INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE INGENIERÍA CAMPUS

GUANAJUATO.

BIOQUÍMICA FARMACÉUTICA

PRACTICA NO.9:
"AISLAMIENTO ACIDOS NUCLEICOS"

3FV1

EQUIPO No. 5
García Romo Natalia
Ferreyra Reyes Angélica
Segura Martínez Lucero

PROFESORES

Anastasio Cortes Mendoza

María Del Rosario León Reyes

09 de mayo del 2017 16 de mayo del 2017

Contenido
1.- Objetivos: ........................................................................................................................................... 3
2.- Introducción:...................................................................................................................................... 3
3.- Resultados:......................................................................................................................................... 7
4.-Discusiones: ........................................................................................................................................ 8
5.- Cuestionario: ...................................................................................................................................... 8
6.-Conclusiones: .................................................................................................................................... 11
7.-Referencias: ...................................................................................................................................... 11

2
1.- Objetivos:
Obtener ADN total de una muestra vegetal aplicando una técnica sencilla para aislar,
purificar y caracterizar el ADN, el cual es usado en espectrofotometría para calcular
la concentración.

2.- Introducción:
Ácidos nucleicos:
Los ácidos nucleicos son las biomoléculas portadoras de la información genética. Son
biopolímeros, de elevado peso molecular, formados por otras subunidades
estructurales o monómeros, denominados Nucleótidos (Alemañ, 2015)
Función: de acuerdo a Alemañ, (2015)
 ADN:
o Replicación
o Codificación
o Gestión celular
o La capacidad de mutar
 ARN
o Permite que la información genética se transforme en proteínas.
o Existen 3 tipos de ARN:
 Mensajero (ARNm): que lleva la información del núcleo al
citoplasma
 Ribosomal (ARNr): conforma la maquinaria necesaria para la
síntesis proteica (y tiene actividad catalítica)
 Transferencia (ARNt): transporta los aminoácidos necesarios
para sintetizar la nueva cadena proteica
Estructura:

 ADN: De acuerdo a Juárez, (2013) Es una columna vertebral compuesta de

desoxirribosa (Azúcar) y fosfato.

Conectada a cada molécula existe una de las cuatro bases orgánicas (Juárez,
2013) :

- Purinicas: Adenina- Guanina

- Piriminicas: Timina- Citosina

La combinación Base-Azucar- Fosfato de denomina: Nucleótido y se unen para

formar una macromolécula de cadena larga (Juárez, 2013) .
Modelo de Watson y Crick:
De acuerdo a Juárez, (2013) Estos científicos determinaron que la estructura del ADN
estaba compuesta de la siguiente forma:

3
  El ADN estaría constituido por dos cadenas o hebras de polinucleótidos
enrolladas helicoidalmente en sentido dextrógiro sobre un mismo eje formando
una doble hélice (Juárez, 2013) .
 Ambas cadenas serían antiparalelas, una iría en sentido 3'5' y la otra en sentido
inverso, 5' 3' (Juárez, 2013) .
 Los grupos fosfato estarían hacia el exterior y de este modo sus cargas
negativas interaccionarían con los cationes presentes en el núcleoplasma
dando más estabilidad a la molécula (Juárez, 2013) .
 Las bases nitrogenadas estarían hacia el interior de la hélice con sus planos
paralelos entre sí y las bases de cada una de las hélices estarían apareadas
con las de la otra asociándose mediante puentes de hidrógeno (Juárez, 2013).
 El apareamiento se realizaría únicamente entre la Adenina y la Timina, por una
parte, y la guanina Y la Citosina, por la otra. Por lo tanto, la estructura primaria
de una cadena estaría determinada por la de la otra, ambas cadenas serían
complementarias. La complementariedad de las cadenas sugiere el
mecanismo por el cual el ADN se copia (se replica) para ser trasferido a las
células hijas. Ambas cadenas o hebras se pueden separar parcialmente y
servir de molde para la síntesis de una nueva cadena complementaria (síntesis
semiconservativa) (Juárez, 2013) .
 Una vuelta de hebra (3.4 nm) tiene aprox. 10 pares de base (Juárez, 2013).

 ARN: El componente azúcar es ribosa en vez de desoxirribosa y el uracilo

sustituye a la timina como componente base, formando una sola espiral y no
una doble hélice (Juárez, 2013) .

Figura 2.1: Estructura del ADN y ARN

4
Extracción de ácidos nucleicos
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primera etapa de la
mayoría de los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de
recombinación de ADN. En este caso, los métodos de extracción permiten obtener
ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis
específicos de modificaciones genéticas mediante (PCR). (Hotzel, H. 1999)
Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos
existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los
siguientes criterios: según (Hotzel, H. 1999)
 Ácido nucleico Diana
 Organismo fuente
 Material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.)
 Resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la
purificación)
 Uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, etc.)
Métodos de extracción
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis
celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos
de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas
y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido,
por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana.
(Jansen, P. 1990)
Métodos de purificación
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares
suelen ser combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes: según (Jansen,
P. 1990)
 extracción/precipitación
A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los
contaminantes de los ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinación de fenol y cloroformo con objeto de eliminar las proteínas. Para
concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una precipitación con
isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa, puede
añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la
precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con
concentraciones salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de
proteínas mediante cambio de pH.

 cromatografía
Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación:
 permeación sobre gel: aprovecha las propiedades de las partículas
porosas del gel para tamizar moléculas.

5
  La cromatográfica de intercambio iónico: es otra técnica, que se
basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un grupo
funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones
lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de
intercambio iónico con simples Tampones salinos.
 cromatografía de adsorción: los ácidos nucleicos se fijan
selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales
(por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas
biológicas no se fijan. A continuación, los ácidos nucleicos pueden
eluirse con agua o un tampón hiposalino y se obtiene una muestra que
puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores

 centrifugación
Suele asociarse a otros métodos, como la cromatografía de columna
centrifugada, en cuyo caso se combina la permeación sobre gel y la
centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más pequeños
(sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el
tamaño. Algunos procedimientos combinan la adsorción selectiva en matriz.

 separación por afinidad

En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que
combinan la inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación
magnética. Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas
magnéticas revestidas de estreptavidina mediante oligo dT marcados con
biotina, y el complejo de partículas puede eliminarse de la solución (y de los
contaminantes libres) con un imán. Esta técnica en fase sólida simplifica la
purificación de los ácidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de
centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por una operación
de separación magnética, única y rápida.

Método de extracción y purificación con CTAB

El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por
Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente,
en 1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El método es
adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de
vegetales y está especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los
compuestos polifenólicos, que, de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por
tanto, su calidad. (Jansen, P. 1990)

Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación

Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de
cetiltrimetilamonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos
en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los
demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por

6
lavado. El complejo de ADN se solubiliza aumentando la concentración salina y se
precipita con etanol o isopropanol. (Jansen, P. 1990)
Cuantificación y grado de pureza del DNA
Los ácidos nucleicos presentan un máximo de absorción a 260 nm, mientras que las
proteínas (principales posibles contaminantes en la preparación) tienen el máximo de
absorción a 280 nm. Por ello, la medida de la absorbancia a ambas longitudes de
onda permite saber el grado de pureza de la preparación de DNA mientras que la
A260 permite calcular la cantidad de DNA obtenida. Una preparación pura de DNA
tiene un coeficiente de extinción ε 260 de 0,027 ml /µg x cm, y una relación A260 /
A280 de 1,6 a 1,8. (Jansen, P. 1990)
Extracción de ADN en la industria farmacéutica:
La extracción de ADN se utiliza en el comienzo de la creación de nuevos
medicamentos, algunos fármacos se realizan a través de la genética recombinante,
incluyen la hormona de crecimiento bovina (BVH) y la hormona del crecimiento
humana (hGH) entre otras, una de las más utilizadas es la insulina, además de que
la extracción de ADN también se utiliza para la detección de diferentes enfermedades
como: fibrosis quística, anemia de células falciformes, síndrome de X frágil, la
enfermedad de Huntington, el síndrome de hemofilia A Down, la enfermedad de Tay-
Sach etc. (López, 2013).

3.- Resultados:
En un matraz Erlenmeyer se mezclaron 10.02g de la muestra vegetal (hojas de árbol
molidas) y 30 ml de búfer de lisis.
Una vez realizado el filtrado, se tomaron 5ml y se agregaron 10ml de etanol al 96%
formándose tres fases de las cuales la zona opaca corresponde al ADN de la muestra,
como se observa en la figura 3.1

Figura 3.1: Filtrado de la mezcla del buffer de lisis y las hojas molidas, con etanol al 96%

Una vez formada la interfase se extrajeron 3 muestras a tubos eppendorf, se

realizaron 3 lavados para cada muestra con etanol al 70% y posteriormente se
hicieron diluciones con agua destilada (1:10, 1:100,1:1000)
Tabla 3.1 Resultados de absorbancia de las diluciones del ADN obtenido de hojas a 260
nm.

Diluciones A280 Concentración

(µg/ml)
1:10 0.610 22.5925
1:100 -0.097 -
1:1000 -0.015 -

7
4.-Discusiones:
Los resultados de la absorbancia en la dilución 10^2 y 10^3 dieron negativos, lo que
indica que no hay presencia de muestra de ADN

5.- Cuestionario:
1.- ¿Cuáles son las propiedades físico-químicas del ADN?
De acuerdo a Márquez, (2009):
 Desnaturalización: capacidad que posee la molécula de separar sus dos
cadenas.
 Reabsorción: emparejamiento de las cadenas tras quitar el calor al que son
sometidas para la desnaturalización.
 Hibridación: emparejamiento entre cadenas complementarias de diferente
origen.
 pilamiento de las bases: El apilamiento se puede detectar mediante el efecto
hipercrómico: a medida que se apilan más las bases, va disminuyendo el
coeficiente de extinción molar, y también disminuye (pero mucho menos
perceptiblemente) la longitud de onda a la que se obtiene ese valor.
 Reactividad química
2.- ¿Cuáles son las etapas básicas en la extracción de ADN?
1.- Preparación del búfer de lisis
2.- Moler la muestra de donde se obtendrá el ADN
3.- Filtrar el material vegetal o animal molido en un colador, recuperando el filtrado en
un baso de precipitado
4.- En un matraz Erlenmeyer, mezclar 10 ml del filtrado con 20 ml del bufer. Cubrir
con parafilm y agitar por 2 min vigorosamente.
5.- Filtrar nuevamente y recuperar el filtrado
6.- Tomar 5 ml de este filtrado en un tubo falcón e inclinando el tubo agregar muy
lentamente 10 ml de etanol al 96%
7.- Extracción de la muestra de ADN colocándolo en tubos eppendorf
8.- Resuspender las muestras en etanol al 70%, repitiendo el lavado 3 veces
3.- ¿Qué función tiene el NaCl?
Ayuda a romper la membrana plasmática y nuclear e incluso la pared celular (Salas,
2012).
4.- ¿Qué función tiene el detergente?
Separa las grasas, proteínas y carbohidratos que constituyen las membranas que
rodean la célula y el núcleo, liberando el ADN de la célula (Salas, 2012).
5.- ¿Qué función tiene el etanol al 96% y al 70%?

8
Ayuda a precipitar el ADN debido a que el alcohol separa el ADN de otros
componentes celulares, los cuales son dejados en la solución acuosa (Salas, 2012).
6.- En una célula de origen vegetal ¿Qué organelos contienen ADN?
En los ribosomas, núcleo y nucléolo (Torres, 2015).
7.- ¿Cómo es la ecuación que relaciona las lecturas de densidad óptica a 160 y
280 nm para determinar la concentración del ADN?
Ley de Lambert-Beer
𝐼0
𝐴 = 𝐿𝑜𝑔 =∈ 𝑐 𝑙
𝐼
𝐴
𝑐=
∈𝑙

Donde:
l: Es la longitud de la cubeta en cm
c: Representa la concentración de soluto en mol/l
ϵ : Es el coeficiente de extinción molar en l/mol cm.
8.- Usa la ecuación anterior para determinar la concentración de ADN obtenido
en su extracción:
Tabla 5.1: Resultados de la extracción de ADN a una absorbancia de 260 nm

Diluciones A280 Concentración (µg/ml)

1:10 0.610 22.5925
1:100 -0.097 -
1:1000 -0.015 -

9.- Investigue y diseñe protocolos de extracción de ADN usando reactivos de

pureza grado biología molecular para la extracción de ADN de muestras
vegetales, animales, bacterias, hongos microscópicos e insectos. Haga las
adecuaciones y observaciones necesarias si así lo requieren los diferentes
tipos de tejidos/células que incluya en su protocolo.
 MÉTODO DE EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLVENTES ORGÁNICOS.

 Principio.
Este protocolo permite la purificación de ADN mediante la adición de fenol y
cloroformo lo que da lugar a la aparición de 2 fases: una fase acuosa superior que
contiene los ácidos nucleicos y una fase orgánica que contiene las proteínas disueltas
en el fenol y los lípidos disueltos en el cloroformo. Para la purificación de ADN el fenol
debe tener un pH≈7-8. Posteriormente se precipita el ADN de la fase acuosa con
isopropanol o etanol absoluto y se lava con etanol al 70% para eliminar sales y
pequeñas moléculas orgánicas que podrían aún estar presentes en la muestra. Por
último, el ADN se resuspende en un tampón apropiado.

9
  Alcance
Este método puede ser utilizado para la obtención de ADN de diferentes tipos de
muestra como sangre periférica, células o tejidos. En los biobancos integrados en la
Red Nacional del ISCIII este método se aplica para la obtención de ADN a partir de
sangre y tejido fresco congelado.
 Protocolo General.

 Paso 1. Se procede al lisado celular de la muestra. La lisis se lleva a cabo en

función del tipo de muestra que se va a procesar, pero es necesario que antes
de la adición del fenol la lisis sea completa y el lisado resultante sea
homogéneo.
 Paso 2. Se añade un volumen de fenol al volumen de lisado y la mezcla se
agita por inversión del tubo unos 20 segundos.
 Paso 3. La muestra se centrifuga a 12,000 g durante 3 minutos. Tras la
centrifugación se observan dos fases: la fase acuosa superior y la fase
orgánica. La interfase entre ambas se observa como una capa blanquecina
que irá disminuyendo de espesor a medida que la muestra se encuentre más
limpia de proteínas y contaminantes.
 Paso 4. La fase acuosa que contiene el ADN se transfiere a un tubo limpio con
cuidado de no tocar la interfase ni la fase orgánica que son desechadas. A la
fase acuosa se le añade un volumen idéntico de una solución combinada de
fenol y CIA en proporción 1:1. La mezcla se homogeniza por agitación.
 Paso 5. La mezcla se centrifuga de nuevo a 12,000 g durante 3 minutos. De
nuevo se forman las dos fases si bien debe apreciarse una reducción
considerable de la interfase. Los pasos 4 y 5 deben repetirse si la interfase aún
aparece visible.
 Paso 6. La fase acuosa se transfiere a un nuevo tubo y se mezcla con un
volumen de cloroformo (el cloroformo secuestra los restos de fenol que hayan
quedado en la muestra). La fase acuosa y el cloroformo se mezclan por
inversión unos 20 segundos.
 Paso 7. Se realiza una centrifugación a 12,000 g durante 3 minutos. La fase
acuosa se precipita en un tubo limpio con 2 volúmenes de isopropanol. La
incubación durante 5-10 minutos de la mezcla, aunque es opcional, puede
favorecer la precipitación del ADN.
 Paso 8. Se realiza una centrifugación a 12,000 g durante 10 minutos para
precipitar el ADN. Se desecha el isopropanol y el precipitado de ADN debe
observarse en el fondo del tubo.
 Paso 9. El precipitado se lava con 500 µl de etanol al 70%. La muestra se
centrifuga a 12,000 g durante 10-15 min. Opcionalmente se puede realizar un
segundo lavado con etanol para maximizar la purificación de la muestra.
 Paso 10. Se elimina el etanol y se deja secar el precipitado de ADN.
Finalmente, el ADN es resuspendido en un volumen adecuado de tampón TE
o agua destilada.
Nota: solución CIA: mezcla de cloroformo y alcohol isoamílico en una proporción 24:1

10
tampón TE: Tris HCl 10 mM, pH 8.0, EDTA 1 mM

 Rendimiento.
El rendimiento obtenido con este protocolo en muestras de sangre total se sitúa en
torno a 30-70 µg ADN/ ml de sangre. En tejidos el rendimiento resulta mucho más
variable dependiendo del tipo de tejido y de la cantidad de muestra de partida. No
obstante, la extracción con solventes orgánicos permite obtener un rendimiento muy
alto de ADN por lo que es un método indicado cuando la cantidad de muestra de
partida es limitada.
 Calidad de las Muestras.
 Pureza: cuando se utiliza este método de extracción de ADN es determinante
trabajar con mucho cuidado para evitar la contaminación de la solución de ADN
por restos de fenol o cloroformo. La aparición de restos de fenol o cloroformo
pueden afectar a las relaciones de absorbancia indicativas de la pureza de la
muestra. Las muestras obtenidas con este método presentan una relación
A260/280 con valores en torno a >1.7, aunque es relativamente frecuente
observar en la relación A260/230 valores inferiores a 1.5.
 Integridad: las muestras se observan como una banda definida en la parte
superior del gel de agarosa tras la migración electroforética indicando una
integridad óptima del ADN.
 Funcionalidad: la mayoría de las muestras obtenidas con este método son
capaces de amplificar mediante reacción de PCR fragmentos de ADN de gran
tamaño (> 17 kb). En aquellas muestras en las que no se amplifican bandas
>17 kb, es posible amplificar fragmentos de ADN de un tamaño aproximado de
7 kb.

6.-Conclusiones:
Se logro aislar y purificar el ADN de la muestra, al igual que se logro calcular la concentración
de este.

7.-Referencias:
Márquez P. (2009). Propiedades estructurales y físico químicas de los ácidos
nucleicos. 12 de mayo del 2017, de bioquímica Sitio web:
https://bioayuda.wordpress.com/2009/06/01/propiedades-estructurales-y-fisico-
quimicas-de-las-acidos-nucleicos/
Salas A. (2012). extracción de ADN. 12 de mayo del 2017, de Monografías Sitio web:
http://www.monografias.com/trabajos91/informe-experimento-extraccion-
adn/informe-experimento-extraccion-adn.shtml
Torres L. (2015). La célula vegetal. 13 de mayo del 2017, de bioenciclopedia Sitio
web: http://www.bioenciclopedia.com/la-celula-vegetal/

11
Alemañ M. (2015). Las principales funciones del ADN y del ARN. 13 de mayo del
2017, de CEFEGEN Sitio web: https://cefegen.es/blogs/las-principales-funciones-del-
adn-del-arn
Juárez N. (2013). Estructura del ADN y ARN. 13 de mayo del 2017, de bioquímica
clinica Sitio web: https://bioquimicamedica.jimdo.com/%C3%A1cido-
nucleico/estructura-del-adn-y-arn/
Hotzel, H. (1999) Recovery and characterization of residual DNA from beer as a
prerequisite for the detection of genetically modifiedingredients. European Food
Research Technology 209, 192-196
Jansen, P, (1990). Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journalof
Clinical Microbiology 28(3): 495-503.
Morent, M. (2011). Extracción de ácidos nucleicos. 15 Mayo 2017, de Red Nacional
de Biobancos Sitio web:
http://redbiobancos.es/Pages%5CDocs%5CPNT_Acidos_Nucleicos.pdf
López J. (2013). Los usos de extracción de ADN. 16 de mayo del 2017, de ehow Sitio
web: http://www.ehowenespanol.com/usos-extraccion-adn-sobre_109204/

12