo sexual.
De acuerdo con la hipótesis de Lyon (propuesta por Mary Lyon en 1966), uno de los dos
cromosomas X en cada célula somática femenina es genéticamente inactivo. El corpúsculo
de Barr representa el cromosoma X inactivo. Determinó 4 principios para la cromatina
sexual:

1. la cromatina sexual es genéticamente inactiva,

2. la inactivación ocurre al azar,
3. la inactivacion solo se presenta en células femeninas.
4. la inactivación ocurre en el día 16 del periodo embrionario.
FISH : Hibridación in-situ con fluorescencia : es una técnica citogenética de
marcaje de cromosomas mediante la cual estos son hibridados con sondas que emiten
fluorescencia y permiten la visualización, distinción y estudio de los cromosomas así como
de las anomalías que puedan presentar. Esta técnica permite la rápida determinación
de aneuploidías, microdeleciones, duplicaciones, inversiones, así como la adjudicación de
un marcador genético a un cromosoma (cartografía genética).

Los cromosomas que son usualmente analizados por FISH son los 13, 18, 21, X e Y, que
son los más propensos a sufrir anomalías.
La técnica FISH puede realizarse a los cromosomas en metafase o en interfase.
Los tipos de sondas usadas son:

 Los cósmidos son secuencias únicas que hibridan con fragmentos pequeños. Se
emplean en estudios de microdeleciones.
 Las sondas satélites están formadas por secuencias altamente repetidas que se
encuentran cerca de lo centrómeros. En la mayoría de los casos son específicas de
cada cromosoma. Se usan para determinar aneuploidias o para identificar el origen de
cromosomas marcadores.
 Las sondas completas consisten en la suma de varias sondas que hibridan en distintas
zonas del cromosoma y así marcar el cromosoma completo. Se usan para ver
translocaciones.
Varianes de Fish:
- FISH en hebra
- FISH inverso
- FISH ON A SHIP
- FISH multicolor
- FISH

Entre las anomalías cromosómicas que pueden ser analizadas, caben citarse:

 Anomalías numéricas.-

 Alteraciones en cromosomas sexuales: Alta frecuencia de mosaicismo en

pacientes implica que, en muchos casos, sólo se den defectos leves en el
desarrollo. Gran relevancia en Medicina Reproductiva por ir asociado, en mayor
o menor grado, a problemas de fertilidad. Tales son los casos de síndrome de
Klinefelter, trisomía X y monosomía X.
 Edad materna avanzada, aborto de repetición de causa desconocida y/o
fallo de implantación: Más de la mitad de los casos son debidos a alteraciones
en los cromosomas 13, 16, 18, 21, 22, X e Y. En estos casos, la selección de
aquellos embriones normales para los cromosomas citados, aumenta las
probabilidades de conseguir una gestación a término.
 Factor masculino grave: Con este estudio embrionario, se pueden evitar las
alteraciones cromosómicas surgidas en la descendencia de aquellos grupos de
pacientes con calidad seminal baja y que tienen que recurrir a la técnica de
microinyección intracitoplasmática del espermatozoide (ICSI).
 Anomalías estructurales.-
Surgen espontáneamente, en la mayoría de los casos, como consecuencia de un
fallo de meiosis durante la oogénesis o espermatogénesis, en los casos en que los
padres presentan cariotipos normales. Algunas veces, algún miembro de la pareja
puede ser portador de una anomalía estructural equilibrada, que podría transmitir a
su descendencia.
CGH.- Hibridación genómica comparada.- Consiste en el marcaje diferencial de los
cromosomas en metafase de nuestra muestra y de un control (por ejemplo un individuo
sano). Los coeficientes de fluorescencia a lo largo de la longitud de los cromosomas
proporcionan una representación citogenética del ADN relativa a la variación del
número de copias.
El objetivo de esta técnica es comparar de manera rápida y eficiente dos muestras
de ADN genómico derivado de dos organismos diferentes, que a menudo se relacionan
pues se sospecha que tienen diferencias ya sea en la ganancia o pérdida
de cromosomas completos o regiones subcromosomales (una porción del cromosoma).
Esta técnica originalmente se desarrolló para evaluar las diferencias entre los
complementos cromosómicos de un tumor sólido y el tejido normal y tiene una
resolución mejorada de 5-10 megabases en comparación con las técnicas tradicionales
de análisis citogenéticos de banda como giemsa y FISH, las cuales están limitadas por
la resolución del microscopio utilizado.
Esto se logra con el uso de la hibridación competitiva fluorescente in situ. En resumen,
implica el aislamiento de ADN de las dos fuentes a comparar, comúnmente la referencia
y una muestra, el etiquetado independiente de cada muestra de ADN con diferentes
fluoróforos (moléculas fluorescentes) de distintos colores (generalmente rojo y verde),
la desnaturalización del ADN para volverlo monocatenario y la hibridación de las dos
muestras resultantes en una proporción de 1:1 para una propagación normal de
cromosomas en metafase, a los cuales las muestras de ADN marcadas se unirán en su
locus de origen. A continuación, las señales fluorescentes de colores se comparan con
el uso de un microscopio de fluorescencia y un software, esto a la longitud de onda de
cada cromosoma para identificar las diferencias cromosómicas entre las dos muestras.
Una mayor intensidad de color proveniente de la muestra de prueba en una región
específica de un cromosoma indica la ganancia de material en esa región, mientras que
una mayor intensidad de color de la muestra de referencia indica la pérdida de material
en la muestra de ensayo en una región específica. Un color neutro (amarillo cuando las
etiquetas de fluoróforos son de color rojo y verde) indica que no hay diferencia entre las
dos muestras en esa región.
Esta técnica solo puede detectar anormalidades cromosómicas no balanceadas, debido
a que las anomalías cromosómicas equilibradas como lo son
las translocaciones recíprocas, las inversiones o los cromosomas anillo no afectan el
número de copias, que es lo que se detecta por medio de la tecnología CGH. Sin
embargo, el CGH permite la exploración de los 46 cromosomas humanos en una sola
prueba y la detección de deleciones y duplicaciones, en escala microscópica lo que
puede conducir a la identificación de genes candidatos para estudiarlos más a fondo
mediante otras técnicas citológicas.