CROMATOGRAFIA DE

LIQUIDOS DE ALTA
RESOLUCIÓN (HPLC)
 MÓDULO 1

PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA CROMATOGRAFÍA

DE LÍQUIDOS (HPLC )
PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS (HPLC )

1.1. HISTORIA
1. 1. Historia
La cromatografía de líquidos es un
método de separación que es utilizado
ampliamente en todas las ramas de la
ciencia. La técnica fue inventada por el
botánico ruso Mikhail Tswett a
principios del siglo XX, quien
descubrió que podía separar
pigmentos vegetales, como clorofilas y
xantofilas, haciendo pasar extractos a
través de una columna de vidrio
rellena con carbonato de calcio. Mikhail Tswett
1.1. Historia
Durante los experimentos de Tswett,
él hacía pasar un solvente a través de
la columna y a medida que éste
avanzaba, los compuestos presentes en
el extracto se iban separando
generando bandas de colores, lo que
dio origen al nombre del método: Separación de compuestos coloreados
en una columna de vidrio
chroma = color
graphein = escribir
PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS (HPLC )

1.2. PRINCIPIOS DE HPLC

1.2. Principios de HPLC
La cromatografía de líquidos se
encuentra dentro de un conjunto
importante y diverso de métodos que
facilitan la separación, identificación y
cuantificación de compuestos
presentes en muestras complejas que
muchas veces son imposibles de
separar por otros medios, ya que
pueden estar estrechamente
Separación de aminoácidos por
relacionados y compartir propiedades Cromatografía de Líquidos
físicoquímicas.
1.2. Principios de HPLC
En HPLC la muestra se
disuelve en una fase móvil
que es un líquido que,
mediante la aplicación de
presión se hace pasar a
través de una fase
estacionaria inmiscible fija
en una columna o en una
superficie solida.
1.2. Principios de HPLC
La separación ocurre, gracias a que los compuestos presentes en la
muestra tienen distintas afinidades en relación a la fase móvil y la
fase estacionaria. De esta manera los compuestos que tienen mayor
afinidad por la fase estacionaria son más retenidos por ésta y
avanzan con mayor lentitud, en cambio aquéllos que tienen poca
afinidad por la fase estacionaria son menos retenidos y avanzan con
mayor rapidez. La separación ocurrirá de manera selectiva y así se
pueden separar e identificar compuestos que están en una mezcla.
1.2. Principios de HPLC
FASE ESTACIONARIA FASE MOVIL
1.2. Principios de HPLC
La fase móvil se mueve con
rapidez. Como
consecuencia de las
distintas velocidades de
migración, los componentes
de la muestra se separan en
bandas distintas que se
pueden analizar en forma
cualitativa y cuantitativa.
PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS (HPLC )

1.3. CLASIFICACIÓN DE MÉTODOS HPLC

1.3. Clasificación de Métodos Cromatográficos
1.3.1 De acuerdo a medio físico de contacto entre las fases
1.3.1.1. Cromatografía en columna: La fase estacionaria se encuentra
contenida en un cilindro y la fase estacionaria es forzada a avanzar
mediante la aplicación de presión
1.3. Clasificación de Métodos Cromatográficos
1.3.1.2. Cromatografía planar: la fase estacionaria se fija sobre una
placa plana o en los intersticios de un papel; la fase móvil se desplaza
por capilaridad o por gravedad
1.3. Clasificación de Métodos Cromatográficos
1.3.2. Por tipo de fase móvil y estacionaria

FASE MOVIL:

Líquido Gas

Cromatografía Cromatografía
Líquido LIQUIDO GAS
LIQUIDO LIQUIDO
FASE Cromatografía Cromatografía
ESTACIONARIA: LIQ UIDO
Sólido GAS
SOLIDO SOLIDO
Cromatógrafo Cromatógrafo
de Líquidos de Gases
1.3. Clasificación de Métodos Cromatográficos
1.3.3. Por objetivo

1.3.3.1. Analítica: Identificar

y cuantificar componentes
de una mezcla

1.3.3.2. Preparativa: Aislar y

colectar los componentes
de una mezcla
1.3. Clasificación de Métodos Cromatográficos
1.2.4. Principio que rige la separación

1.3.4.1. Partición o Reparto: Solubilidad selectiva entre dos fases. Lo SIMILAR

ES SOLUBLE EN LO SIMILAR Fase Estacionaria: LIQUIDO
1.3.4.2. Adsorción: Fenómeno de SUPERFICIE Los solutos se concentran
sobre la superficie de un sólido Fase Estacionaria: SOLIDO
1.3.4.3. Intercambio Iónico: Intercambio estequiométrico de IONES de
Muestra y Fase Móvil, que compiten unirse a Fase Estacionaria IONICA
1.3.4.4. Exclusión: Separación en función de tamaño molecular. Solutos más
pequeños penetran más en poros de Fase Estacionaria POROSA (tamiz
molecular)
 PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
(HPLC )

1.4. PROCESO CROMATOGRÁFICO HPLC

 1.4. Proceso Cromatógráfico
1.4.1. Proceso Cromatográfico en capa fina
INTRODUCCION
DE MUESTRA Fase
móvil
A
B PROCESO DE SEPARACION

Fase
estacionaria A
B
A

B A
CROMATOGRAMA

Señal
Detector

2 4 6 8 t0 t1 t2 t3 tiempo
1.4. Proceso Cromatógráfico
1.4.1. Proceso Cromatográfico en capa fina

Situación Inicial Situación final

 1.4. Proceso Cromatógráfico
FASE MOVIL

1.4.2.Proceso COLUMNA

Cromatográfico
en columna
FASE
ESTACIONARIA

DETECTOR

< retardo tm > retardo

 1.4. Proceso Cromatógráfico
1.4.2.Proceso
Cromatográfico CROMATOGRAMA

en columna

tM tR1 tR2

CUANTITATIVA
INFORMACIÓN
Señal del
Detector

0 1 2 3 t
INFORMACIÓN CUALITATIVA
1.4. Proceso Cromatógráfico
1.4.3. Cinética cromatográfica en HPLC

Al observar un cromatograma típico, los picos cromatográficos se ven similares

a las curvas gaussianas o de distribución normal. Esta forma se puede deducir,
entendiendo que la señal que se observa a medida que un compuesto eluye, es
la suma de un gran numero de pequeñas incertidumbres en el avance de las
distintas moléculas del analito, que se mueven de manera aleatoria. La
incertidumbre de la velocidad de avance tiene igual probabilidad de ser positiva
o negativa. De manera que la forma típica del pico cromatográfico en HPLC se
atribuye a la combinación aditiva de los movimientos aleatorios de las diversas
moléculas a medida que avanzan por la columna. Así algunas moléculas
alcanzarán el detector antes que otras.
1.4. Proceso Cromatógráfico
1.4.3. Cinética cromatográfica en HPLC

Curva Gaussiana Pico Cromatográfico

1.5. Términos de uso común en HPLC
Tiempo Muerto (tM): Tiempo necesario para que una especie no retenida alcance el detector. Proporciona
una medida de la velocidad promedio de migración de la fase móvil, por lo que es un parámetro importante
para identificar los picos del analito

Tiempo de Retención (tR): Tiempo necesario para que una sustancia retenida alcance el detector

Tiempo de Retención relativo (tR´): Corresponde al tiempo en que una sustancia permanece
efectivamente en la fase estacionaria y equivale a la diferencia entre el tR y tM

tR´= tR - tM
1.5. Términos de uso común en HPLC
tR´= tR - tM

Señal tR2

CUANTITATIVA
INFORMACIÓN

tR1
tM

0 1 2 3 t
INFORMACIÓN CUALITATIVA
1.5. Términos de uso común en HPLC
tR´= tR - tM

tR ’ = tR- tM
Señal tR2
tR2’ VR ’ = tR x F – to x F
tR1’
INFORMACIÓN
CUANTITATIVA

tR1
tM

0 1 2 3 t
INFORMACIÓN CUALITATIVA
 PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS
(HPLC )

1.5. DEFINICIONES Y PARÁMETROS EN HPLC

1.5. Términos de uso común en HPLC
Pico cromatográfico: La señal que se
obtiene en un detector en HPLC tiene
una forma característica, debido a la
distribución gaussiana de las moléculas
de analito a medida que van alcanzando
al detector y esta forma típica es
denominada pico cromatográfico.

Sigma: representa el ancho del pico (w)

al 80,2 % de la altura.
Al 60.7 % de altura el ancho (w) es de 2
sigma y en la base es de 4 sigmas.

Plato Teórico: Espacio teórico donde

ocurre el equilibrio entre la fase
estacionaria y la fase móvil.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
En HPLC, a medida que el proceso
cromatográfico ocurre, dentro de la
columna se va produciendo la
separación de los analitos, los que
al avanzar a distintas velocidades,
finalmente tendrán distintos tiempos
de retención.
Para que el proceso cromatográfico
sea efectivo, se debe lograr una
separación adecuada de los
compuestos de interés, existen
parámetros cromatográficos que
permiten evaluar la separación
entre los analitos y que aportan
información acerca de la calidad de
la separación cromatográfica.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.1. Factor de retención o
factor de capacidad (k): es un tR – tM tR = tiempo de retención
parámetro experimental que k = t
permite comparar la velocidad M tM = tiempo muerto (to )
de migración de un analito que
es retenido con respecto a otro Como tR’ = tR- tM
no retenido en la columna
cromatográfica.
tiempo del soluto en Fase Estacionaria
Este parámetro relaciona el tR’
tiempo de retención relativo y el k = t tiempo del soluto no retardado
M en Fase Móvil
tiempo muerto, de acuerdo a la
siguiente fórmula:
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.1. Factor de retención o factor de capacidad (k)

Notas:

1. Cuando se está desarrollando un método, es de uso frecuente calcular el factor de capacidad, k,el
cual es independiente de las dimensiones de la columna, razón de flujo y tamaño de partícula.

2. k entrega una importante información acerca de la calidad de la separación. Cuando k es pequeña, la

resolución es pobre. Si k es grande, el tiempo de análisis puede ser demasiado largo, cualquier mejora
en la resolución puede ser inapropiada por el ensanchamiento de banda del pico. Idealmente, k debe
estar entre 2 y 10.

En algunos casos 1< k < 20 es aceptable.

1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Cómo modificar k: El
factor de retención se
puede modificar
variando la proporción
de modificador orgánico
de la fase móvil.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Cómo modificar k: El
factor de retención se
puede modificar
variando la proporción
de modificador orgánico
de la fase móvil.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.2. Factor de separación o
selectividad (a): se define
como la relación de los factores
de capacidad de dos analitos y k2 tR2’
está relacionado con la habilidad a= o bien a= t ’
k1 R1
de la fase estacionaria para
discriminar dos compuestos.
Mientras mayor sea su valor, para k2 > k1 para tR2’ > tR1’
mayor será habilidad de
separación.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.2. Factor de separación o selectividad (a)

Notas:

El factor de separación a describe la migración de un pico presente en la mezcla en relación al

otro que sufre menos retardo  a > 1

a Es una medida de la habilidad de la fase estacionaria para discriminar entre dos

componentes de la mezcla. Los valores mayores de a indican facilidad en la separación de dos
componentes.
En la práctica: recomendable que 1.1 < a < 1.5
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Cómo modificar a : El Columna C-8
factor de selectividad se
puede modificar
variando la fase a (2,1) = 1.6
estacionaria.

Columna C-18

a (2,1) = 2.1
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Cómo modificar a : El factor de selectividad se puede modificar variando la fase
estacionaria.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
En un sistema
cromatográfico si los tR2
tiempos de retención y el
tiempo muerto

Señal
tR1
permanecen constantes en
el tiempo, el factor de
retención (k) y selectividad tM
(a ) también permanecerán
constantes, sin embargo,
esto no significa que la
calidad de la separación
permanezca constante. 0 3 4 t
1 2
Lo anterior, debido a que
con el tiempo el sistema va Si tM, tR1 , tR2 = constantes
perdiendo eficiencia.
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Con el tiempo la fase estacionaria va perdiendo su habilidad de separación y se van provocando
fenómenos como el ensanchamiento de los picos cromatográficos, lo cual implica pérdida de la
eficiencia.

< ancho > eficiencia: deseable > ancho < eficiencia: NO deseable

h h

w w
 1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.3. Número de Platos
Teóricos (N): Está dado por
la relación entre el tiempo de
retención y sigma (1/4 del
ancho de la base de un pico
cormatográfico), para un
determinado compuesto. Está
relacionado con la eficiencia
del sistema de separación.
N = Número de Platos Teóricos
tR 2 s = ¼ del ancho de
N= [ ]s pico en la base
 1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos

tR 2 s = ¼ del ancho de
N= [ ] s pico en la base

wb = ancho de pico
tR 2 en la base tR2
N = 16 [ ]
wb =4s

h
L = Largo de
N= L Columna
HEPT HEPT: Altura
equivalente de Plato
Teórico
t
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
Eficiencia N
N = Número de Platos Teóricos

tR 2
N= [ ]s tR2

Señal
tR 2
N = 16 [ ]
wb h

tR 2
N = 5,545 w [ ]
h
0 1 2 3 t

s = ¼ del ancho de wh = ancho de pico wb = ancho de pico

pico en la base a mitad de altura en la base
= 2.354 s =4s
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de
Plato Teórico (HETP):
Sección eficaz responsable de
un equilibrio de intercambio Fase móvil
L

HETP = L Fase
N estacionaria

L = largo columna
N = número de platos teóricos
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura
Equivalente de Plato
Teórico (HETP): L = largo columna
N = número de platos teóricos
N=7 N = 14 N = 28
HETP
HETP HETP

HETP = 2 HETP = 1

HETP = 4

< N, > HEPT N,< HEPT

= Menor eficiencia = Mayor eficiencia
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:

Durante el proceso cromatográfico ocurren una serie de fenómenos que van a provocar el
ensanchamiento del pico cromatográfico y que afectan a la HEPT.

La Ecuación de Van Deemter considera estos fenómenos y se expresa de la siguiente manera:

HETP = A + B/ m + C . m
m= velocidad lineal media de la fase móvil
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:
HETP = A + B/ m + C . m
Ecuación de Van Deemter m= velocidad lineal media de la fase móvil

A:Efecto de camino múltiple

M
M

M
M
M M

Depende de forma y tamaño de partículas en el lecho de separación > Eficiencia con

partículas pequeñas de tamaño uniforme
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:
HETP = A + B/ m + C . m
Ecuación de Van Deemter m= velocidad lineal media de la fase móvil

B: Difusión Longitudinal o axial

M M

M M

Depende de:
• Coef. difusión soluto en F. móvil B/m: es afectado por el flujo
• Factor de tortuosidad a >m <B y >Eficiencia
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:
HETP = A + B/ m + C . m
Ecuación de Van Deemter m= velocidad lineal media de la fase móvil

C: Resistencia a la transferencia de masa

FM
FM

Analitos
FE FE
FE
Depende de:
• Coeficiente de difusión del soluto en f.e y f.m
• Espesor de FE
• Factor de Separación C*m: es afectado por el flujo
a >m >C y < Eficiencia
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:
HETP = A + B/ m + C . m
Ecuación de Van Deemter
m= velocidad lineal media de la fase móvil

Debido a que los factores que afectan a la HEPT tienen efectos variados en relación al flujo, en el
desarrollo de un método de cromatografía de líquidos se debe determinar de manera
experimental cuál es el flujo óptimo con el que se obtiene una menor HEPT, que es la situación en
la cual se logra la mejor eficiencia de separación.
 1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.4. Altura Equivalente de Plato Teórico:

Ecuación de Van Deemter

HETP= A + B/m + C*m
HETP

OPTIMIZACIÓN
DE LA SEPARACION

Reduciendo efecto de
C*m
ensanchamiento de banda A
(modificando N)
Modificando la velocidad de B/m
migración relativa de las
especies (modificando k o a)
Flujo
m
óptimo
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Resolución (R): Es un parámetro que permite evaluar la eficiencia de la separación en su
conjunto. Es una medida cuantitaiva para dos analitos que eluyen de manera contigua en el
cromatograma.
tR2- tR1

Señal

Tiempo
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Resolución (R): Es un parámetro que permite evaluar la eficiencia de la separación en su
conjunto. Es una medida cuantitativa para dos analitos que eluyen de manera contigua en el
cromatograma. t -t
R2 R1

Señal
Rs = Resolución

tR2 – tR1
Rs= 2 w
b1+ wb2

Tiempo
Wb1 y Wb2 = ancho en la
base de dos picos vecinos
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
tR2 – tR1
1.5.5. Resolución (R): Rs= 2 w
b1+ wb2

Si dos picos vecinos tienen tamaño

similar
Rs = 1,0 —> 97,9 % separación
= 1,25 —> 99,4 %
separación Ecuación Maestra de la Cromatografía
= 1,5 —> 99,7 %
separación
a- 1 k √ N
> 2,0 —> separación
TOTAL Si Wb1 ≈ Wb2
Rs =
( )(
a k+1)( ) 4
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Resolución (R): La resolución es influenciada por N (número de platos teóricos)
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Resolución (R): La proporción relativa de las áreas y resolución
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Resolución (R): Variación de selectividad a y resolución

C-8 OCTIL

a = 1.15
Rs (3,4) = 1.2

C18-ODS-OCTADECIL

a = 1.25
Rs (3,4) = 2.0
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Factor de Asimetría (T): T = w0,05 / 2 f

T ideal = 1, en la práctica T > 1

1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Factor de Asimetría (T): Diferentes grados de asimetría
1.5. Parámetros Cromatográficos en HPLC
1.5.5. Factor de Asimetría (T): Frente (Frontig)
v/s Cola (Tailing)

Cuando se presenta el fenómeno de fronting el

factor de asimetría será menor a 1

Cuando se presenta el fenómeno de tailing (el

más común) el facto de asimetría será mayor
que 1.
PRINCIPIOS Y TEORÍA DE LA
CROMATOGRAFÍA DE
LÍQUIDOS (HPLC )

1.6. RESUMEN
1.6. Resumen
Existen una serie de fenómenos que
ocurren durante el proceso de
separación cromatográfica. En el
desarrollo de un método de HPLC
existen distintos parámetros que se
pueden modificar para optimizar la
separación.

Nunca la primera separación es la

mejor