Anda di halaman 1dari 19

Uji Kualitas DNA Secara Kuantitatif Dengan Menggunakan Nanodrop

Spektrofotometer

Laporan praktikum ini disusun untuk memenuhi tugas matakuliah


Teknik Analisis Biologi Molekuler
yang dibimbing oleh Dr. Umie Lestari, M.Si

Disusun oleh:

Anggy Ningtyas (160342606237)

Dyah Ayu Pitaloka (160342606236)

Ely Kristiani (160342601708)

Karin Furaida Dwi Hafsari (160342606293)

Muhammad Fadhil (160342606235)

UNIVERSITAS NEGERI MALANG

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

PROGRAM STUDI S1 BIOLOGI

Februari 2018
TOPIK : Uji Kualitas DNA

HARI/TANGGAL : Jumat, 2 Maret 2018

TUJUAN : Agar mahasiswa mampu menguji kualitas DNA secara


kuantitatif dengan menggunakan Nanodrop
Spektrofotometer UV-Vis

DASAR TEORI

Molekul DNA dalam suatu sel dapat diekstraksi atau diisolasi untuk
berbagai macam keperluan seperti amplifikasi dan analisis DNA melalui
elektroforesis. Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prisnsip utama dalam isolasi
DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Corkill dan
Rapley, 2008; Dolphin, 2008). Menurut Surzycki (2000), ada beberapa hal yang
perlu diperhatikan dalam proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA
tanpa adanya kontaminan seperti protein dan RNA; metodenya harus efektif dan
bisa dilakukan untuk semua spesies metode yang dilakukan tidak boleh mengubah
struktur dan fungsi molekul DNA; dan metodenya harus sederhana dan cepat.

Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA buah, isolasi DNA bakteri, dan isolasi
DNA hewan pada dasarnya memiliki prinsip yang sama. Prisnsip isolasi DNA
pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama
namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan
beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit yang diproduksi
oleh suatu perusahaan sebagai contoh kit yang digunakan untuk isolasi DNA pada
tumbuhan seperti Kit Nucleon Phytopure sedangkan untuk isolasi DNA pada
hewan digunakan GeneJETTM Genomic DNA Purification Kit. Namun tahapan-
tahapan isolasi DNA dalam setiap langkahnya memiliki protokol sendiri yang
disesuaikan dengan keperluan. Penggunaan teknik isolasi DNA dengan kit dan
manual memiliki kelebihan dan kekurangan. Metode konvensional memiliki
kelebihan harga lebih murah dan digunakan secara luas sementara kekurangannya
membutuhkan waktu yang relatif lama dan hasil yang diperoleh tergantung jenis
sampel.

Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau


penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan
dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan
Hazel, 1998). Tahap penghancuran sel atau jaringan memiliki beberapa cara yakni
dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan
pestle dalam nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing
dan iradiasi (Giacomazzi et al., 2005). Cara lain yakni dengan menggunakan
kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi seperti
penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga
terjadi destabilisasi membran sel (Surzycki, 2000). Sementara cara enzimatik
seperti menggunakan proteinase K seperti untuk melisiskan membran pada sel
darah (Khosravinia et al., 2007) serta mendegradasi protein globular maupun
rantai polipeptida dalam komponen sel (Brown, 2010; Surzycki (2000).

Pada proses lisis dengan menggunakan detergen, sering digunakan sodium


dodecyl sulphate (SDS) sebagai tahap pelisisan membran sel. Detergen tersebut
selain berperan dalam melisiskan membran sel juga dapat berperan dalam
mengurangi aktivitas enzim nuklease yang merupakan enzim pendegradasi DNA
(Switzer, 1999). Selain digunakan SDS, detergen yang lain seperti cetyl
trimethylammonium bromide (CTAB) juga sering dipakai untuk melisiskan
membran sel pada isolasi DNA tumbuhan (Bettelheim dan Landesberg, 2007).
Parameter keberhasilan dalam penggunaan CTAB bergantung pada beberapa hal.
Pertama, Konsentrasi NaCl harus di atas 1.0 M untuk mencegah terbentuknya
kompleks CTAB-DNA. Karena jumlah air dalam pelet sel sulit diprediksi, maka
penggunaan CTAB sebagai pemecah larutan harus dengan NaCl dengan
konsentrasi minimal 1.4 M. Kedua, ekstrak dan larutan sel yang mengandung
CTAB harus disimpan pada suhu ruang karena kompleks CTAB-DNA
bersifatinsolublepada suhu di bawah 15°C. Ketiga, penggunaan CTAB dengan
kemurnian yang baik akan menentukan kemurnian DNA yang didapatkan dan
dengan sedikit sekali kontaminasi polisakarida. Setelah ditambahkan CTAB,
sampel diinkubasikan pada suhu kamar. Tujuan inkubasi ini adalah untuk
mencegah pengendapan CTAB karena CTAB akan mengendap pada suhu 15°C.
Karena efektivitasnya dalam menghilangkan polisakarida, CTAB banyak
digunakan untuk purifikasi DNA pada sel yang mengandung banyak polisakarida
seperti terdapat pada sel tanaman dan bakteri gram negatif seperti Pseudomonas,
Agrobacterium, dan Rhizobium (Surzycki, 2000).

Dalam penggunaan buffer CTAB seringkali ditambahkan reagen-reagen


lain seperti NaCl, EDTA, Tris-HCl, dan 2-mercaptoethanol. NaCl berfungsi untuk
menghilangkan polisakarida sementara 2-mercaptoethanol berfungsi untuk
menghilangkan kandungan senyawa polifenol dalam sel tumbuhan (Ranjan et al.,
2010). 2-mercaptoethanol dapat menghilangkan polifenol dalam sel tanaman
dengan cara membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa polifenol yang
kemudian akan terpisah dengan DNA (Lodhi et al., 1994). Senyawa polifenol
perlu dihilangkan agar diperoleh kualitas DNA yang baik (Moyo et al., 2008).
Polifenol juga dapat menghambat reaksi dari enzim Taq polimerase pada saat
dilakukan amplifikasi. Disamping itu polifenol akan mengurangi hasil ektraksi
DNA serta mengurangi tingkat kemurnian DNA (Porebskiet al., 1997).
Penggunaan 2-mercaptoethanol dengan pemanasan juga dapat mendenaturasi
protein yang mengkontaminasi DNA (Walker dan Rapley, 2008).

Konsentrasi dan pH dari bufer yang digunakan harus berada dalam rentang
pH 5 sampai 12. Larutan buffer dengan pH rendah akan mengkibatkan
depurifikasi dan mengakibatkan DNA terdistribusi ke fase fenol selama proses
deproteinisasi. Sedangkan pH larutan yang tinggi di atas 12 akan mengakibatkan
pemisahan untai ganda DNA. Fungsi larutan buffer adalah untuk menjaga struktur
DNA selama proses penghancuran dan purifikasi sehingga memudahkan dalam
menghilangkan protein dan RNA serta mencegah aktivitas enzim pendegradasi
DNA dan mencegah perubahan pada molekul DNA. Untuk mengoptimalkan
fungsi larutan buffer, dibutuhkan konsentrasi, pH, kekuatan ion, dan penambahan
inhibitor DNAase dan detergen (Surzycki 2000).

Pada tahapan ekstraksi DNA, seringkali digunakan chelating agent seperti


ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menginaktivasi enzim
DNAse yang dapat mendenaturasi DNA yang diisolasi, EDTA menginaktivasi
enzim nuklease dengan cara mengikat ion magnesium dan kalsium yang
dibutuhkan sebagai kofaktor enzim DNAse (Corkill dan Rapley, 2008). DNA
yang telah diekstraksi dari dalam sel selanjutnya perlu dipisahkan dari kontaminan
komponen penyusun sel lainnya seperti polisakarida dan protein agar DNA yang
didapatkan memiliki kemurnian yang tinggi. Fenol seringkali digunakan sebagai
pendenaturasi protein, ekstraksi dengan menggunakan fenol menyebabkan protein
kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat
dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi (Karp, 2008). Bettelheim dan
Landesberg (2007) menyebutkan bahwa setelah sentrifugasi akan terbentuk 2 fase
yang terpisah yakni fase organik pada lapisan bawah dan fase aquoeus (air) pada
lapisan atas sedangkan DNA dan RNA akan berada pada fase aquoeus setelah
sentrifugasi sedangkan protein yang terdenaturasi akan berada pada interfase dan
lipid akan berada pada fase organik. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran
fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol (PCIA)
untuk mendenaturasi protein. Ekstrak DNA yang didapat seringkali juga
terkontaminasi oleh RNA sehingga RNA dapat dipisahkan dari DNA ekstrak
dengan cara pemberian RNAse (Birren, et al., 1997; Clark, 2010).

Asam nukleat adalah molekul hidrofilik dan bersifat larut dalam air.
Disamping itu, protein juga mengandung residu hidrofobik yang mengakibatkan
protein larut dalam pelarut organik. Berdasarkan sifat ini, terdapat beberapa
metode deproteinisasi berdasarkan pemilihan pelarut organik. Biasanya pelarut
organik yang digunakan adalah fenol atau kloroform yang mengandung 4%
isoamil alkohol. Penggunaan kloroform isoamil alkohol (CIA) berdasarkan
perbedaan sifat pelarut organik. Kloroform tidak dapat bercampur dengan air dan
kemampuannya untuk mendeproteinisasi berdasarkan kemampuan rantai
polipeptida yang terdenaturasi untuk masuk atau termobilisasi ke dalam fase
antara kloroform – air. Konsentrasi protein yang tinggi pada fase antara tersebut
dapat menyebabkan protein mengalami presipitasi. Sedangkan lipid dan senyawa
organik lain akan terpisah pada lapisan kloroform (Clark, 2010).
Proses deproteinisasi yang efektif bergantung pada besarnya fase antara
kloroform-air. Proses ini dapat dilakukan dengan membentuk emulsi dari air dan
kloroform. Hal ini hanya dapat dilakukan dengan penggojogan atau sentrifugasi
yang kuat karena kloroform tidak dapat bercampur dengan air. Isoamil alkohol
berfungsi sebagai emulsifier dapat ditambahkan ke kloroform untuk membantu
pembentukan emulsi dan meningkatkan luas permukaan kloroform-air yang mana
protein akan mengalami presipitasi. Penggunaan kloroform isoamil alkohol ini
memungkinkan untuk didapatkan DNA yang sangat murni, namun dengan ukuran
yang terbatas (20.000–50.000 bp). Fungsi lain dari penambahan CIA ini adalah
untuk menghilangkan kompleks CTAB dan meninggalkan DNA pada fase
aquoeus. DNA kemudian diikat dari faseaquoeus dengan presipitasi etanol
(Surzycki, 2000).

Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui


presipitasi.Pada umumnya digunakan etanol atau isopropanol dalam tahapan
presipitasi. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus
sehingga DNA menggumpal membentuk struktur fiber dan terbentuk pellet
setelah dilakukan sentrifugasi (Switzer, 1999).Hoelzel (1992) juga menambahkan
bahwa presipitasi juga berfungsi untuk menghilangkan residu-residu kloroform
yang berasal dari tahapan ekstraksi.

Menurut Surzycki (2000), prinsip-prinsip presipitasi antara lain pertama,


menurunkan kelarutan asam nukleat dalam air. Hal ini dikarenakan molekul air
yang polar mengelilingi molekul DNA di larutan aquoeus. Muatan dipole positif
dari air berinteraksi dengan muatan negatif pada gugus fosfodiester DNA.
Interaksi ini meningkatkan kelarutan DNA dalam air. Isopropanol dapat
bercampur dengan air, namun kurang polar dibandingkan air. Molekul isopropanol
tidak dapat berinteraksi dengan gugus polar dari asam nukleat sehingga
isopropanol adalah pelarut yang lemah bagi asam nukleat; kedua, penambahan
isopropanol akan menghilangkan molekul air dalam larutan DNA sehingga DNA
akan terpresipitasi; ketiga, penggunaan isopropanol dingin akan menurunkan
aktivitas molekul air sehingga memudahkan presipitasi DNA.
Pada tahapan presipitasi ini, DNA yang terpresipitasi akan terpisah dari
residu-residu RNA dan protein yang masih tersisa. Residu tersebut juga
mengalami koagulasinamun tidak membentuk struktur fiber dan berada dalam
bentuk presipitat granular.Pada saat etanol atau isopropanol dibuang dan pellet
dikeringanginkan dalam tabung, maka pellet yang tersisa dalam tabung adalah
DNA pekat.Proses presipitasikembali dengan etanol atau isopropanol sebelum
pellet dikeringanginkan dapat meningkatkan derajat kemurnian DNA yang
diisolasi (Bettelheim dan Landesberg, 2007). Keller dan Mark (1989)
menerangkan bahwa pencucian kembali pellet yang dipresipitasi oleh isopropanol
dengan menggunakan etanol bertujuan untuk menghilangkan residu-residu garam
yang masih tersisa. Garam-garam yang terlibat dalam proses ekstraksi bersifat
kurang larut dalam isopropanol sehingga dapat terpresipitasi bersama DNA, oleh
sebab itu dibutuhkan presipitasi kembali dengan etanol setelah presipitasi dengan
isopropanol untuk menghilangkan residu garam (Ausubel et al., 2003).

Setelah dilakukan proses presipitasi dan dilakukan pencucian dengan


etanol, maka etanol kemudian dibuang dan pellet dikeringanginkan, perlakuan
tersebut bertujuan untuk menghilangkan residu etanol dari pelet DNA.
Penghilangan residu etanol dilakukan dengan cara evaporasi karena etanol mudah
menguap (Surzycki, 2000). Pada tahap pencucian biasanya etanol dicampur
dengan ammonium asetat yang bertujuan untuk membantu memisahkan
kontaminan yang tidak diinginkan seperti dNTP dan oligosakarida yang terikat
pada asam nukleat (Sambrook et al., 2001).

Setelah pellet DNA dikeringanginkan, tahap selanjutnya adalah


penambahan buffer TE ke dalam tabung yang berisi pellet dan kemudian disimpan
di dalam freezer dengan suhu sekitar -20ºC. Verkuil et al. (2008) menyatakan
bahwa buffer TE dan penyimpanan suhu pada -20ºC bertujuan agar sampel DNA
yang telah diekstraksi dapat disimpan hingga waktu berminggu-minggu. Keller
dan Mark (1989) juga menjelaskan bahwa pelarutan kembali dengan buffer TE
juga dapat memisahkan antara RNA yang mempunyai berat molekul lebih rendah
dibandingkan DNA sehingga DNA yang didapatkan tidak terkontaminasi oleh
RNA dan DNA sangat stabil ketika disimpan dalam keadaan terpresipitasi pada
suhu -20ºC.

Isolasi DNA juga dapat dilakukan dengan menggunakan kit yang sudah
diproduksi oleh beberapa perusahan untuk mempermudah dan mempercepat
proses isolasi DNA. Kit isolasi juga disesuaikan dengan kebutuhan oleh
konsumen dan jenis sel yang akan digunakan.

Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.


Prinsipnya ada dua yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan
teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
Molekul yang mempunyai berat molekul yang besar berada di bagian bawah
tabung dan molekul ringan akan berada dibagian atas tabung. Hasil sentrifugasi
akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah yaitu spernatan pada bagian
atas dan pelet dibagian bawah(cambell dkk, 2002:115 dalam saputra,
2013).Langkah awal setiap percobaan di bidang biologi molekuler adalah
memperoleh DNA yang dapat berasal dari berbagai jaringan atau sel
makhlukhidup. Prinsip dasar isolasi / ekstrasi DNA adalah penghancuran dinding
dan membrane sel, pemisahan DNA dari debris sel dan purifikasi DNA. Dalam
melakukan metode ekstrasi DNA yang digunakansangat begantung pada sumber
DNA-nya, apakah dari sela atau jaringan, hewan, tumbuhan, atau
mikroorganisme. (Mustikaningtyas, 2014).

ALAT DAN BAHAN

 Alat

No Alat Fungsi

1 Mikropipet ukuran 0,5-20 μL, 10- Mengambil dan memindahkan


100 μL, dan 100-1000 μL larutan atau sampel

2 Mikrotip warna putih, kuning, dan Mengambil dan memindahkan


biru larutan atau sampel bersama dengan
mikropipet

3 Mikrotube Tempat untuk menampung larutan


atau sampel

4 Neraca digital Menimbang berat sampel yang akan


digunakan

5 Mortar Tempat untuk menggerus sampel

6 Pistil Menggerus sampel

7 Inkubator Menyimpan sampel dengan suhu


tertentu

8 Sentrifuge Menyentrifugasi sampel agar


terbentuk pellet dan supernatan

9 Vortex Menghomogenkan sampel

10 Pinset Memindahkan sampel otot mencit


sebelum di gerus

11 Cawan petri Tempat mencuci sampel otot mencit


sebelum digerus

12 Tempat sampah tip Menampung tip yang telah


digunakan

13 Nanodrop Spektrofotometer Mengukur kuantitas hasil isolasi


DNA

 Bahan

No Bahan Fungsi

1 Otot mencit Sebagai sampel yang akan diisolasi


DNA nya

2 5M NaCl Menjaga keisotonisan DNA sampel

3 1M Tris pH 8,0 Menjaga pH DNA

4 0,5 EDTA pH 8,0 Melisiskan sel, sebagai buffer, serta


menjaga DNA agar tidak rusak

5 dH2O Melarutkan DNA hasil isolasi


6 Protein kinase K Sebagai pemurnian protein

7 Larutan PCIA Sebagai pelarut dan pengendap


(Phenol/Chloroform/Isoamyl protein
Alcohol)

8 Alkohol 70% Mengendapkan DNA

9 Buffer TE Menjaga DNA agar tidak rusak

10 Larutan PBS Mencuci sampel otot mencit sebelum


digerus

11 Akuades Membersihkan area cuvet pada


Nanodrop Spektrofotometer

12 Kertas lensa Membersihkan area cuvet pada


Nanodrop Spektrofotometer

PROSEDUR KERJA

 Pembuatan larutan NTES Lysis Buffer

Disiapkan mikrotube 2 mL untuk menampung larutan NTES

Dimasukkan 20 μL 5M NaCl ke dalam mikrotube

Ditambahkan 50 μL 1M Tris pH 8,0 ke dalam mikrotube

Ditambahkan 100 μL 0,5M EDTA pH 8,0 ke dalam mikrotube

Ditambahkan 100 μL 10% SDS ke dalam mikrotube

Ditambahkan 730 μL dH2O ke dalam mikrotube

Ditambahkan 10 μL protein kinase ke dalam mikrotube

Dihomogenkan semua bahan dalam mikrotube dengan vortex


 Pengisolasian DNA dari otot mencit

Ditimbang otot mencit sebanyak 30 gram dengan neraca digital

Dipindahkan otot mencit ke cawan petri

Dicuci otot mencit menggunakan larutan PBS sampai darah hilang

Dipindahkan otot mencit ke mortar, kemudian di gerus dengan pistil

Dimasukkan sampel hasil gerusan ke dalam mikrotube 2 mL

Ditambahkan 500 μL NTES Lysis Buffer pada sampel

Diinkubasi pada suhu 50ᵒC dalam inkubator selama semalam (overnight)

Ditambahkan 500 μL larutan PCIA (Phenol/Chloroform/Isoamyl Alcohol)


dengan perbandingan 25:24:1, dihomogenisasi dengan pipetting, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang

Dipindahkan aqueous phase (supernatant) pada tabung mikrotube baru


(maksimal 300-400 μL)

Ditambahkan 500 μL 100% alcohol dan tabung mikrotube dibolak-balik secara


perlahan (5-10 kali)

Disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang,
kemudian membuang supernatan

Dicuci DNA pellet dengan 500 μL 70% alcohol, kemudian disentrifugasi


dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang

Dikeringanginkan tabung mikrotube setelah membuang sisa alcohol 70%


dalam tabung selama 20-30 menit
Dilarutkan DNA hasil isolasi dengan 10-20 μL dH2O atau TE buffer, kemudian
nantinya dilanjutkan dengan kuantifikasi konsentrasi DNA pada nanodrop

 Pengukuran kuantitas dan kemurnian DNA menggunakan Nanodrop


Spektrofotometer

Dinyalakan komputer

Diklik software Nanodrop Spektrofotometer yang ada pada desktop komputer

Dibersihkan area kuvet nanodrop spektrofotometer dengan memasukkan 3 μL


akuades steril dan ditunggu 3 menit

Dibersihkan area kuvet dengan menggunakan kertas lensa hingga bersih

Dipilih jenis sampel yang akan diukur konsentrasi dan kemurniannya

Dimasukkan 1 μL buffer pelarut sesuai dengan sampel yang diukur

Diklik ‘blank’ kemudian dibersihkan area kuvet dengan menggunakan kertas


lensa hingga bersih

Diberi nama kode sampel

Dimasukkan 1 μL sampel hasil isolasi, diklik ‘measure’

Dipilih area simpan file, diklik ‘save’

Dianalisis grafik yang dihasilkan


Dibersihkan area kuvet dengan menggunakan kertas lensa hingga bersih

Dibersihkan area kuvet nanodrop spektrofotometer dengan memasukkan 3 μL


akuades steril dan ditunggu 3 menit

DATA

No Sample ID 260/280

1 DNA_2 0,99

ANALISIS DATA

Isolasi DNA yang dilakukan menggunakan otot mencit. Uji kualitas DNA
pada sampel dilakukan dengan alat nanodrop. Hasil dari uji sampel dengan
menggunakan nanodrop adalah bahwa sampel berlabel DNA_2 (dilihat tabel
260/280) senilai 0,99. Hasil tersebut menunjukkan bahwa sampel tidak murni.
Tidak murninya sampel yang ditunjukkan oleh angka 0,99 disebabkan sampel
terkontaminasi protein.

PEMBAHASAN

Pada pengukuran kuantitas hasilhasil isolasi DNA dan kontaminasi DNA


digunakan otot mencit sebagai sampel percobaan. Menurut Andriani dan Fery
(2013) DNA dapat diisolasi dari setiap bagian mahkluk hidup yang
mengandung nukleus atau inti sel. Sampel otot mencit mulanya diisolasi untuk
memperoleh DNA murninya untuk kemudian di uji dan dianalisis. Setelah
diperoleh DNA murni dari otot mencit, selanjutnya di lakukan uji kuantitatif DNA
pada alat nanodrop spektrofotometer dengan panjang gelombang (λ) = 260 nm
untuk mengetahui kemurnian dari DNA pada sampel.

Pemilihan panjang gelombang sangat menentukan dalam percobaan karena


apabila terjadi penyimpangan yang kecil selama percobaan akan mengakibatkan
kesalahan yang kecil dalam pengukuran. Jika pemilihan panjang gelombang
memiliki spektrum perubahan besar pada nilai absorbansi saat panjang gelombang
sempit, maka apabila terjadi penyimpangan kecil pada cahaya yang masuk akan
mengakibatkan kesalahan besar dalam pengukuran. Semakin besar panjang
gelombangnya maka akan semakin kecil nilai absorbansinya. Hal ini dapat
diakibatkan sinar putih pada setiap panjang gelombang dapat terseleksi lebih
detail oleh prisma (Underwood 1990).

Berdasarkan analisis yang telah dilakukan, hasil uji nanodrop


spektofotometer dengan sampel hasil isolasi DNA otot mencit adalah 0,99.
Sedangkan kemurnaian DNA akan tercapai 100% bila rasio A260/A280 berkisar 1.8-
2.0. ketika rasio dibawah 1.8 maka diketahui sampel pada hasil isolasi DNA
tersebut adalah kontam protein sedangkan apabila kisaran rasio diata 2.0 maka
kontam RNAse (Sambrooket al. 1989).

Unsur-unsur terpenting suatu spektrofotometer adalah (1) Sumber energi


radiasi yang kontinu dan meliputi daerah spektrum, di mana alat ditujukan untuk
dijalankan, (2) Monokromator, yang merupakan suatu alat untuk mengisolasi
suatu berkas sempit dari panjang gelombang-panjang gelombang daru spektrum
luas yang disiarkan oleh sumber (tentu saja tepat monokromatisitas tidak dicapai),
(3)Wadah untuk contoh, kuvet yang terbuat dari kuarsa memeliki ketelitian yang
tinggi, (4) Detektor yang merupakan suatu transducer yang mengubahenergi
radiasi menjadi isyarat listrik, (5) Penguat dan rangkaian yang bersangkutan yang
membuat isyarat listrik cocok untuk diamati, (6) Sistem pembacaan yang dapat
mempertunjukkan besarnya isyarat listrik (Rohman. 2007).

Penyebab kesalahan sistematik yang sering terjadi dalam analisis


menggunakan spektrofotometer adalah serapan oleh pelarut. Hal ini dapat diatasi
dengan penggunaan blangko, yaitu larutan yang berisi matrik selain komponen
yang akan dianalisis. Kesalahan kedua serapan oleh kuvet. Kuvet yang biasa
digunakan adalah dari bahan gelas atau kuarsa. Dibandingkan dengan kuvet dari
bahan gelas, kuvet kuarsa memberikan kualitas yang lebih baik, namun tentu saja
harganya jauh lebih mahal. Serapan oleh kuvet ini diatasi dengan penggunaan
jenis, ukuran, dan bahan kuvet yang sama untuk tempat blangko dan
sampel.Kesalahan ketiga fotometrik normal pada pengukuran dengan absorbansi
yang sangat rendah atau sangat tinggi. Hal ini dapat diatur dengan pengaturan
konsentrasi, sesuai dengan kisaran sensitivitas dari alat yang digunakan. (melalui
pengenceran atau pemekatan) (Beran, J.A 1996).

KESIMPULAN

Hasil isolasi dan pengukuran kadar DNA pada praktikum kali ini
memberikan hasil dengan nilai sebesar 0,99 yang artinya sampel DNA yang di uji
terkontaminasi oleh molekuk protein

Daftar Rujukan

Adriani, Nita L. dan Fery Prawira Gurusinga. 2013. Isolasi DNA Manusia
(Epitelial Mulut dan Darah) dan Teknik PCR dan Isolasi Protein Dari
Darah, Elektroforesis Agarose, dan SDS-PAGE. (online). (https://s3-us-
west-2.amazonaws.com). Diakses pada 7 Maret 2018.

Beran, J.A. 1996. Chemistry in The Laboratory. John Willey & Sons.

Mustikaningtyas. 2014. Buku Ajar Praktikum Biologi Molekuler. Semarang:


FMIPA UNNES.
Priyambodo. 2017. Prinsip, Metode, dan Teknik Isolasi DNA, (online) (http//:
http://staff.unila.ac.id/priyambodo/archives/646) diakses 8 Maret 2018

Rohman. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta : Pustaka Pelajar

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory


Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Underwood, A. L. 1990. Analisis Kimia Kiantitatif Edisi ke Enam. Erlangga.


Jakarta.

Lampiran dan Data


Gambar 1: Proses pemasukan larutan-larutan yang berperan dalam isolasi DNA
(Sumber: Dokumen pribadi)

Gambar 2: Tahap sentrifugasi sampel yang akan diisolasi DNA nya (Sumber:
Dokumen pribadi)

Gambar 3: Proses pengambilan supernatan setelah sampel disentrifugasi (Sumber:


dokumen pribadi)
Gambar 4: Sampel hasil sentrifugasi (Sumber: Dokumen pribadi)

Gambar 5: Proses pemasukan sampel ke area cuvet nanodrop (Sumber: Dokumen


pribadi)
Gambar 6: Grafik hasil pengukuran kadar DNA menggunakan nanodrop
spektrofotometer (Sumber: Dokumen pribadi)

Gambar 7: Hasil pengukuran yang dijabarkan dalam bentuk tabel. Sampel yang
praktikan amati mendapatkan nilai 0,99 (Pada kolom bertanda 260/280) yang
artinya sampel praktikan terkontaminasi oleh molekul protein (Sumber: Dokumen
pribadi)