PRÁCTICAS DE

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
(CURSO 2012–2013)
Prácticas de Microbiología Clínica (Curso 2012-2013) Organigrama

Distribución de las prácticas por días

Análisis de una Análisis de una

muestra de orina
Cuantitativo: siembra de Agar CLED
Lunes Cualitativo: siembra de Agar
Cromogénico y Agar de MacConkey
Antibiograma
muestra de faringe
Siembra de Agar Sangre
Siembra de Agar Salino Manitol

Cuantitativo: lectura
Cualitativo:
Identificación presuntiva de colonias
Martes
Tinción de Gram
Prueba de la oxidasa
Siembra en Agar de MacConkey
Observación de la aparición de halos
de hemólisis
Tinción de Gram a colonias aisladas en
Miércoles Agar Sangre y Agar Salino Manitol
Identificación de cocos Gram positivos
Siembra de Agar Sangre
Siembra de Agar Kligler Prueba de la catalasa Siembra de Agar Müeller-Hinton
Jueves Inoculación de API20E Inoculación de API STAPH Colocación de los discos
Inoculación de API STREP E-test

Lectura de Agar Kligler Lectura de API STAPH Lectura y medida de halos en

Lectura de API20E Lectura de API STREP discos
Viernes
Lectura del E-test
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NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA
LABORATORIO DE NIVEL DE BIOSEGURIDAD 2

Los agentes biológicos se clasifican en cuatro grupos de riesgo en función de:

ƒ Virulencia

ƒ Dosis infectiva del microorganismo

ƒ Disponibilidad de tratamiento

ƒ Modo de transmisión en el laboratorio

ƒ Riesgo de difusión en la comunidad

ƒ Viabilidad del microorganismo en el entorno

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GRUPO DE
PATOGENICIDAD EJEMPLOS
RIESGO
No suelen causar enfermedad en personas Escherichia coli
1 sanas Staphylococcus epidermidis
Causan infecciones moderadas o graves Bordetella pertussis
Las infecciones suelen tener buen pronóstico Clostridium tetani
Generalmente no se transmiten por vía aérea
2 Se suelen transmitir por contacto o ingestión
Haemophilus influenzae
Candida
Es difícil su propagación en la comunidad Virus del sarampión
Existen tratamiento y profilaxis eficaces Entamoeba histolytica
Causan infecciones graves Bacillus anthracis
Algunos se transmiten por vía aérea Mycobacterium tuberculosis
3 Pueden propagarse en la comunidad Virus de la hepatitis B
La terapia es de eficacia variable Leishmania donovani
Causan infecciones graves o muy graves Virus de la viruela
Muchos se propagan por vía aérea Virus de Marburg
4 Se propagan fácilmente en la comunidad Virus Ébola
La terapia no es muy eficaz
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TIPO DE
MICROORGANISMOS RIESGO PROVOCADO
LABORATORIO
GRUPO DE RIESGO INDIVIDUAL → BAJO BÁSICO
1 COLECTIVO → BAJO (Enseñanza)

GRUPO DE RIESGO INDIVIDUAL → MODERADO SEGURIDAD

2 COLECTIVO → MODERADO (Hospital)

INDIVIDUAL → ELEVADO ALTA SEGURIDAD

GRUPO DE RIESGO
(Diagnóstico
3 COLECTIVO → ELEVADO especializado)

INDIVIDUAL → ELEVADO MÁXIMA

GRUPO DE RIESGO SEGURIDAD
4 COLECTIVO → ELEVADO (Servicio estatal)
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MEDIOS DE CONTENCIÓN

Describen los métodos que hacen segura la manipulación de los agentes infecciosos en el
laboratorio.

Objetivo: reducir al mínimo la exposición del personal y del entorno a agentes

potencialmente patógenos.

Para la seguridad de los laboratorios de Microbiología Clínica son importantes tres

elementos de contención:

A) Barreras primarias: primera línea de protección (bata, guantes, gafas,

mascarillas, gorros, cabinas de seguridad biológica, etc.).

B) Barreras secundarias: normas que deben cumplirse para la construcción de

un laboratorio de Microbiología Clínica (alicatado, paredes, grifos, interruptores, aparatos
que generan ruido, aparatos que generan calor, etc.).

C) Procedimientos estándar: metodología de funcionamiento del laboratorio y de

la manipulación de las muestras clínicas.
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NIVELES DE BIOSEGURIDAD

NIVEL DE
MUESTRA CLÍNICA TIPO DE
BIOSEGURIDAD
SOSPECHOSA DE LABORATORIO
QUE DEBE
CONTENER RECOMENDADO PARA
TENER EL
MICROORGANISMOS SU ESTUDIO
LABORATORIO

GRUPO DE RIESGO 1 BÁSICO 1

GRUPO DE RIESGO 2 SEGURIDAD 2

GRUPO DE RIESGO 3 ALTA SEGURIDAD 3

GRUPO DE RIESGO 4 MÁXIMA SEGURIDAD 4

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GESTIÓN Y TRATAMIENTO DE LOS RESIDUOS

Objetos punzantes y cortantes

• Agujas, pipetas Pasteur, portaobjetos, vidrio roto, etc.
• Constituyen un claro riesgo de inoculación accidental de microorganismos.
• Se depositan en recipientes específicos resistentes a la punción y con cierre hermético.
• Es muy importante cerrar correctamente estos recipientes, que deben ser esterilizados en
autoclave o incinerados antes de desecharlos.

Líquidos infecciosos
• Deben recogerse en recipientes herméticos y esterilizados, sangre incluida, en autoclave.
• Esta práctica es también obligatoria cuando los residuos proceden de áreas de
micobacteriología y virología.

Residuos sólidos
• Muestras clínicas, medios de cultivo, depresores, tubos de plástico, tiras API, etc.
• Deben ser esterilizados en autoclave o incinerados antes de ser desechados.

Líquido sobrante de tinciones

• Debe ser recogido en garrafas de plástico (nunca tirar al fregadero).
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PRÁCTICAS A REALIZAR

ANÁLISIS Siembra de la muestra de orina

CUANTITATIVO L-1 (bote nº 2)
ORINA Agar CLED
Siembra de la muestra de orina
ANÁLISIS
(bote nº 1)
CUALITATIVO L-2 Agar Cromogénico
ORINA
Agar de MacConkey
Toma de muestra
L-3 Mucosa faríngea
ANÁLISIS
CUALITATIVO Siembra
MUCOSA L-4 Dos placas de Agar Sangre
FARÍNGEA
Siembra
L-5 Una placa de Agar Salino Manitol
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ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE ORINA

ANÁLISIS CUANTITATIVO

Conocer el número de microorganismos presentes en la muestra.

Se toma una cantidad conocida de orina y se siembra en un medio de cultivo específico. Se incuba 24
horas y se cuenta el número de colonias.

ANÁLISIS CUALITATIVO

Conocer qué microorganismos están presentes en la muestra.

Se siembran muestras de orina en diferentes medios de cultivo, tratando de obtener colonias aisladas.
Tras su estudio, se elegirá una colonia correspondiente a una enterobacteria.

La enterobacteria se identificará utilizando un sistema comercial: API 20E.

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ANÁLISIS CUANTITATIVO

FUNDAMENTO

En función del número de microorganismos presentes por mililitro de orina se establecerán

conclusiones acerca de posibles infecciones existentes en
el tracto urinario.

METODOLOGÍA

Sembrar una placa de agar CLED (agar cistina, lactosa,

deficiente en electrolitos).

La placa se siembra con asa estéril de plástico calibradas

(1 microlitro).

El asa se introduce verticalmente en la muestra (Bote nº 2)

correspondiente a la orina procedente del “chorro medio”.

Se hace una única estría diametral. Seguidamente, se realizan estrías en zig-zag perpendiculares a
la primera estría, tal como se esquematiza en la siguiente imagen.
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El asa toca el centro de la placa a partir del cual

El asa se introduce y se saca
el inóculo se extiende en forma de una línea
verticalmente del bote con orina
a lo largo del diámetro de la placa

Sin agregar más orina, con la misma asa

se hacen estrías sobre la placa cruzando
varias veces la línea del inóculo inicial
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AGAR CLED (CISTINA, LACTOSA, DEFICIENTE EN ELECTROLITOS)

Digerido pancreático de gelatina 4 g/L

Digerido pancreático de caseína 4 g/L
Extracto de carne 3 g/L
Lactosa 10 g/L
L-cistina 0,128 g/L
Azul de Bromotimol 0,02 g/L
Agar en polvo 15 g/L
Agua destilada 1L

pH: 7,3

Es un medio diferencial que favorece el crecimiento de todos los microorganismos existentes en la

orina. Debido a su deficiencia en electrolitos, no permite que las colonias de Proteus invadan la placa
de cultivo, lo que facilita el recuento.

La lactosa es el único carbohidrato presente. La cistina facilita el crecimiento de los coliformes

dependientes de ella.

El azul de bromotimol permite distinguir las colonias de bacterias fermentadoras de las que no lo son.
Los microorganismos fermentadores dan lugar a colonias de color amarilllo. Los no fermentadores
dan lugar a colonias de color claro o traslúcidas. La alcalinización del medio provoca la aparición de
un color azul intenso.
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ANÁLISIS CUALITATIVO

FUNDAMENTO

Sembrar una muestra de orina (Bote nº 1) en medios diferenciales. El tipo de colonia y su

pigmentación servirán para presuponer qué microorganismos pueden estar presentes.

METODOLOGÍA

Sembrar una placa de agar Cromogénico.

Sembrar una placa de agar de MacConkey.

Se utilizarán también las placas de agar CLED

empleadas en el análisis cuantitativo.

Dada la posible escasez de microorganismos presentes en orina, debe utilizarse un método de siembra
que pueda descargar un inóculo denso.

Con un asa de 10 µL se realizarán tres descargas (30 µL en total) en estrías paralelas en el sector 1.
Los sectores 2 al 7 se sembrarán arrastrando inóculo del sector anterior tal como se esquematiza en la
siguiente imagen.
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Técnica de siembra en placa por estrías cada 45º

1 3

6
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AGAR CROMOGÉNICO

El agar Cromogénico es un medio

diferencial, pero no selectivo.

El carácter diferencial se traduce

en que las colonias crecidas presentan
diferentes colores en función de su
capacidad para utilizar ciertos sustratos presentes en el
medio.

La presencia en las bacterias de enzimas específicas

(por ejemplo, β–galactosidasa, β-glucosidasa o triptófano
desaminasa) capaces de descomponer esos sustratos, provoca
la aparición de un color determinado (rosa, azul turquesa,
azul oscuro, verde, blanco, crema, etc.) unicamente en la
colonia a la que pertenece dicha bacteria.
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Técnica de siembra en placa por estrías continuas

Alumno A Alumno B

Dirección de la siembra Dirección de la siembra

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AGAR DE MACCONKEY
Fermentador
de lactosa
Peptona 20 g/L
Lactosa 10 g/L
Sales biliares 1,5 g/L
Cloruro sódico 5 g/L
Rojo neutro 0,030 g/L
Cristal violeta 0,001 g/L
Agar 15 g/L
Agua destilada 1L

pH: 7,1
No fermentador
Fermentador
fuerte de lactosa

El agar de MacConkey es un medio moderadamente selectivo y diferencial utilizado para la

recuperación de enterobacterias y bacilos Gram negativos entéricos relacionados.

Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y de algunas
Gram negativas exigentes. La lactosa es el único carbohidrato. Las bacterias fermentadoras de
lactosa formas colonias de diferentes tonos de rojo debido al viraje del indicador rojo neutro (rojo
a pH menor de 6,8) por la producción de ácidos mixtos. Las bacterias que no fermentan la lactosa
forman colonias incoloras o transparentes.
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ANÁLISIS DE UNA MUESTRA DE FARINGE

FUNDAMENTO

En el tracto respiratorio existe una abundante microbiota que se establece, normalmente, sin causar
daños al hospedador.

El objetivo de la práctica consiste en tomar una muestra del tracto respiratorio superior (faringe)
para tratar de identificar cocos Gram positivos.

METODOLOGÍA

Tomar una muestra de faringe con un hisopo estéril y la ayuda de un depresor también estéril.
Sembrar la muestra en dos placas (nº1 y nº2) de agar sangre y en una de agar salino manitol:

Placa nº 1 de Agar Sangre: se descarga el hisopo en una zona próxima al borde (zona densa) y se
siembra el resto de la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a
37ºC.

Placa nº 2 de Agar Sangre: con un asa estéril se toma un inóculo de la zona densa de la placa nº 1
y se siembra la placa por estrías continuas. Incubar 48 horas a 37ºC.

Placa de Agar Salino Manitol: sembrar por estrías continuas con el mismo hisopo que se ha
sembrado la placa nº 1. Incubar 48 horas a 37º C.
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Siembra por estrías continuas

Placa nº 1 con hisopo

Placa nº 2 con asa

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AGAR SANGRE

Es una combinación de agar base, generalmente agar nutritivo, y sangre. Se puede utilizar sangre de
oveja, de otros animales e incluso humana.

Es un medio rico que aporta muchos factores de crecimiento para microorganismos exigentes.

Se utiliza también para ver la capacidad hemolítica de los microorganismos patógenos, por lo que se
considera un medio diferencial. Observando los halos hemolíticos alrededor de las colonias se
determina el tipo de hemólisis que poseen: alfa, beta o gamma.
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AGAR SANGRE (AGAR BASE DE COLUMBIA + 5% SANGRE OVEJA)

Agar base de Columbia

Peptona 5 g/L
Tripteína 12 g/L
Extracto de levadura 3 g/L
Extracto de corazón (buey) 3 g/L
Almidón soluble 1 g/L
Cloruro sódico 5 g/L
Agar 15 g/L
Agua destilada 1L

pH: 7,3

El agar base de Columbia es uno de los muchos medios de cultivo a los que se les puede adicionar
sangre para preparar agar sangre o agar chocolate.

La sangre más comúnmente utilizada es la de oveja, al 5%, estéril y desfibrinada.

Una vez preparado el medio de cultivo, se enfría hasta 45ºC y se le añade la sangre.
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AGAR SALINO MANITOL (MEDIO DE CHAPMAN)

Extracto de levadura 2,5 g/L

Triptona 10 g/L
Gelatina 30 g/L
Lactosa 2 g/L
Manitol 10 g/L
Cloruro sódico 75 g/L
Fosfato dipotásico 5 g/L
Rojo fenol 0,025 g/L
Agar 15 g/L
Agua destilada 1L

pH: 7,0

Es un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos.

La mayoría de los microorganismos no crecen a una concentración de cloruro sódico del 7,5%,
mientras que los estafilococos patógenos sí lo hacen.

La presencia de manitol permite detectar a los estafilococos fermentadores del mismo que producen
colonias amarillas debido al viraje de color del rojo fenol. Los estafilococos no patógenos no lo
fermentan y producen colonias de color rosa.