Anda di halaman 1dari 150

BAB I

PENGANTAR

Biokimia mempelajari bagaimana sifat luar biasa dari organisme hidup dapat timbul dari ribuan biomolekul tak bernyawa yang berbeda yang saling berinteraksi secara kimia. Ketika molekul ini diisolasi dan diperiksa secara individual , mereka semua mengikuti hukum-hukum fisika dan kimia yang menggambarkan perilaku materi tak hidup dan semunya itu terjadi dalam organisme hidup. Studi biokimia ditekankan bagaimana koleksi molekul mati dalam organisme hidup berinteraksi untuk mempertahankan dan melestarikan kehidupan yang kesemuanya semata-mata dianamiasikan oleh hukum-hukum fisika dan kimia yang mengatur alam semesta tak hidup. Namun organisme memiliki atribut sifat yang luar biasa yang membedakan mereka dari koleksi-koleksi lain di luar makluk hidup. Ciri ciri yang membedakan organisme hidup tersebut adalah:

- Memiliki kompleksitas kimia dan organisasi mikroskopis tingkat tinggi

- Memiliki sistem untuk mengekstraksi, mengubah, dan menggunakan energi dari lingkungan

- Memiliko kapasitas untuk tepat replikasi diri dan self-assembly

- Memiliki meekanisme untuk merasakan dan merespon perubahan di lingkungan mereka

- Fungsi untuk masing-masing komponen mereka sangat spesifik

- Interaksi diantara di antara mereka dapat diatur

.- Memiliki sebuah sejarah evolusi.

A. Domain Kehidupan

Semua organisme hidup jatuh ke salah satu dari tiga kelompok besar ( kerajaan atau domain ) yang mendefinisikan tiga cabang evolusi dari nenek moyang yang sama (Gambar 1 ) . Dua kelompok besar prokariota dapat dibedakan atas dasar sifat

1

biokimianya: archaebacteria (Yunani arche - , " asal" ) dan Eubacteria (dari bahasa Yunani eu , "true " ). Eubacteria menghuni tanah , air permukaan , dan jaringan hidup lain atau organisme yang membusuk . Sebagian besar bakteri telah dipelajari dengan baik, termasuk Escherichia coli , adalah Eubacteria . Archaebacteria , baru- baru ini ditemukan dan belumbanyak dipahami secara biokimia, kebanyakan menghuni danau dengan lingkungan ekstrim, lingkungan garam , air panas , rawa sangat asam , dan bagian laut yang dalam. Bukti yang ada menunjukkan bahwa Archaebacteria dan Eubacteria terpisah di awal evolusi membentu dua domain terpisah , kadang-kadang disebut Archaea dan Bakteri . Semua organisme Eukariotik , yang membentuk domain ketiga, Eukarya , berevolusi dari cabang yang sama dengan Archaea, oleh karena itu Archaebacteria secara biokimia lebih dekat dengan eukariota daripada Eubacteria .

biokimia lebih dekat dengan eukariota daripada Eubacteria . Gambar 1. Pohon Philogenetic dari tiga domain kehidupan

Gambar 1. Pohon Philogenetic dari tiga domain kehidupan

Sel bakteri berbagi sifat-sifat struktural umum tertentu , tetapi juga menunjukkan pengkelompokan spesifik dalam struktur sel pembungkus (Gambar 2), Sebagian Eubacteria adalah bakteri gram positive dan lainnya adalah bacteri gram negatif. E. coli yang merupakan penghuni saluran manusia usus dan biasanya tidak berbahaya, diklasifikasikan sebagai bakteri gram negatif. E. coli memiliki membran pelindung luar (outer membran) dan membran dalam (inner membran) yang membungkus sitoplasma. Antara membran dalam dan luar terdapat lapisan tipis namun kuat yang

2

berupa polimer peptidoglikan. Polimer ini yang memberikan sel bentuk dan kekakuan dari sel. Membran dalam dan lapisan diluarnya membentuk pembungkus sel. Cyanobacteria juga merupakan Eubacteria tetapi dibedakan dengan anggota Eubacteria yang lain oleh sistem membran internalnya yang luas, di mana pigmen fotosintesis terlokalisasi. Meskipun pembungkus sel archaebacteria dan gram -positif dari Eubacteria terlihat sama di bawah mikroskop elektron , struktur lipid membran dan polisakarida dari pembungkus sel jelas berbeda pada archaebacteria.

dari pembungkus sel jelas berbeda pada archaebacteria. Gambar 2. Struktus umum dari bakteri B. Struktur Sel

Gambar 2. Struktus umum dari bakteri

B. Struktur Sel .

Sel adalah unit struktural dan fungsional dari semua organisme hidup . Sel dari semua jenis memiliki struktur yang mirip ( Gambar.3 ). Membran sel, memisahkan sel dari lingkungan sekitarnya Membran terdiri dari lipid dan protein molekul yang membentuk lapisan tipis, tangguh , lentur , hidrofobik mengelilingi sel . Membran

3

adalah penghalang untuk perpindahan secara bebas dari ion-ion anorganik, senyawa- senyawa bermuatan dan senyawa polar paling lainnya. Protein transport dalam plama membran memungkinkan ion dan molekul tertentu menyeberangi membran, protein reseptor memperbolehkan penggiriman sinyal ke dalam sel, dan enzim yang ada pada membran berpartisipasi dalam reaksi biologi yang ada pada membran. Sitoplasma (Gambar 3) terdiri dari larutan berair dan berbagai partikel dengan fungsi tertentu . Sitosol adalah larutan yang sangat pekat yang mengandung enzim/protein dan molekul RNA yang mengkode enzim/protein tersebut, komponen seperti asam amino dan nukleotida yang dapat dirakit menjadi makromolekul, ratusan molekul organik kecil yang disebut metabolit , senyawa antara dalam jalur biosintesis dan hasil-hasil degradasi, koenzim (senyawa penting untuk banyak reaksi enzim-katalis), ion anorganik, dan ribosom (makromolekul kompleks yang terdiri dari protein dan molekul RNA yang merupakan tempat sintesis protein). Semua sel memiliki inti atau nucleoid, di mana disimplan satu set genom lengkap ang berupa molekul DNA dan direplikasi. Nukleoid, pada bakteri, tidak dipisahkan dari sitoplasma oleh membran, sedangkan inti sel pada organisme yang lebih tinggi terdiri dari inti sel yang dipisahkan oleh dua lapisan membran sebagai pembungkus inti sel. Sel dengan pembungkus inti sel disebut eukariota, yang tidak memiliki pembungkus sel adalah prokariota.

yang tidak memiliki pembungkus sel adalah prokariota. Gambar 3. Struktur universal sel-sel hidup. Semua sel

Gambar 3. Struktur universal sel-sel hidup. Semua sel memiliki nukleus atau nucleoid, membran plasma, dan sitoplasma. Sitosol didefinisikan sebagai bagian dari

4

sitoplasma yang tersisa dalam supernatan setelah sentrifugasi dari ekstrak sel pada 150.000 g selama 1 jam.

C. sel eukariotik

Sel eukariotik (Gambar 4) jauh lebih besar daripada sel prokariotik-biasanya 5 sampai 100 µm diameter, dengan volume sel seribu sampai satu juta kali lebih besar dibandingkan dengan bakteri. Karakteristik yang membedakan dari eukariota adalah inti dan berbagai membran organel dibatasi dengan fungsi tertentu: mitokondria, retikulum endoplasma, kompleks Golgi, dan lisosom. Sel tumbuhan juga mengandung vakuola dan kloroplas (Gambar 5). Sel tumbuhan juga memiliki sitoplasma yang di banyak tumbuhan mengandung granula nutrisi yang disimpan sepeerti pati dan lemak

yang di banyak tumbuhan mengandung granula nutrisi yang disimpan sepeerti pati dan lemak Gambar 4. Ilustrasi

Gambar 4. Ilustrasi sel hewan

5

Gambar 5. Ilustratrasi sel tanaman D. Hirarki organisasi makromolekul di dalam sel Di dalam protein,

Gambar 5. Ilustratrasi sel tanaman

D. Hirarki organisasi makromolekul di dalam sel

Di dalam protein, asam nukleat, dan polisakarida, monomernya bergabung dengan ikatan kovalen. Dalam kompleks supramolekul merupakan gabungan makromolekul-makromolekul melalui interaksi noncovalentyang lebih lemah dibandingkan ikatan kovalen. Interaksi noncovalent tersebut meliputi ikatan hidrogen (antara gugus polar), interaksi ionik (antara kelompok dibebankan), interaksi hidrofobik (antara kelompok nonpolar dalam larutan air), dan interaksi van der Waals -yang semuanya memiliki energi yang jauh lebih kecil daripada ikatan kovalen. Interaksi lemah dalam supramolekul tersebut menghasilkan struktur yang unik (Gambar 6).

6

Gambar 6. Hirarki organisasi struktur molekul dalam sel E. Metabolisme Ribuan reaksi kimia dalam sel

Gambar 6. Hirarki organisasi struktur molekul dalam sel

E. Metabolisme

Ribuan reaksi kimia dalam sel dikalatilis oleh enzim. Rekasi-reaksi tersebut terjadi secara berurutan yang diatur secara rapi, dimanana produk dari suatu reaksi merupakan reakatan dari rekasi berikutnya. Nutrisi organik didegradasi menjadi produk akhir yang sederhana untuk mengekstrak energi kimia dan mengubahnya menjadi molekul lain yang berguna bagi sel, reaksi ini menghasilkan energy bebas dan disebut sebagai katabolisme. Di sisi lain mekul prekursor kecil dikonversi

7

menjadi molekilyang lebih besar besar dan lebih kompleks seperti halnya termasuk

lebih besar besar dan lebih kompleks seperti halnya termasuk Gambar 7. ATP dan NADH adalah molekul

Gambar 7. ATP dan NADH adalah molekul yang menghubungkan anabolisme dan katabolisme

protein dan asam nukleat. Jalur sintetis seperti selalu memerlukan masukan energi

dan disebut sebagai anabolisme. Gabungan antara katabolisme dan anabolisme

disebut dengan istilah metabolisme

dan dan anabolisme yang berfungsi sebagai molekul pembawa energi (ditunjukkan

secara skematis pada Gambar . 7). Jalur reaksi enzim -katalis yang bekerja pada

ATP adalah link komponen antara katabolisme

8

konstituen utama dari sel (protein, lemak, gula , dan asam nukleat) hampir identik dalam semua organisme hidup.

9

BAGIAN II

STRUKTUR DAN FUNGSI PROTEIN

APAKAH PROTEIN ITU?

Protein, dari proteios Yunani, yang berarti pertama, adalah kelompok senyawa organik yang ada dalam setiap sel hidup. Protein memainkan peran penting dalam hampir semua proses biologi . Molekul protein merupakan polimer dari asam amino dimana molekul protein berbeda satu sama lainnya terutama dalam urutan asam aminonya. Urutan asam amino tersebut ditentukan oleh urutan nukleotida dari gen masing masing protein. Kombinasi urutan asam amino menyebabkan lipatan protein dalam struktur tiga dimensi spesifik untuk setiap protein yang berkaibat pada perbedaan aktiftasnya.

Seperti makromolekul biologi yang lain (polisakarida dan asam nukleat), protein adalah. bagian penting dari organisme dan berpartisipasi dalam hampir setiap proses di dalam sel.Contoh fungsi protein dalam proses biologis antara lain :

1 . Katalisis enzimatik .

Hampir semua reaksi kimia dalam sistem biologi dikatalisis oleh makromolekul spesifik yang disebut enzim . Enzim memiliki kekuatan katalitik yang sangat besar dimana enzim mampu meningkatkan laju reaksi yang dikatalisisnya jutaan kali dibandingkan tanpa katalisis enzimatik. Ribuan enzim telah dipelajari dan semua enzim adalah protein. Dengan demikian protein sangat penting dalam menentukan pola transformasi kimia dalam sistem biologi.

2 . Transportasi dan penyimpanan Banyak molekul kecil dan ion diangkut oleh protein tertentu . Misalnya, hemoglobin mengangkut oksigen dalam eritrosit , sedangkan mioglobin , protein yang mirip hemoglobin , mengangkut oksigen dalam sel otot . Besi ditransportasi di dalam plasma darah oleh protein yang disebut transferin dan disimpan dalam hati sebagai kompleks dengan protein yang disebut feritin

10

3

. Koordinasi gerak .

Protein merupakan komponen utama otot . Kontraksi otot dicapai oleh gerakan geser dua jenis filamen protein . Pada skala mikroskopis, gerakan terkoordinasi seperti gerakan kromosom dalam mitosis dan penggerak sperma oleh flagela dikoordinasi oleh kumpulan protein protein kontraktil

4 . Dukungan mekanik.

Kekuatan tarik tinggi dari kulit dan tulang disebabkan adanya kolagen , protein berserat .

5 . Perlindungan kekebalan Antibodi adalah protein yang sangat spesifik yang mengenali dan menggabungkan dengan zat-zat asing seperti virus dan bakteri . Protein ini memainkan peran penting dalam membedakan antara dirinya dan bukan dirinya .

6 . Generasi dan transmisi impuls saraf.

Respon sel saraf terhadap rangsangan tertentu dimediasi oleh protein reseptor . Misalnya , rodhopsin adalah protein peka cahaya dalam sel batang retina .

7 . Pengendalian pertumbuhan dan diferensiasi

Ekspresi berurutan yang teerkendali dari informasi genetik sangat penting bagi pertumbuhan dan diferensiasi sel-sel yang teratur. Pada bakteri , protein represor adalah elemen kontrol penting pada proses ekspresi DNA sel . Dalam organisme yang lebih tinggi , pertumbuhan dan diferensiasi protein faktor dikendalikan oleh protein faktor pertumbuhan .

Banyak protein telah dimurnikan dengan tujuan untuk mempelajari struktur, fungsi, mekanisme katalitik, interaksinya dengan biomolekul yang lain serta aplikasinya untuk meningkatkan kesejahteraan hidup manusia. Struktur protein menjadi sangat penting untuk mempelajari mekanisme reaksinya serta untuk memodifikasi strukturnya untuk memperbaiki aktifitas biologisnya melalui rekayasa genetika. Struktur protein dipecahkan dari kristlanya dengan metode hamburan sinar X. Struktur protein yang telah dipecahkan umumnya disimpan dalam database yang dapat diakses secara bebas pada URL :www.rcsb.org. Pada pembahasan berikutnya

11

pada bagian ini akan dibahas tentang arsitektur dari protein serta hirarki struktur protein. Arsitektur protein ini sangat penting dimana sangat menentukan fungsinya yang didasari oleh jaringan 3 dimensi dari residu-residu asam amino. Tidak semua bagian dari protein terlibat secara langsung dalam reaksi katalisa, akan tetapi jaringan 3 dimensi residu asam amino sangat penting didalam menjaga integritas struktur protein secara umum yang sangat menopang dareh yang mempunyai aktifitas katalisis secara lansung.

A. 20 Asam Amino yang Menyusun Protein.

Asam amino adalah unit struktural dasar atau monomer dari protein. Di alam asam amino penyusun protein adalah asam - amino yang mengandung gugus amino, gugus karboksilat, atom hidrogen, dan gugus R yang khas, yang semuanya terikat dan atom karbon Gugus R disebut sebagai rantai samping yang strukturnya berbeda antara satu dan asam amino lain.

yang strukturnya berbeda antara satu dan asam amino lain. Gambar 8. Struktu asam  -amino yang

Gambar 8. Struktu asam -amino yang tidak terionisasi dan yang terionisasi (zwitter ion)

Asam amino dalam larutan dengan pH netral sebagian besar adalah ion dipolar (atau Zwitter ions) (Gambar8). Dalam bentuk dipolar gugus amino terprotonasi (-NH3 +) dan gugus karboksil terinonisasi (COO--). Dalam larutan asam (misalnya, pH1), gugus karboksil dalam tidak terinonisasi (-COOH) dangugus amino terionisasi (- NH3+), dan muatan totalnya adalah+1(Gambar 9). Dalam larutan alkali (misalnya, pH 11), gugus karboksil terionisasi (COO - ) dan gugus amino tidak terionisasi (- NH2), dan muatan titalnya adalah -1. Zat yang memiliki sifat ganda seperti asam amino disebut dengan senyawa amfoter dan sering disebut ampholytes (berasal dari kata "elektrolit amfoter").

12

Kedua puluh jenis rantai samping (R) memiliki variasi dalam hal ukuran, muatan, kapasitas ikatan hidrogen, dan reaktivitas kimia. Semua protein pada semua spesies yang disusun dari kedua puluh sama asam amino tersebut. Protein-protein dengan fungsi berbeda disebabkan dari keaanekaragaman susunan dari ke-20jenis asam amino tersebut yang merupakan building blocks dari protein.Kedua puluh asam amino dapat diklasifikasikan berdasarkan gugus R yang dimiliki menjadi 5 kelompok didasarkan polaritas dan muatannya pada pH 7. Pengelompokan asam amino tersebut adalah:Nonpolar (kelompok alifatik), polar(bermuatan kelompokR), aromatik, bermuatan positif, dan bermuatan negative (Gbr. 10).

Predominantly form at pH 1 Predominantly form at pH 7 Predominantly form at pH 11
Predominantly form
at pH 1
Predominantly form
at pH 7
Predominantly form
at pH 11

Gambar 9.Ionisasi asam amino tergantung pada pH larutan

Asam amino dengan rantai samping nonpolar alifatik.Gugus R kelompok asam amino ini mempunyai sifat nonpolar dan hidrofobik. Rantai samping dari alanin, valin, leusin, isoleusin cenderung mengelompok bersama dalam protein dan menstabilkan struktur protein dengan cara interaksi hidrofobik. Glycine memiliki struktur sederhana dan rantai sampingnya yang sangat kecil berkontribusi nyata terhadap interaksi hidrofobik. Metionin, salah satu dari dua asam amino yang mengandung sulfur, memiliki kelompok tioeter nonpolar dalam rantai samping. Prolin memiliki rantai samping alifatik dengan struktur siklik yang khas. Gugus amino sekunder (imino) pada rantai samping residu prolin memiliki konformasi yang kaku yang berperan mengurangi fleksibilitas struktural daerah polipeptida yang mengandung prolin.

Asam amino dengan gugus R yang bersifat aromatik. Fenilalanin, tirosin, dan triptofan, dengan rantai samping aromatiknya, relatif bersifat nonpolar (hidrofobik). Semuanya dapat berpartisipasi dalam interaksi hidrofobik. Gugus hidroksil dari tirosin dapat membentuk ikatan hidrogen, dan tirosin merupakan adalah rantai samping yang secara fungsional sangat penting dalam beberapa enzim. Tirosin dan

13

triptofan secara signifikan lebih polar daripada fenilalanin, karena adanya gugus hidroksil pada tirosin dan nitrogen dari cincin indol pada triptofan. Triptofan dan tirosin menyerap sinar ultraviolet, sedangkan fenilalanin menyerap dengan intensitas serapan yang lebihrenadh. Sifatnya dalam menyerap sinar UV digunakan oleh para peneliti untuk mendeteksi keberadaan protein dengan mengukur serapan cahaya pada panjang gelombang 280 nm, khususnya digunakan selama proses pemurnian

(Gbr.11).

nm, khususnya digunakan selama proses pemurnian (Gbr.11). Gambar 10. Klasifikasi asam amino nerdasarkan rantai
nm, khususnya digunakan selama proses pemurnian (Gbr.11). Gambar 10. Klasifikasi asam amino nerdasarkan rantai
nm, khususnya digunakan selama proses pemurnian (Gbr.11). Gambar 10. Klasifikasi asam amino nerdasarkan rantai
nm, khususnya digunakan selama proses pemurnian (Gbr.11). Gambar 10. Klasifikasi asam amino nerdasarkan rantai

Gambar 10. Klasifikasi asam amino nerdasarkan rantai sampingnya (R)

14

Asam amino dengan gugus R yang bersifat Polar, Kelompok R dari asam amino ini lebih mudah larut dalam air, atau lebih hidrofilik, dibandingkan dengan asam amino nonpolar, karena mengandung kelompok fungsional yang membentuk ikatan hidrogen dengan air. Kelas ini meliputi asam amino serin, treonin, sistein, asparagin, dan glutamine. Polaritas serin dan treonin yang disumbangkan oleh gugus hidroksil mereka, bahwa sistein oleh kelompok sulfhidril nya, sedangkan asparagin dan glutamin oleh gugus amida mereka. Asparagin dan glutamin mudah dihidrolisis dengan asam atau basa. Sistein mudah teroksidasi untuk membentuk dimer asam amino kovalen yang disebut sistin, di mana dua molekul sistein atau residu residubergabung dengan ikatan disulfida (Gambar 12). Residu disulfida tersebut bersifat sangat hidrofobik (nonpolar). Ikatan disulfida memainkan peran khusus dalam struktur banyak protein dengan membentuk ikatan kovalen antara bagian- bagian dari molekul protein atau antara dua rantai polipeptida yang berbeda.

Asam amino dengan gugus R bermuatan positif.Asamamino yang gugus R memiliki muatan positif yang signifikan pada pH7,0 adalah lisin, yang memiliki gugus amino primer pada posisi pada rantaia lifatiknya. Arginin memiliki gugus guanidine yang bermuatan positif, dan histidin memiliki gugus imidazol. Histidin adalah satu-satunya asam amino yang umum memiliki rantai samping terionisasi dengan pKa pada kondisi mendekati netral. Dalam banyak reaksi enzim-katalis, residu asam asam amino kelompok memfasilitasi reaksi dengan melayani sebagai proton donor/akseptor.

Asam amino dengan gugus R bermuatan negatif. Ada dua sam amino yang memiliki gugus R dengan muatan negatif pada pH7,0 yaitu aspartat dan glutamat, yang masing-masing memiliki gugus karboksil kedua. Gambar 11 menunjukkan perbandingan spectrum penyerapan cahaya dari gugus aromatic dari asam amino triptofan dan tirosin pada pH 6,0 dengan konsentrasi masing-masing 10 -3 M padakondisiyangsama. triptofan memberikan serapan empat kali lipat dibandingkan tirosin. Keduanya mempunyai puncak serapan sekitar panjang gelombang280nm. Serapan asam amino aromatik ini digunakan oleh para peneliti untuk mengukur protein dengan spektroskopi ultra violet. Asam amino lain yang menyerap cahaya

15

pada daerah yang sama adalah fenilalanin, akan tetapi kontribusinya sangat sedikit terhadap spetraprotein sangat sedikit.

sangat sedikit terhadap spetraprotein sangat sedikit. Gambar 11. Absorpsi sinar ultraviolet oleh asam amino

Gambar 11. Absorpsi sinar ultraviolet oleh asam amino aromatik

Asam Amino Memiliki Kurva Titrasi Khusus

Titrasi asam basa melibatkan penambahan atau penghilangan proton secara bertahap. Gambar 12 menunjukkan kurvatitrasi bentuk diprotic glisin. Plot memiliki dua tahap yang berbeda, sesuai dengan deprotonasi dari dua kelompok yang berbeda pada glisin. Masing-masing menyerupai bentuk kurva titrasi asam monoprotik. Pada pHs angat rendah, spesies ion glisin yang dominan adalah bentuk terprotonasi sepenuhnya, +H3NOCH2OCOOH. Pada titik tengah pada tahap pertama titrasi, di mana- COOH glisin kehilangan proton, larutan mengandung equimolar dari donor proton (+ H3NOCH2OCOOH) dan proton-akseptor (+ H3NOCH2OCOO-). Pada titik tengah titrasi, titik belok tercapai dimana pH sama dengan pKa dari gugus terprotonasi yang dititrasi. Untukg lisin, pH pada titik tengah 2.34, demikian yang- COOH memiliki pKa 2,34. Sebagai hasil titrasi, titik penting lain dicapai pada pH 5.97. Pada pH ini terjadi penghilangan proton pertama telah lengkap dan penghilangan proton kedua dimulai. Pada pH ini, glisin sebagian besar berada sebagai ion dipolar +H3NOCH2OCOO-. Tahap kedua titrasi sesuai dengan penghapusan proton dari gugus NH3+ glisin .pH pada titik tengah dari tahap ini adalah 9,60, sama dengan pKa untuk gugus NH3 + . Titrasi kedua selesai pada pH

16

sekitar

H2NOCH2OCOO-.

12,

di

mana

pada

sekitar H2NOCH2OCOO-. 12, di mana pada titik ini bentuk dominan dari glisin adalah Gambar 12. Kurva

titik

ini

bentuk

dominan

dari

glisin

adalah

12, di mana pada titik ini bentuk dominan dari glisin adalah Gambar 12. Kurva titrasi glisin

Gambar 12. Kurva titrasi glisin dan asam glutamat pada konsentrasi 0,1 M.

Dari kurva titrasi glisin kita dapat memperoleh beberapa informasi penting: (1) memberikan ukuran kuantitatif dari pKa dari masing-masing gugus pengion: 2.34 untuk gugus -COOH dan 9,60 untuk gugus -NH3+ kelompok, (2) glisin adalah asam amino yang memiliki dua wilayah kapasitas penyangga, (3) kurva titrasi menunjukkan hubungan antara muatan listrik dan pH larutan. Pada pH 5,97, titik belok antara dua tahap dalam kurva titrasinya, glisin terutama berada sebagai bentuk dipolenya, sepenuhnya terionisasi tetapi dengan tidak ada muatan listrik Karakteristik pH dimana muatan listrik bersih adalah nol disebut titik isoelektrik atau pH isoelektrik (pI). Untuk glisin, yang tidak memiliki kelompok terionisasi dalam rantai samping, titik isoelektrik hanya rata-rata aritmetik dari dua nilai pKa:

isoelektrik hanya rata-rata aritmetik dari dua nilai pKa: Asam amino Berbeda dalam sifat Asam-Basa. Sifat umum

Asam amino Berbeda dalam sifat Asam-Basa. Sifat umum asam amino memungkinkan beberapa generalisasiuntuk menyederhanakan tentang perilaku asam-basanya. Pertama, semua asam amino dengan satu gugus -amino, ssatu - karboksil, dan gugus R yang tidak mengionisasi dan memiliki kurva titrasi menyerupai glisin. Asam amino asam amino dengan sifat tersebut sangat mirip,

17

meskipun tidak identik, nilai pKa: pKa gugus -COOH di kisaran 1,8 sampai 2,4, dan pKa gugus -NH3 + dalam kisaran 8,8-11,0 (Tabel 1). Kedua, asam amino dengan gugus R terionisasi memiliki kurva titrasi lebih kompleks, terdiri tiga tahap sesuai dengan tiga langkah ionisasi yang mungkin, sehingga kelompok ini memiliki tiga nilai pKa. Tahap tambahan untuk titrasi dari gugus R terionisasi tersambung sampai batas tertentu dengan dua lainnya. Kurva titrasi untuk dua asam amino jenis ini, glutamat ditunjukkan pada Gambar 12. Titik isoelektrik mencerminkan sifat dari gugus R. Sebagai contoh, glutamat memiliki pI sebesar 3,22, jauh lebih rendah dari glisin, karena adanya dua gugus karboksil, yang memiliki rata-rata nilai pKa 3.22, dan memberikan kontribusi muatan total -1 karena diseimbangkan oleh muatan sebesar +1 yang disumbangkan oleh gugus amino.

Gambar 13. Pembentukan ikatan peptida melalui reaksi kondensasi

B. Peptida

Peptida adalah rantai asam amino. Dua molekul asam amino dapat bergabung secara kovalen melalui ikatan peptida untuk menghasilkan dipeptida (Gambar. 13). Penggabungan seperti ini dibentuk melalui penghilangan satu moleku air (dehidrasi) dari gugus -karboksil dari satu asam amino dan gugus -amino </MCID 92>>BDqdgus

18

Tabel 1. Sifat-sifat dari asam amino esensial.

Tabel 1. Sifat-sifat dari asam amino esensial. dengan dua ikatan peptida membentuk suatu tripeptida, demikian pula

dengan dua ikatan peptida membentuk suatu tripeptida, demikian pula asam amino bisa dihubungkan membentuk tetrapeptides, pentapeptides, dsb. Bila hanya beberapa asam amino bergabung dalam model ini, strukturnya seringkali disebut oligopeptida. Ketika banyak asam amino yang bergabung hasilnya disebut polipeptida. Asam amino dalam suatu polipeptida seringkali disebut dengan residu asam amino. Protein mungkin memiliki ribuan residu asamamino. Peptida hanya mempunyai satu gugus

19

-amino bebas satu gugus -karboksil bebas yang terletak pada ujung-ujung rantai. Gugus-gugus ini dapat terionisasi seperti pasa asam amino bebas, meskipun konstanta ionisasinya berbeda karena gugusnya tidak lagi terkait dengan karbon .

Gugus - amino dan - karboksil dari semua asam amino non terminal bergabung secara kovalen dalam ikatan peptida, yang tidak dapat terionisasi sehingga tidak memberikan kontribusi pada sifat asam-basa dari peptida. Akan tetapi, kelompok R dari beberapa asam amino yang dapat terionisasi berkontribusi terhadap sifat asam- basa keseluruhan molekul. Jadi perilaku asam-basa peptida dapat diperkirakan dari gugus - amino dan - karboksil bebas serta sifat dan jumlah gugus R nya yang terionisasi. Seperti asam amino bebas, peptida memiliki kurva titrasi karakteristik dan pH isoelektrik karakteristik (pI) di mana mereka tidak bergerak dalam medan listrik. Sifat ini dimanfaatkan untuk mengendapkan popipeptida pada titik isoelektriknya. Perlu ditekankan bahwa nilai pKa untuk gugus R terionisasi dapat sedikit berubah ketika asam amino menjadi residu dalam peptida. Hilangnya muatan dalam kelompok - karboksil dan - amino, interaksi dengan kelompok R peptida lainnya , dan faktor lingkungan lainnya dapat mempengaruhi pKa tersebut. Nilai- nilai pKa untuk gugus R tercantum dalam Tabel 1. Nilai tersebut dapat menjadi panduan yang berguna untuk rentang pH di mana suatu gugus tertentu akan terionisasi, tetapi mereka tidak dapat digunakan dengan baik untuk peptide.

Peptida aktif dan protein dalam system biologis terdapat dalam berbagai macam ukuran. Generalisasi berat molekul peptida yang aktif secara biologis dan protein tidak dapat dibuat dalam kaitannya dengan fungsi mereka. Peptida yang sangat endek dapat memiliki efek biologis penting, seperti dipeptida L-Aspartyl-L- fenilalanin metil ester yang disintesisi secara komersial dan digunakan sebagai pemanis buatan yang lebih dikenal sebagai aspartam atau Nutra Sweet. Hormon Pankreas seperti insuli memiliki 30 residu, sedangkan glukagon memiliki 28 residu. Tabel 2 menunjukkan berbagai protein dipelajari dalam ukuran. Setiap protein biologis aktif memiliki urutan asam amino yang unik. Banyak protein, misalnya enzim ribonuklease A dan chymotrypsinogen, mengandung residu asam amino hanya dan tidak ada kandungan kimia lain, ini dianggap protein sederhana. Namun, beberapa protein mengandung komponen kimia yang terikat secara permanen di samping komponen residuasam amino. Protein semacam ini disebut protein

20

terkonjugasi. Bagian non-asama amino dari protein terkonjugasi biasanya disebut gugus prostetik. Protein terkonjugasi dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat kimia dari gugus prostetik mereka (Tabel 3), misalnya, lipoprotein mengandung lipid, glikoprotein mengandung gugus gula, dan metalloproteins mengandung logam tertentu. Sejumlah protein mengandung lebih dari satu kelompok prostetik. Biasanya gugus prostetik memainkan peran penting dalam fungsi biologis protein.

Tabel 2. Berat molekul dari beberapa protein

peran penting dalam fungsi biologis protein. Tabel 2. Berat molekul dari beberapa protein Tabel 3. Protein

Tabel 3. Protein terkanyugasi

peran penting dalam fungsi biologis protein. Tabel 2. Berat molekul dari beberapa protein Tabel 3. Protein

21

C.

Struktur protein

Dalam mempelajari makromolekul besar seperti protein struktur dipahami dan dijelaskan melalui pendekatan secara konseptual dari kompleksitasnya. Hirarki struktur dari protein dapa dijelaskan dalamempat tingkat struktur kompleksitas:

struktur primer, sekunder, tersier. Sebelum membahas tentang struktur protein, perlu dipahami tentang planaritas dari ikatan peptida. Setiap ikatan peptida memiliki karakter ikatan ganda tidak bisa berputar (Gambar 14a) Tiga ikatan secara berurutan memisahkan atom karbon dengan atom karbon lainya dalam rantai polipeptida.

Ikatan N-C dan C-C dapat memutar, dengan sudut ikatan ditunjukkan dengan

dan pada Gambar 14b dan 14 c. Ikatan peptida C-N tidak bebas berputar. Ikatan tunggal lainnya pada tulang punggung rantai peptida juga mungkin susah memutar tergantung pada ukuran rantai samping R. Kekakuan ikatan peptida dan ikatan lainnya mempegaruhi struktur dari protein.

pada ukuran rantai samping R. Kekakuan ikatan peptida dan ikatan lainnya mempegaruhi struktur dari protein. (a)

(a)

pada ukuran rantai samping R. Kekakuan ikatan peptida dan ikatan lainnya mempegaruhi struktur dari protein. (a)

22

(b)

(c) Fig.14. Struktur planar gugus peptida Gambar 15. Hirarki struktur Protein D. Hirarki struktur protein

(c)

Fig.14. Struktur planar gugus peptida

(c) Fig.14. Struktur planar gugus peptida Gambar 15. Hirarki struktur Protein D. Hirarki struktur protein Sebagai

Gambar 15. Hirarki struktur Protein

D. Hirarki struktur protein

Sebagai polimer asam amio perotein memiliki komplesitas yang berbeda. Berdasarkan kompleksitas ikatan kimianya antara residu asam amino struktur protein dapat dikelompokkan menjadi struktur primer, sekunder, tersier dan kuarterner(gambar 15).

1).StrukturPrimer:

Struktur primer protein merupakan urutan asam amino dalam rantai polipeptida, yang dihubungkan melalui ikatan peptide dan disulfide yang membentuk

23

tulang punggung dari protein melalui katan kovalen (Gambar 16). Urutan asam amino dibaca dari asam amino N-terminal ke asam amino C-terminal.

dibaca dari asam amino N-terminal ke asam amino C-terminal. Gambar 16. Animasi struktur primer protein 2)

Gambar 16. Animasi struktur primer protein

2) Struktur Sekunder.

Struktur sekunder dari protein adalah bentuk geometris tertentu yang disebabkan oleh ikatan hidrogen intra molekul dan antar molekul protein yang dibentuk antar gugus-gugus amida dan karbonil. Struktur sekunder merujuk pada konformasi lokal beberapa bagian dari polipeptida. Pembahasan struktur sekunder yang paling berguna difokuskan pada pola lipatan umum secara reguler dari backbone polipeptida. Beberapa jenis struktur sekunder ini sangat stabil dan banyak didapatkan dalam protein. Struktur sekunder yang paling banyak dijumpai adalah -

24

helix

dan

konformasi

yang

dijelaskan

secara

lebih

detai

sebagai

berikut:

 yang dijelaskan secara lebih detai sebagai berikut: Gambar 17. Struktur  -helix Komformasi  -helix

Gambar 17. Struktur -helix

Komformasi -helix. Pengaturan struktur polipeptida yang paling sederhana sebagi akibat kekakuan iktan peptida adalah struktur memutar seperti spiral yang oleh Pauling dan Corey disebut -heliks (Gambar 17). Dalam struktur init ulang punggung polipeptida memutar di sekitar sumbui majiner yang ditarik membujur melalui tengah helix, dan gugus R dari residu asam amino menonjol keluar dari tulang punggung heliks. Unit ulangan dari satu putaran helix adalah sekitar 5, 4Å sepanjang sumbu imajiner. The -helix ditemukan dominan di -keratin. Secara umum, sekitar seperempat dari semua residu asam amino dalam polipeptida ditemukan dalam struktur =heliks, fraksi -helix yang tepat sangat bervariasi dari satu protein dengan protein lainnya. Selanjutnya percobaan pemodelan membangun struktur -helix menunjukkan bahwa helix dapat terbentuk dalam polipeptida yang terdiri dari baik asam L-atau D-amino, akan tetapi semua residu harus satu seri stereoisomeri. Adanya ,asam D-amino akan mengganggu struktur yang teratur yang

25

terdiri dari asam L-amino, dan sebaliknya. Asam L-amino alami dapat terbentuk -

helix putar kanan atau -heliks putar kiri, tetapi -helix putar kiri belum pernah

ditemukan di dalam protein (Gambar 18)

Tidak semua polipeptida dapat membentuk -helix yang stabil. Interaksi

antara rantai samping asam amino dapat menstabilkan atau mengacaukan struktur

ini. Sebagai contoh, jika sebuah rantai polipeptida memiliki residu Glu yang

berulang, segmen rantai tidak akan membentuk helix pada pH 7,0. The rantai

samping dari gugus karboksil yang bermuatan negatif dari residu Glu yang

berdekatan akan saling tolak dengan kuat sehingga mencegah pembentukan struktur

helix . Dengan alasan yang sama, jika ada banyak Lys berdekatan dan / atau residu

Arg, yang bermuatan positif pada pH 7,0, mereka juga akan saling tolak dan

mencegah pembentukan heliks . Bentuk rantai samping dari Asn, Ser, Thr, dan

residu Cys juga dapat mengganggu kestabilan sebuah helix jika mereka berdekatan

dalam rantai.

sebuah  helix jika mereka berdekatan dalam rantai. Gambar 18. Heliks putar kiri seperti jari-jari kiri

Gambar 18. Heliks putar kiri seperti jari-jari kiri memutari sumbu searah ibu jari = sedangkan heliks putar kanan kekmpat jari lainnya mengarak berlawanan helix putar kanan

Lima faktor yang mempengaruhi stabilitas sebuah -heliks (1) tolak

anelektrostatik (atau ketertarikan) antararesidu asam aminoyang membentuk heliks

dengangugus RR, (2) ukuran dari gugus R yang berdekatan, (3) interaksi antara dari

gugus R dari 3 atau empat residu yang berurutan, (4) adanya residu Pro dan Gly, dan

(5) interaksi antara residu asam amino diujung segmen heliks dan dipole listrik yang

melekat pada -heliks. Dengan demikian kecenderungan segmen tertentu dari rantai

polipeptida untuk melipat sebagai -heliks tergantung pada identitas dan urutan

residu asam amino dalam segmen tersebut.

26

Gambar 19. Konformasi  dari rantai polipeptida. Pandangan-pandangan atas dan samping mengungkapkan kelompok R

Gambar 19. Konformasi dari rantai polipeptida. Pandangan-pandangan atas dan samping mengungkapkan kelompok R memperluas keluar dari lembar dan menekankan bentuk lipit dijelaskan oleh pesawat dari ikatan peptida.

Konformasi . Istilah konformasi uga dikenal sebagai-sheet (lembaran ).

Residu asam amino dari -sheet , bila dilihat sisi pinggir , membentuk pola zigzag

atau lipitan di mana gugus-gugus R dari residu yang berdekatan dalam satu rantai

mengarah ke arah yang berlawanan . Berbeda dengan tulang punggung -helix yang

rapat, tulang punggung peptida dari -sheet terentang . Seperti -helix , -sheet

strukturnya distabilkan oleh ikatan hidrogen antara oksigen dan hidrogen karbonil

amida ikatan peptida, akan tetapi, ikatan hidrogen dibentuk antara lembaran yang

satu dengan lembaran lain di dekatnya. Bentrekasi antara lembaran satu dengan

lainnya dapat membetuk interalsi paralel - sheet, di mana segmen yang berdekatan

dari rantai polipeptida berada pada arah dari gugus amino ke karboksil , atau

struktur dapat terbentuk sebagai lembar antiparalel (Gambar 19), di mana mereka

mereka mempunyai arah yang berlawanan. Kemungkinkan disebabkan oleh

konfigurasi yang memungkinkan dari jumlah maksimum ikatan hidrogen antara

lembaran, kebanyakan -sheet tidak sempurna datar tetapi cenderung memiliki

membelok ke mengikuti aturan telapak tangan kanan. -sheet yang mengelompok

banyak didapatkan dari inti protein globular. Diagram skematik -sheet

digambaransebagai panah yang mengarah dari amino terminal ke arah karboksil

terinal . Contoh struktur lembar struktur sutra (Gambar 20).

27

Gambar 20. Struktur sekunder dari serat sutra Struktur tersier. Istilah"struktur tersier" mengacu pada seluruh

Gambar 20. Struktur sekunder dari serat sutra

Struktur tersier.

Istilah"struktur tersier" mengacu pada seluruh konformasi tiga dimensi dari polipeptida. Hal ini menunjukkan, dalam ruang tiga-dimensi, bagaimana struktur berkumpul untuk membentuk domain dan bagaimana domain tersebut berhubungan satu sama lain secara spasial. Sebuah domain adalah bagian dari struktur protein yang cukup untuk melakukan suatu reaski kimia atau tugas fisik tertentu seperti pengikatan substrat ataul igan lainnya (Gambar 21).

seperti pengikatan substrat ataul igan lainnya (Gambar 21). Gambar 21. Struktur tersier protein. Struktur Kuarter .

Gambar 21. Struktur tersier protein.

Struktur Kuarter.

Seringkali protein dirakit dari lebih dari satu polipeptida. Struktur kuarter mendefinisikan oligomer dari protein yaitu komposisi polipeptida protein atau protomer. Protein monomer erdiri dari rantai polipeptida tunggal. Protein dimer mengandung dua rantai polipeptida. Homodimers berisi dua rantaipoli peptiday ang

28

sama persis, sedangkan di heterodimer polipeptida yang berbeda (Gambar 22). Struktur tersier dan kuarterner protein yang distabilkan oleh ikatan hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi van derWalls.

hidrogen, interaksi hidrofobik, dan interaksi van derWalls. Gambar 22. Struktur kuarterer E. PEMURNIAN DAN ANALISIS

Gambar 22. Struktur kuarterer

E. PEMURNIAN DAN ANALISIS PROTEIN

Pemahaman kita tentang struktur dan fungsi protein dihasilkan dari studi banyak protein secara individu. Untuk mempelajari protein secara rinci, peneliti harus mampu untuk memisahkan protein dari rotein lain. Metode yang diperlukan berasal dari kimia protein, yaitu suatu disiplin ilmu yang merupakan inti dari penelitian biokimia.

Protein murni perlu dipersipkan sebelum ditentukan sifat dan. Sel mengandung ribuan jenis protein yang berbeda, bagaimana kita dapat memurnikan satu protein? Metode untuk memisahkan protein didasarkan dari sifat yang berbeda- beda dari satu protein dengan protein lain yang meliputi, termasuk ukuran, muatan, dan sifat pengikatannya. Langkah pertama dalam prosedur pemurnian protein yang ada di dalam sel adalah untuk memecahka sel-sel sehingga protein dilepaskan ke dalam pelarut yang berupa larutan penyangga. Larutan yang mengandung campuran protein dan komponen komponen sub seluler lain tersebut disebut dengan ekstrak kasar (Gambar 23 ). Jika diperlu, sentrifugasi diferensial dapat digunakan untuk mempersiapkan menyiapkan fraksi subselular atau untuk mengisolasi organel tertentu. Setelah ekstrak atau persiapan organel telah disiapkan, berbagai metode digunakan untuk memurnikan satu atau lebih protein yang dikandungnya. Umumnya ekstrak kasar tersebut dipisahkan menjadi fraksi yang berbeda berdasarkan pada

29

sifatnya seperti ukuran atau muatan, proses disebut sebagai fraksinasi. Langkah

fraksinasi awal dalam pemurnian yang seringkali dilakukan yaitu dengan

memanfaatkan perbedaan kelarutan protein, yang merupakan fungsi dari pH, suhu,

konsentrasi garam, dan faktor lainnya. Kelarutan protein umumnya menurun pada

konsentrasi garam yang tinggi, efek yang disebut "salting out" Penambahan garam

dalam jumlah yang tepat dapat memicu

pengendapan beberapa protein , sementara protein yang lain tetap dalam larutan.

Ammonium sulfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) sering digunakan untuk tujuan ini karena

kelarutannya yang tinggi dalam air. Larutan protein hasil fraksinasi seringkali harus

disesuaikan kondisinya untuk tahap pemrunian berikutnya. Misalnya, dialisis adalah

prosedur untuk memisahkan protein dari pelarut dengan memanfaatkan ukuran

protein 'lebih besar dibandingkan garam garam. Dialisis dilakukan dengan

menempatkan larutan protein dalam kantong atau tabung yang terbuat dari membran

semipermeabel. Kantong tersebut dimasukkan ke dalam larutan buffer lain yang

sesuai dengan jumlah volume yang jauh lebih besar dibandingkan volume kantong,

sehingga terjadi pertukaran larutan bufer tetapi protein tetap tertinggal di dalam

kantong. Jadi dialisis mempertahankan protein yang berukuran besar dalam kantong

membran atau tabung sementara memungkinkan konsentrasi zat terlarut lainnya

berubah sampai mereka mencapai kesetimbangan dengan solusi di luar membran .

Dialisis dapat digunakan , misalnya, untuk kembali untuk menghapus amonium

sulfat dari persiapan protein .

untuk kembali untuk menghapus amonium sulfat dari persiapan protein . Gambar 23. Prinsip dasar pemurnian protein

Gambar 23. Prinsip dasar pemurnian protein

30

Gambar 24. Prinsip dasar kromatofrfai kolom (a) Protein fraksinasi . Metode yang paling baik untuk

Gambar 24. Prinsip dasar kromatofrfai kolom

(a) Protein fraksinasi .

Metode yang paling baik untuk melakukan fraksinasi protein adalah kromatografi kolom, yang memanfaatkanperbedaan muatan protein , ukuran , afinitas pengikatan, dan sifat lainnya . Bahan padat berpori dengan sifat kimia yang sesuai (fase diam) diletakkan di kolom, dan larutan buffer (fase gerak) dialirkan secar erlahan melalui fasa diam. Larutan yang mengandung protein dilatakkan di atas kolom sehingga merembes melalui matriks padat dan bergerak bersama fase gerak. Protein bermigrasi dengan kecepatan yang sangat tergantung sifat mereka. Gambar 24 menunjukkan prinsip dasar kromatografi kolom. Matriks fasa diam diletakkan dalam sebuah kolom umumnya terbuat dari plastik atau kaca. Fasa diam dilewati oleh larutan yaitu fasa gerak. Larutan akan keluar dari kolom di bagian bawah kolom (efluen) dan secara terus menerus digantikan oleh larutan yang disuplai dari reservoir di atas. Larutan protein yang akan dipisahkan berlapis-lapis didalamkolom didasarkan perbedaan derajat interkasinya dengan fasa diam, sehingga dihasilkan pita-pita protein. Masing-masing jenis protein (misalnya A, B, dan C, ditampilkan dalam warna biru , merah , dan hijau) secara bertahap terpisah dari satu sama lain. Pemisahannya meningkat di sepanjang kolom. Pada kromatofrafi kolom pita protein melebar karena efek difusi yang juga menurunkan resolusi pemisahan.

31

Dalam contoh ini, protein A baik dipisahkan dari B dan C, tapi pelebaran pita akibat difusi menyebabkan pemisahan tidak lengkap B dan C.

Tergantung pada jenis interaksi antara protein dan matriks, kromatografi kolom dapat diklasifikasikan dalam tiga jenis:

(a) kromatografi penukar ion mengeksploitasi perbedaan muatan dan besarnya muatan listrik total dari protein pada pH tertentu. Kolom matriks merupakan polimer sintetik yang mengikat gugus-gugus bermuatan. Pada penukar kation matriks mengikat gugus yang memiliki anion, sedangkan padapenukar anionmatriks mengikat gugus kation. Gambar 25a. menunjukkan prinsip kerja penukar kation. Afinitas masing masing protein terhadap gugus yang terikat pada matriks pada kolom dipengaruhi oleh pH (yang menentukan status ionisasi molekul ) dan konsentrasi ion garam dalam larutan. Pemisahan dapat dioptimisasi dengan merubah pH dari fasa gerak secara bertahap dan/atau konsentrasi garam dalam fase gerak sehingga terbentuk gradient pH atau garam. (b) kromatografi gel filtrasi atau ekslusi ukuran molekul (Gambar 25b) memisahkan protein berdasarkan ukurannya. Kolom matriks merupakan cross-linked polimer dengan pori-pori ukuran yang dipilih. Protein yang lebih besar bermigrasi lebih cepat daripada yang lebih kecil , karena mereka terlalu besar untuk masuk ke pori-pori di partikel polier sehungga mengambil rute yang lebih langsung melalui kolom . Protein yang lebih kecil masuk ke pori- pori dan diperlambat jalurnya melalui pori-pori seolah olah melewati labirin pada matriks kolom. (c) Kromatografi Affinity (Gambar 28c) memisahkan protein dengan kekhususan mengikat mereka. Protein ditahan yang ditahan pada kolom adalah mereka yang terikat secara khusus pada liganyang terikat pada matriks. Setelah protein yang tidak terikat ligan dicuci dengan pelarut melalui kolom , protein yang terikat dielusi (dicuci keluar dari kolom) oleh larutan yang mengandung ligan bebas yang menggantikan posisi protein.

32

Gambar 25. Kromatografi kolom (a) penukar ion, (b) afinitas, (c) gel filtrasi. 33

Gambar 25. Kromatografi kolom (a) penukar ion, (b) afinitas, (c) gel filtrasi.

33

(b) Protein dapat dipisahkan dengan elektroforesis.

Teknik lain yang penting untuk pemisahan protein didasarkan pada migrasi protein yang diletakkan dalam medan listrik,. Proses ini disebut dengan elektroforesis. Tekni ini umumnya tidak digunakan digunakan untuk memurnikan protein dalam jumlah besar, karena alternatif teknik lain yang lebih sederhana dapat digunakan dan metode elektroforesis seringkali mempengaruhi struktur dan fungsi protein. Elektroforesis terutama berguna untuk analisis protein. Keuntungannya adalah bahwa protein dapat divisualisasikan serta terpisah, memungkinkan peneliti untuk memperkirakan secara cepat jumlah protein yang berbeda dalam suatu campuran protein atau tingkat kemurnian persiapan protein hasil pemurnian. Elektroforesis juga dapat digunakan untuk mengetahui sifat penting dari protein seperti titik isoelektrik dan perkiraan berat molekul. Elektroforesis protein umumnya dilakukan dalam gel terdiri dari polimer poliakrilamida (Gambar 26). The gel poliakrilamid bertindak sebagai saringan molekuler, memperlambat migrasi protein. Migrasi sebanding dengan rasio muatan dan massa-proten. Migrasi juga dapat dipengaruhi oleh bentuk protein . Dalam elektroforesis, gaya yang menggerakkan makromolekul adalah potensial listrik, (E). Mobilitas elektroforetik molekul adalah rasio dari kecepatan molekul partikel terhadap potensial listrik. Metode elektroforesis biasa digunakan untuk memperkirakan kemurnian dan berat molekul protein apabila elektroforesisi dilakukan dengan menggunakan deterjen natrium dodesil sulfat (SDS) yang bermuatan negatif. SDS mengikat protein dalam jumlah yang kira-kira sebanding dengan berat molekul protein, sekitar satu molekul SDS untuk setiap dua residu asam amino. SDS yang terikat berkontribusi padabesarnya muatan negatif total. Konformasi asli protein diubah ketika SDS terikat , sehingga menghasilkan koformasi yang sama,sehingg elektroforesis dengan SDS memisahkan protein hampir secara eksklusif atas dasar massa molekulnya (berat molekul), dengan polipeptida kecil bermigrasi lebih cepat dibandingkan dengan yang berukuran besar. Setelah elektroforesis, protein dapat divisualisasikan dengan menambahkan pewarna sepert biru komasi, yang dapat mengikat protein tetapi tidak ttetapi tidak terikat pada gel polikrilamida. Dengan teknik ini peneliti dapat memantau kemajuan pemurnian protein melalui jumlah pita protein terlihat pada gel pada setiap langkah fraksinasi baru. Dengan membandingkan posisi protein hasil

34

migrasi dari berat molekul yang telah diketahui (protein standard) dan posisi hasil migrasi dari protein yang belum diketahui maka ukuran protein yang belum diketahui tersebut dapat ditentukan dengan kasar. Jika protein memiliki dua atau lebih subunit yang berbeda, subunit umumnya akan dipisahkan oleh perlakuan SDS dan setiap band dari subunit yang ada akan terpisah dan muncul pada gel.

dari subunit yang ada akan terpisah dan muncul pada gel. Gambar 26. Elektroforesis SDS-PAGE. (a) Setiap

Gambar 26. Elektroforesis SDS-PAGE. (a) Setiap sampel diletakkan pada di sumur yang berbeda. (b) pita protein bermigrasi dan perbedaan kecapetan migrasi tingkat menghasilkan pemisahan protein berdasarkan berat molekulnya.

D Sifat-sifat penting dari protein

(a) Kelarutan Protein

Kelarutan protein dalam larutan buffer tergantung pada distribusi dari residu asam amino hidrofilik dan hidrofobik pada permukaan protein. Residu hidrofobik terutama terdapat pada inti protein globular, tetapi beberapa dapat berada di permukaan. Protein yang memiliki kandungan asam amino hidrofobik tinggi pada permukaan memiliki kelarutan rendah dalam pelarut berair. Residu asam amino bermuatan pada permukaan berinteraksi dengan ion dalam pelarut dan meningkatkan kelarutan.

35

Penambahan garam netral pada larutan protein, seperti amonium sulfat, lapisan solvasi dan meningkatkan interaksi protein-protein. Peningkatan konsentrasi garam dalam larutan menyebabkan lebih banyak air menjadi mensolvasi ion. Akibatnya, air kurang tersedia untuk solvasi di sekitar protein. Protein mempunyai bagian hidrofobiki atau sedikit yang terdapat permukaan protein. Hal ini menyebabkan protein mengalam interaksi hidrofobik antar proteiin yang menyebabkan agregas dan pendapan protein dari larutan (Gambar 27).

agregas dan pendapan protein dari larutan (Gambar 27). Gambar 27. Efek penambahan garam pada kelarutan protein

Gambar 27. Efek penambahan garam pada kelarutan protein

(b) Denaturasi Protein.

Denaturasi protein adalah suatu proses di mana struktur sekunder, tersier dan kwarterner dari protein yang berubah dari struktur aslinya tanpa adanya pemutusan ikatan peptida (struktur primer). Secara kimia denaturasi mengganggu konformasi α- heliks dan β-sheetsehingga bentuk struktrnya menjadi acak. Denaturasi terkadang disebabkan oleh pecahnya iktan disulfida atau modifikasi kimia gugus-gugus tertentu dalam protein. Hal ini menyebabkan perubahan struktur tiga dimensi dari keseluruhan protein. Denaturasi seringkali terjadi secara ireversibel dan disertai dengan hilangnya kelarutan (terutama pada titik isoelektrik) dan/atau aktivitas biologis.

Beberapa hal yang menyebabkan denaturasi protein :

1). Panas. Panas dapat mengganggu ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik non-polar. Hal ini terjadi karena panas meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul

36

bergetar begitu cepat dan keras bahwa iktan kimianya terganggu.Protein dalam telur terdenaturasi dan menggumpal apabila dimasak. Makanan lain yang dimasak

proteinmya terdenaturasi dan akan memudahkan enzim untuk mencernanya.

Obat-
Obat-

obatan dan instrumen yang disterilkan dengan pemanasan mengubah sifat protein

pada bakteri yang beraikbat demikian bakteri.

(2) Alkohol atau pelarut organik Ikatan hidrogen yang terjadi antara gugus amida dalam struktur protein sekunder. Di dalam strutur tersier ikatan hidrogen terjadi antara rantai samping dari berbagai kombinasi asam amino. Semua ikatan hidrigen ini terganggu oleh penambahan alkohol. Alkohol mendenaturasi protein dengan mengganggu rantai ikatan hidrogen intramolekul, sehingga terbentuk ikatan baru antara molekul alkohol dengan rantai samping protein (Gambar 28).

molekul alkohol dengan rantai samping protein (Gambar 28). Gambar 28. Pengaruh etanol pada pemutusan ikatan hidrogen

Gambar 28. Pengaruh etanol pada pemutusan ikatan hidrogen antara rantai samping

(3) Asam dan basa Jembatan dalam struktur protein dapat dihasilkan dari netralisasi dari rantai samping asam dan rantai samping amin, misalnya antara asan glutamat dengan lisin. Adanya asam atau basa baru dalam larutan dapat menggantikan muatan positif atau negative yang berakibat rusaknya jembatan garam yang ada (Gambar 29). Reaksi semacam ini terjadi dalam sistem pencernaan, cairan asam lambung menyebabkan mengental (koagulasi) susu.

37

Gambar 29. Pemutusan jembatan garam oleh pengaruh asam. (4) Logam logam berat Garam logam berat

Gambar 29. Pemutusan jembatan garam oleh pengaruh asam.

(4) Logam logam berat Garam logam berat mendenaturasi protein dengan cara yang sama seperti asam dan basa merusak protein. Garam logam berat antara lain adalah Hg 2+ , Pb 2+ , Ag 1+ Tl 1+ , Cd 2+ dan logam lainnya dengan berat atom tinggi. Karena garam adalah ionik mereka mengganggu jembatan garam dalam protein. Reaksi garam logam berat dengan protein biasanya mengarah ke pembentukan ikatan garam logam protein yang tidak larut.

(5) Reagen pereduksi jembatan disulfide

Ikatan disulfida terbentuk oleh oksidasi dari gugus sulfhidril pada sistein. Rantai protein yang berbeda didikat bersama oleh ikatan disulfida kovalen yang kuat. Misalnya pada insulin dalam, jika oksidator menyebabkan pembentukan ikatan disulfida, maka pereduksi akan memutuskan setiap ikatan disulfida. Reduktor akan menambahkan atom hidrogen sehingga terbentuk gugus tiol (Gambar 30).

38

Gambar 30. Pemutusan jembatan disulfida ileg reagen pereduksi 39

Gambar 30. Pemutusan jembatan disulfida ileg reagen pereduksi

39

BAB IV

ENZIM

(Peran Enzim dalam Reaksi biokimia)

Sebuah sistem hidup mengontrol aktivitas hidupnya melalui aktifitas protein/enzim. Enzim adalah molekul protein yang merupakan katalis biologis dengan tiga karakteristik. Pertama, fungsi dasar enzim adalah untuk meningkatkan laju reaksi. Kebanyakan reaksi seluler terjadi sekitar satu juta kali lebih cepat daripada mereka tanpa adanya enzim. Kedua, sebagian besar enzim bertindak secara khusus dengan hanya satu reaktan (disebut substrat) untuk menghasilkan produk. Karakteristik ketiga dan yang paling luar biasa adalah bahwa enzim diatur dari keadaan aktivitas rendah ke aktivitas yang tinggi dan sebaliknya. Individualitas dari sel hidup memiliki sekitar 3.000 enzim yang unik yang sudah diprogram secara genetik untuk memproduksi enzim-enzim tersebut dan jika satu enzim yang hilang atau rusak, hasilnya bisa menjadi bencana bagi hidup individu tersebut. Banyak informasi tentang enzim telah tersedia karena enzim-enzim tersebut dapat diisolasi dari sel dan dibuat untuk bekerja di dalam tabung reaksi. Struktur tiga dimensi dari enzim dianalisi dengan teknik difraksi sinar X dari protein yang dikristalkan atau dari data NMR (Nuclear Magnetic Resonance).

Aktivitas enzim tergantung pada rantai protein yang sangat spesifik untuk masing-masing. Banyak enzim terdiri dari protein dan kombinasi dari satu atau lebih bagian yang disebut kofaktor. Kompleks enzim-kofaktor biasanya disebut sebagai holoenzim, sedangkan bagian enzim kompleks tersebut yang hanya mengandung protein disebut dengan apoenzim: Apoenzim mungkin tidak aktif dalam struktur aslinya dan membutuhkan adanya kofakto. Bentuk aktif dari apoenzyme dikenal sebagai proenzim atau zimogen. Proenzim mungkin berisi beberapa asam amino dalam protein tambahan yang nantinya akan dihapus, dan memungkinkan struktur tersier akhir yang spesifik yang akan dibentuk sebelum diaktifkan sebagai apoenzim. Kofaktor adalah zat non-protein yang mungkin berupa zat organik yang disebut

40

koenzim. Koenzim sering berasal dari vitamin atau senyawa organik lain yang terikat secara kovalen atau non-kovalen. Tipe lain dari kofaktor adalah ion logam anorganik disebut aktivator ion logam. Ion-ion logam anorganik dapat terikat melalui ikatan kovalen koordinasi. Alasan utama untuk kebutuhan gizi berupa mineral adalah menyediakan ion logam seperti Zn +2 , Mg +2 , Mn +2 , Fe +2 , Cu +2 , K +1 , dan Na +1 untuk digunakan sebagai kofaktor. Peran kofaktor adalah untuk: mengaktifkan protein dengan mengubah bentuk geometris atau dapat juga berpartisipasi langsung dalam keseluruhan reaksi.

A. Klasifikasi enzim

Enzim biasanya diberi nama dengan menambahkan akhiran "-ase" ke nama akar dari molekul substratnya. Misalnya, lipase mengkatalisis hidrolisis trigliserida (lipid). Sukrase mengkatalisis hidrolisis sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa. Beberapa enzim yang ditemukan sebelum sistem penamaan dibuat diberi nama dengan nama umum. Contohnya adalah pepsin, tripsin, dan kimotripsin yang mengkatalisis hidrolisis protein. Sistem tatanama sistematis baru yang dikenal sebagai International Enzim Commission (IEC) didasarkan pada jenis reaksi yang dikatalisis. Ada enam kelompok besar enzim dalam sistem ini seperti terlihat pada Tabe 4. Masing masing kelompok dibagi lebih jauh lagi daat dilihat pada http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/enzyme/, dan mempunyai nomor komisi.

Contoh :

1. EC. 1.1.1.1 adalah alkohol dehidrogenase (EC 1 adalah Oxidoreductase dan EC 1.1 emzim yang memindahkan gugus the CH-OH dari donor Reaksi yang dikatalisis :

alkohol primer + NAD + aldehid + NADH + H + alkohol sekunder + NAD + ↔ keton + NADH + H + Nams sistematik : alcohol:NAD + oxidoreductase

2. 2. EC. 3.1.1.1 adalah karboksiesterase (EC.3. adalah hidrolase , dan 3.1 bekerja pada ester, EC 3.3.3 adalah karboksi ester hidrolase Reaksi yang dikatalisis :

Ester kasrbiksilat + H 2 O ↔ alkohol + asam karboksilat Nama sistematik : carboxylic-ester hydrolase

41

Tabel 4. Klasifikasi Enzim

No Kelas

Nama kelas

Tipe reaksi yang dikatalisis

 

1

oksidoreduktase

Transfer elektrom, hidrida atau ataom H

 

2

Transferase

Reaksi pemnidahan gugus

 

3

Hidrolase

Reaksi hidrolisa

 

4

Liase

Reaksi penambahan gugus/atom ke ikatan rangkap atau pembentukan ikatan rangkap melalui penghilangan gugus/milekul terteentu

5

Isomerase

Transher

gugus/ataom

dalam

molekul

menghasilkan isomernya

 

6

Ligase

Pembentukan ikatan C-C, C-S, C-O, dan C-N yang digabung dengan pemtusan ikatan eikatan ester fosfat atau iakatn semacamnya

B. Bagaimana enzim bekerja .

Reaksi enzimatik sangat penting untuk sistem kehidupan. Dalam kondisi biologis yang relevan, reaksi tanpa katalis cenderung lambat karena biomolekul sebagian besar cukup stabil dalam pH netral , temperature sedang, dan lingkungan berair di dalam sel . Selain itu, banyak reaksi umum dalam biokimia terjadi peristiwa kimia yang tidak menguntungkan atau tidak mungkin dalam lingkungan selular, seperti pembentukan produk antara yang stabil atau tabrakan dua atau lebih molekul dalam orientasi yang tepat diperlukan untuk reaksi bikokima. Sebuah enzim mempersempit masalah ini dengan menyediakan lingkungan spesifik di mana suatu reaksi dapat terjadi lebih cepat. Ciri yang membedakan reaksi katilisis enzimatik adalah bahwa reaksi terjadi dalam suatu kantong reaksi pada enzim yang disebut dengan pusat aktif enzim. Molekul yang terikat pada pusat aktif enzim dan diubah menjadi molekul lain oleh enzim disebut substrat. Permukaan pusat aktif terdapat residu asam amino dengan gugus-gugus yang mampu mengikat substrat dan mengkatalisis transformasi kimia. Seringkali pusat aktif membungkus substrat dan memisahkan subastrat sepenuhnya dari larutan. Kompleks enzim-substrat pertama kali diusulkan oleh

42

Charles - Adolphe Wurtz pada pada tahun 1880.Ide ini juga merupakan titik awal untuk menggambarkan secara matematika dalam menentukan perilaku kinetika reaksi enzimatik dan mendeskripsikan secara teoritis mekanisme enzim.

Sebuah reaksi enzimatis sederhana mungkin tertulis:

enzim. Sebuah reaksi enzimatis sederhana mungkin tertulis: (1) di mana E , S, dan P mlambangkan

(1)

di mana E , S, dan P mlambangkan enzim , substrat , dan produk, ES dan EP adalah kompleks sementara enzim -substrat dan kompleks sementara enzim-produk. Untuk memahami reaksi katalisis enzimatik, pertama kita harus melihat perbedaan penting antara kesetimbangan reaksi dan laju reaksi. Fungsi katalis adalah untuk meningkatkan laju reaksi. Katalis tidak mempengaruhi kesetimbangan reaksi. Setiap reaksi, seperti S ↔ P, dapat digambarkan oleh reaksi koordinat diagram (Gambar 31a). Energi bebas dari sistem diplot terhadap kemajuan reaksi S ↔ P. Sebuah diagram semacam ini adalah deskripsi dari perubahan energi selama reaksi , dan sumbu horisontal (reaksi koordinat) mencerminkan perubahan kimia yang progresif (misalnya, kerusakan atau pembentukan ikatan) sebagai S diubah menjadi P. Energi aktivasi ntuk S ↔ P dan P ↔ S reaksi ditunjukkan sebagai G . G 0 adalah perubahan energi bebas standar keseluruhan dalam arah S ↔ P. Laju reaksi mencerminkan energi aktivasi: energi aktivasi yang lebih tinggi sesuai dengan reaksi yang lebih lambat. Laju reaksi dapat ditingkatkan dengan meningkatkan suhu, yang berperan dalammeningkatkan jumlah molekul dengan energi yang cukup untuk mengatasi hambatan energi. Energi aktivasi dapat diturunkan dengan menambahkan katalis (Gambar 31b ). Katalis meningkatkan laju reaksi dengan menurunkan energi aktivasi.

meningkatkan laju reaksi dengan menurunkan energi aktivasi. Gambar 31. Diagram koordinat reaksi pada suatu rekasi kimia

Gambar 31. Diagram koordinat reaksi pada suatu rekasi kimia

43

Enzim tidak ada pengecualian seperti halnya katalis lain, enzim tidak mempengaruhi kesetimbangan reaksiTanda panah dua arah pada persamaan 1 menyatakan bahwa setiap enzim yang mengkatalisis reaksi S↔P juga mengkatalisis reaksi P↔S. Peran enzim adalah untuk mempercepat interkonversi S dan P. Enzim tidak digunakan dalam proses, dan titik ekuilibrium tidak terpengaruh. Namun, reaksi mencapai kesetimbangan jauh lebih cepat bila enzim yang tepat hadir, karena laju reaksi meningkat. Prinsip umum ini dapat diilustrasikan dengan mempertimbang kankonversi sukrosa dan oksigen menjadi karbon dioksida dan air:

sukrosa dan oksigen menjadi karbon dioksida dan air: (2) Konversi ini, yang berlangsung melalui serangkaian

(2)

Konversi ini, yang berlangsung melalui serangkaian reaksi terpisah, memiliki G 0 sangat besar dan negatif, dan pada kesetimbangan jumlah sukrosa yang ada diabaikan .Namun sukrosa merupakan senyawa stabil, karena hambatan energy aktivasi yang harus diatasi sebelum sukrosa bereaksi dengan oksigen cukup tinggi. Sukrosa dapat disimpan dalam wadahd engan oksigen hampir tanpa batas tanpa bereaksi. Dalamsel, bagaimana pun, sukrosa mudah dipecah menjadi CO 2 dan H 2 O dalam serangkaian reaksi yang dikatalisasi oleh enzim. Enzim ini tidak hanya mempercepat reaksi, mereka mengatur dan mengendalikan konsentrasti sukrosa sehingga banyak energi yang dilepaskan kembali dalam bentuk kimia lainnya dan membuat tersedia bagi sel untuk peruabahn lainnya. Reaksi dimana sukrosa (gula danlainnya) dipecah adalah jalur yang menghasilkan energy utama untuk sel, dan enzim dari jalur ini memungkinkan rekasi lain dalam sistem biologis berjalan.

C. Spesifisitas Enzim

Enzim adalah katalis yang luar biasa. Peningkatan kecepatan rekasi yang dikatalisisnya meningktan pada kisaran 10 5 sampai 10 17 kali lipat. Enzim juga sangat spesifik, yang dapat dengan mudah membedakan antara substrat dengan struktur sangat mirip . Bagaimana kalatilisi yang sangat besar dan sangat selektif tersebut dapat dijelaskan? Apa sumber energi untuk penurunan dramatis dari energi aktivasi untuk reaksi tertentu? Jawaban atas pertanyaan-pertanyaan ini memiliki dua bagian yang berbeda namun saling terkait. Yang pertama terletak pada bagaimana

44

penyusunan ulang ikatan kovalen selama reaksi enzim -katalis. Reaksi kimia dari berbagai jenis terjadi antara substrat dan kelompok fungsional enzim (rantai sampiang asam amino tertentu, ion logam, dan koenzim). Gugus fungsional pada usat katalitik enzim yang dapat membentuk ikatan kovalen sementara dengan substrat dan mengaktifkannya untuk reaksi, atau gugus tersebut dapat ditransfer sementara dari substrat ke enzim. Dalam banyak kasus, reaksi ini terjadi hanya di pusat aktif enzim. Interaksi kovalen antara enzim dan substrat memiliki energi aktivasi yang rendah energi dengan demikian mempercepat reaksi dengan menyediakan jalur alternatif, jalur reaksi - energi yang lebih rendah. Hal kedua dapat dijelaskan pada interaksi non kovalen antara enzim dan substrat. Sebagian besar energi yang dibutuhkan untuk energi aktivasi yang lebih rendah berasal dari interaksi lemah yaitu interaksi non kovalen antara substrat dan enzim. Apa yang benar-benar membuat enzim berbdeda ddibandingkan dengan kebanyakan katalis lain adalah pembentukan kompleks ES. Interaksi antara substrat dan enzim dalam kompleks ini dimediasi oleh kekuatan yang sama yang menstabilkan struktur protein, termasuk ikatan hidrogen dan interaksi hidrofobik dan ion. Pembentukan setiap interaksi lemah di kompleks ES disertai dengan pelepasan sejumlah kecil energi bebas yang mengakibatakan stabilitas interaksi. Energi yang berasal dari interaksi enzim - substrat disebut energi ikat , GB . Maknanya melampaui stabilisasi sederhana dari interaksi enzim - substrat. Energi ikat merupakan sumber utama energi bebas digunakan oleh enzim untuk menurunkan energi aktivasi reaksi.

Bagaimana enzim menggunakan energi ikat untuk menurunkan energi aktivasi untuk reaksi? Pembentukan kompleks ES adalah bukan penjelasan tentang hal ini, meskipun beberapa pertimbangan awal mekanisme enzim dimulai dengan ide ini. Studi pada spesifisitas enzim dilakukan oleh Emil Fischer yang mengusulkan , bahwa struktur enzim yang structural saling berpasangan dengan substrat mereka , sehingga mereka cocok seperti kunci dan gembol (894), Ide ini sangat mudah dipahamielegan, bahwa interaksi khusus antara dua molekul biologis dimediasi oleh permukaan molekul dengan bentuk yang saling komplementer. Ide ini melandasi banyak perkembangan biokimia, dan interaksi tersebut adalah jantung proses biokimia. Namun, hipotesis "gembok dan kunci " dapat mengarah pada pemiiran yang saalah bila diterapkan pada katalisis enzimatik. Sebuah enzim yang sepenuhnya

45

komplelmenter antara struktur substrat dan ensim akan sangat sulit memerikan ruang untuk bereaksi karena bersifat kakau . Pertimbangkan reaksi imajiner, pemecahan tongkat logam magnet . Reaksi tanpa katalis adalah ditunjukkan pada Gambar 32a. Bila enzim digambarkan sebagai tempat tongkat yang bisa mengkatalisis pemutusan tongkat, keduanya memanfaatkan kekuatan magnet sebagai paradigma untuk mengikat energi yang digunakan oleh enzim. Bila enzim mengikuti paradigma gembok dan kuncinya maka dapat digambarkan pada Gambar 32b. Pusat aktif pada kantong tongkat ini adalah saku yang dilapisi dengan magnet.Pemutusan tongkat harus mencapai keadaan transisi reaksi, tapi tongkat terikat begitu erat di pusat aktif yang tidak bisa menekuk, karena pelenturan akan menghilangkan beberapa interaksi magnetik antara tongkat dan enzim. Enzim seperti ini akan menghambat reaksi dan menstabilkan substratnya. Dalam reaksi koordinat diagram (Gambar 32b ), kompleks ES seperti ini akan menyebabkan substrat sulit untuk terlepas.

seperti ini akan menyebabkan substrat sulit untuk terlepas. Gambar 32. Reaksi imaginer antara Enzim dan substrat.

Gambar 32. Reaksi imaginer antara Enzim dan substrat.

Gagasan modern katalisis enzimatik , pertama kali diusulkan oleh Michael Polanyi (1921) dan Haldane (1930), telah diuraikan oleh Linus Pauling pada tahun 1946:

untuk mengkatalisis reaksi, enzim harus melengkapi keadaan transisi reaksi. Ini

46

berarti bahwa interaksi yang optimal antara substrat dan enzim hanya terjadi

dalam keadaan transisi. Gambar 32c menunjukkan bagaimana enzim tersebut dapat

bekerja. Tongkat mengikat kantong tongkat, tetapi hanya sebuah subset dari interaksi

magnetik yang mungkin digunakan dalam membentuk kompleks ES. Substrat yang

terikat masih harus menjalani peningkatan energi bebas yang diperlukan untuk

mencapai keadaan transisi. Sekarang peningkatan energi bebas yang diperlukan

untuk menarik tongkat ke posisi melengkung dan sebagian konformasinya rusakyang

interaksi magnetik (energi ikat) yang terbentuk antara enzim dan substrat dalam

keadaan transisi. Banyak interaksi ini melibatkan bagian-bagian dari tongkat yang

jauh dari titik kerusakan, sehingga interaksi antara kantong dan bagian tongkat yang

tidak berekasi/putus menyediakan beberapa dari energi yang dibutuhkan untuk

mengkatalisis kerusakan tongkat.

D. Kinetika enzim

Ahli biokimia biasanya menggunakan beberapa pendekatan untuk

mempelajari mekanisme kerja enzim dimurnikan. Pendekatan untuk mempelajari

mekanisme reaksi enzim-katalis adalah dengan menentukan laju reaksi dan

bagaimana perubahan enzim terhadap perubahan parameter eksperimental. Disiplin

ilmu ini yang dikenal sebagai kinetika enzim. Ini adalah pendekatan yang tertua

untuk memahami mekanisme enzim dan tetap yang merupakan hal yang paling

penting.

enzim dan tetap yang merupakan hal yang paling penting. Gambar 33. Efek konsentrasi substrat terhadap kecepatan

Gambar 33. Efek konsentrasi substrat terhadap kecepatan awal reaksi enzimatik

47

Faktor utama yang mempengaruhi laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim adalah konsentrasi substrat, [S]. Namun, mempelajari efek konsentrasi substrat terhadap laju reaksi sangat rumit karena komsentrasi substrat selalu berubah selama reaksi terjadi in vitro karena substrat diubah menjadi produk setiap saat. Salah satu pendekatan untuk menyederhanakan dalam percobaan kinetika adalah dengan cara mengukur kecepatan awal, dinyatakan dengan V 0 , ketika [S] jauh lebih besar daripada konsentrasi enzim, [E]. Dalam reaksi reaksi tertentu, hanya diperlukan enzim dalam jumlah nanomolar, sedangkan [S] mungkin lima atau enam kali lipat lebih tinggi. Jika hanya awal dari reaksi dipantau (sering 60 detik pertama atau kurang), perubahan [S] dapat berubah beberapa persen, dan [S] dapat dianggap sebagai konstan. V 0 kemudian dapat dieksplorasi sebagai fungsi [S]. Efek pada V 0 dari berbagai [S] ketika konsentrasi enzim tetap konstan ditunjukkan pada Gambar 33. Pada konsentrasi yang relatif rendah dari substrat, V 0 meningkat hampir linear dengan peningkatan [S] . Pada konsentrasi substrat yang lebih tinggi, V 0 meningkat dengan jumlah yang lebih kecil dan lebih kecil dalam menanggapi peningkatan [S]. Akhirnya, tercapai suatu titik dimana V0 makin kecil karena [S] meningkat . Pada daerah dimana V 0 dekat dengan kecepatan maksimu dinayatakan sebagai Vmax. Kurva pada Gambar 33 mengekspresikan hubungan antara [S] dan V 0 memiliki bentuk umum yang sama untuk sebagian besar enzim (mendekati hiperbola persegi panjang), yang dapat dinyatakan dengan secara aljabar oleh persamaan Michaelis - Menten . Michaelis dan Menten menurunkan persamaan ini dimulai dari hipotesis dasar mereka bahwa hal yang membatasi langkah dalam reaksi enzimatik adalah kompleks ES dengan produk dan enzim bebas. Persamaan ini dituliskan sebegai berikut:

dan enzim bebas. Persamaan ini dituliskan sebegai berikut: Double reciprocal dari persamaan Michaelis Menten

Double reciprocal dari persamaan Michaelis Menten menghasilkan persamaan the Lineweaver-Burk equation berikut :

Double reciprocal dari persamaan Michaelis Menten menghasilkan persamaan the Lineweaver-Burk equation berikut : 48

48

Untuk enzim yang hubungan Michaelis-Menten, kurba 1/V0 vs 1 / [S] menghasilkan garis lurus (Gambar 34). Garis ini memiliki kemiringan Km / Vmax, intercept dari 1/Vmax pada sumbu 1/V0, dan intercept dari -1/Km pada sumbu 1/[S].Kurba tersebut juga disebut kurva Lineweaver-Burk yang memiliki keuntungan besar yang memungkinkan penentuan nilai Vmaxyang lebih akurat, yang hanya dapat didekati dari kurva sederhana V0 vs [S]. Kurva tersebut sangat berguna dalam membedakan antara jenis mekanisme reaksi enzimatik dan dalam menganalisis penghambatan enzim.

reaksi enzimatik dan dalam menganalisis penghambatan enzim. Gambar 34. Kurba hubungan antara 1/[S] dengan 1/V0 E.

Gambar 34. Kurba hubungan antara 1/[S] dengan 1/V0

E. Inhibisi enzim

I nhibitor enzim adalah molekul yang mengganggu katalisis, memperlambat

atau menghentikan reaksi enzimatik. Enzim mengkatalisasi hampir semua proses seluler, sehingga tidak mengherankan bahwa inhibitor enzim adalah salah satu agen farmasi yang paling penting untuk diketahui. Sebagai contoh, aspirin

(acetylsalicylate) menghambat enzim yang mengkatalisis langkah pertama dalam sintesis prostaglandin, senyawa yang terlibat dalam banyak proses, termasuk beberapa yang menghasilkan nyeri. Studi tentang inhibitor enzim juga telah memberikan informasi berharga tentang mekanisme enzim dan telah membantu

mendefinisikan beberapa jalur metabolisme. Ada dua kelas yang luas dari inhibitor

enzim: reversibel dan ireversibel

49

Gambar 35. Hubungan antara 1/[S] dengan 1/V0 untuk berbagai tipe inhibisi reaksi enzimatik. 50

Gambar 35. Hubungan antara 1/[S] dengan 1/V0 untuk berbagai tipe inhibisi reaksi enzimatik.

50

1.

Inhibisi reversibel.

Salah satu jenis umum dari penghambatan reversibel disebut inhibisis kompetitif (Gambar 35a). Sebuah inhibitor kompetitif bersaing dengan substrat untuk memperebutkan pusat aktif enzim. Inhibitor (I) menempati pusat aktif dan mencegah pengikatan substrat untuk enzim. Banyak inhibitor kompetitif merupakan senyawa yang strukturnya menyerupai substrat dan menggabungkan diri dengan enzim untuk membentuk sebuah kompleks EI, tetapi tanpa menghasilkan reaksi katalisis. Bahkan kombinasi jenis ini akan mengurangi efisiensi enzim. Dengan memperhitungkan geometri molekul inhibitor yang menyerupai substrat, kita bisa mempelajari dana mencapai kesimpulan tentang bagian mengikat substrat sebenarnya pada enzim. Inhibisi kompetitif dapat dianalisis secara kuantitatif dengan kinetika steady-state. Dengan adanya inhibitor kompetitif, persamaan Michaelis Menten menjadi:

inhibitor kompetitif, persamaan Michaelis Menten menjadi: Dimana, Double reciprocal dari persamaan tersebut

Dimana,

kompetitif, persamaan Michaelis Menten menjadi: Dimana, Double reciprocal dari persamaan tersebut menghasilkan :

Double reciprocal dari persamaan tersebut menghasilkan :

Double reciprocal dari persamaan tersebut menghasilkan : Sebuah terapi medis berdasarkan kompetisi di pusataktif

Sebuah terapi medis berdasarkan kompetisi di pusataktif digunakan untuk mengobati pasien yangkeracunan metanol, pelarut ditemukan dalam gas antibeku. Enzim alkohol dehidrogenase mengubah metanol menjadi formaldehida yang dapat merusak banyak jaringan. Kebutaan adalah akibat umum dari konsumsi metanol, karena mata sangat sensitif terhadap formalin. Etanol bersaing secara kompetitif dengan metanol sebagai substrat alternatif untuk alkohol dehidrogenase. Etanol juga merupakan substrat untuk alkohol dehidrogenase dan konsentrasinya akan menurun dari waktu ke waktu karena enzim mengkonversinya menjadi asetaldehida. Terapi untuk keracunan metanol melalui infus intravena etanol secara, untuk

51

mempertahankan tingkat konsentrasi yang terkontrol dalam aliran darah selama beberapa jam. Hal ini memperlambat pembentukan formaldehida, mengurangi bahaya sementara ginjal dalam menyaring metanol untuk dibuang tanpa bahaya dalam urin. Inhibisi reversibel kedua adalah inhibis unkompetitif dan dan inhibisi campuran (sering disebut non kompetitif). Meskipun seringkali digambarkan satu enzim mengikata substrat, dalam prakteknya yang sering diamati adalah enzim yang memiliki dua atau lebih substrat. Inhibitor kompetitif (Gambar 35b) yang mengikat dpada pusat aktif yang berbeda dari pusat aktifsubstrat (tidak seperti inhibitor kompetitif, mengikat hanya ke kompleks ES). Pada jenit inhibis unkompetitif, persamaan Michaelis-Menten persamaan diubah manjadi :

persamaan Michaelis-Menten persamaan diubah manjadi : Dimana, Double reciprocal persamaan tersebut menghasilkan :

Dimana,

Michaelis-Menten persamaan diubah manjadi : Dimana, Double reciprocal persamaan tersebut menghasilkan :

Double reciprocal persamaan tersebut menghasilkan :

Dimana, Double reciprocal persamaan tersebut menghasilkan : Inhibitor campuran (Gambar 35c) juga mengikat di sebuah

Inhibitor campuran (Gambar 35c) juga mengikat di sebuah situs yang berbeda dari situs aktif substrat, tetapi juga dapat terikat secara baik pada E atau ES. Persamaan laju yang menggambarkan inhibisi campuran adalah

Persamaan laju yang menggambarkan inhibisi campuran adalah Kasus khusus  dan  ', jarang ditemui dalam

Kasus khusus dan ', jarang ditemui dalam percobaan, klasik telah didefinisikan sebagai inhibisi kompetitif. Persamaan ‘double reciprocal untuk penghambatan campuran adalah

telah didefinisikan sebagai inhibisi kompetitif. Persamaan ‘double reciprocal untuk penghambatan campuran adalah 52

52

2.

Inhibis irreversibel

Inihibis ireversibel adalah dimana inhibitor terikat secara kovalen yang dapat menghancurkan gugus fungsional pada enzim yang sangat penting untuk aktivitas enzim, atau inhibisi dimana inhibitor yang membentuk ikatan noncovalent yang sangat stabil. Inhibitor ireversibel adalah alat yang berguna untuk mempelajari mekanisme reaksi. Asam amino dengan fungsi katalitik kunci pada pusat aktif kadang-kadang dapat diidentifikasi dengan menentukan residu asam amino yang terikat secara kovalen dengan inhibitor setelah enzim tidak aktif. Kelompok khusus inhibitor ireversibel adalah inaktivator bunuh diri. Senyawa ini relatif tidak aktif dan mengikat pusat aktif enzim tertentu secara permanen. Sebuah inaktivator bunuh diri pertama mengalami beberapa langkah reaksi enzimatik normal, tetatpi tidak berubah menjadi produk normal, inaktivator diubah menjadi senyawa yang sangat reaktif yang bergabung dengan enzim secara ireversibel. Inaktivator bunuh diri memainkan peran penting dalam rasionalisasi desain obat. Pendekatan modern untuk mendapatkan agen farmasi baru didasarlam pada pengetahuan di mana pengetahuan tentang substrat dan mekanisme reaksi sehingga inhibitor dapat di didesain dan disintesis.

F. Pengaruh pH terhadap aktifitas enzim

Enzim memiliki pH optimum yaitu kisaran pH di mana aktivitasnya maksimal (Gambar 36). Pada pH yang lebih tinggi atau lebih rendah dari pH poptimum terjadi penurunan aktivitas. Hal ini disebabkan rantai samping asam amino di pusat aktif dapat bertindak sebagai asam lemah dan basa lemah dengan fungsi yang bergantung pada kondisi mereka mempertahankan keadaan ionisasi tertentu, dan asam amino lainnya yanag tidak terletak pada pusat aktif juga sangat ditentukan interkasinya pada kondiisi ionisasi rantai sampingnya dalam mempertahankan struktur 3D protein. Menghapus proton dari residu asam amino, misalnya, mungkin menghilangkan interaksi ionik penting untuk menstabilkan konformasi aktif enzim. Gugus-gugus yang ada pada substrat juga dapat mentitrasi pusat aktif dan menyebabkan perubahan pH, tetapai hal ini jarang sekali terjadi.

53

Gambar 36. Pengaruh suhu pada aktifitas enzim G. Regulasi enzim Dalam metabolisme sel, sekelompok enzim

Gambar 36. Pengaruh suhu pada aktifitas enzim

G. Regulasi enzim Dalam metabolisme sel, sekelompok enzim bekerja sama dalam suatu jalur secara berurutan untuk melakkukan proses metabolisme tertentu, seperti pemecahan glukosa menjadi laktat atau sintesis asam amino dari prekursor sederhana. Dalam sistem sepertiini, produk reaksi dari satu enzim menjadi substrat enzim berikutnya. Sebagian besar enzim di setiap jalur metabolisme mengikuti pola kinetik yang telah kita dijelaskan sebelumnya. Setiap jalur, bagaimanapun, melibatkan satu atau lebih enzim yang memiliki efek lebih besar dari keseluruhan urutan reaksi yang mengatur kecepatan reaksi keseluruahan. Enzim pengatur ini menunjukkan peningkatan atau penurunan aktivitas katalitik sebagai respons terhadap sinyal tertentu. Laju dikendalikan oleh enzim pengendali (regulatory enzim) tersebut untuk keseluruhan jalur metabolisme tersebut, sehingga memungkinkan sel untuk memenuhi perubahan kebutuhan untuk energi dan biomolekul yang diperlukan dalam pertumbuhan dan perbaikan kondisi sel. Pada kebanyakan sistem multienzim, enzim pertama dari serangkaian urutan proses adalah enzim pengendali. Posisi ini merupakan tempat yang sangat baik untuk mengatur jalur reaksi, karena katalisis beberapa reaksi pertama mengalihkan reaksi dari produksi produk yang tidak dibutuhkan ke produksi energi dan metabolit dari proses yang lebih penting . Enzim lain dalam jalur yang dikendalikan tersebut umumnya memiliki aktivitas katalitik yang lebih tinggi yang pada umumnya sangat tergantung dari kecepatan tersedianya substrat yang berasa dari reaksi sebelumnya.

54

H. Enzim alosterik Aktifitas enzim pengendali dmodulasi melalui berbagai cara. Enzim alosterik berkasi secara reversibel, mengikat senyawa pengendali secara non-kovalen. Senyawa pengendali tersebut disebut modulator alosterik atau efektor alosterik, yang umumnya merupakan metabolit kecil atau kofaktor. Enzim dapat juga diatur oleh modifikasi kovalen reversibel.

Enzim dapat juga diatur oleh modifikasi kovalen reversibel. Gambar 37. Pengendalian enzim secara Enzim alosterik

Gambar 37. Pengendalian enzim secara

Enzim alosterik menunjukkan hubungan antara V 0 dan [S] yang berbeda ddengan kinetika Michaelis - Menten. Enzim alostareik mengalami tingkat kejenuhan pada [S] yang cukup tinggi. Plot V 0 vs [S] (Gambar 37) menghasilkan kurva kejenuhan sigmoid, sedangkan pada kinetika Michaelis - Menten memebrikan kurva hiperbolik. Pada kurva saturasi sigmoid kita dapat menemukan nilai [S] di mana V 0 adalah setengah dari nilai maksimal, tapi nilai tersebut tidak bisa bukan merupakan nilai Km, karena enzim tidak mengikuti hubungan Michaelis - Menten yang hiperbolik. Sebaliknya, simbol [S] 0.5 atau K 0.5 sering digunakan untuk mewakili konsentrasi substrat yang memberikan kecepatan setengah dari nilai maksimal dari

55

reaksi dikatalisis oleh enzim alosteri. Dalam Gambar 37 graph b, tiga contoh pengaruh modulator terhadapap kompleks enzim alosterik: (a) kurva sigmoid enzim homotropik, di mana substrat juga berfungsi sebagai modulator positif (stimulator) atau activator, (b) efek dari modulator positif dan negatif modulator pada enzim alosterik akan mengubah nilai K 0.5 tanpa perubahan V max . Kurva yang ditengah menunjukkan hubungan [S] pada laju reaksi tanpa pengarug modulator, dan (c) tipe reaksi alosterik yang jarang dijumpai di mana V max berubah dan K 0.5 hampir konstan.

I. Inhibisi upan balik ‘Feed back’

Dalam beberapa sistem multienzim, enzim pengendali dihambat oleh produk akhir dari jalur metabolismnya setiap kali konsentrasi produk akhir melebihi kebutuhan sel. Ketika reaksi enzim pengendali diperlambat, semua enzim berikutnya berkurang aktifitasnya karena kekurangan ketersediaan substrat yang diproduksi oleh enzim-enzim sebelumnya. Tingkat produksi produk akhir jalur ini dengan demikian menjadi seimbang dengan kebutuhan sel. Jenis pengendalian seperti ini disebut inhibisi umpan balik (feed back inhibition). Penumpukan produk akhir pada akhirnya memperlambat seluruh jalur. Salah satu contoh adalah penghambatan umpan balik alosterik adalah sistem enzim pada bakteri yang mengkatalisis konversi L- treonin menjadi L-isoleusin yang terjadi

dalam lima langkah reaksi (Gambar 38). Dalam sistem ini, enzim pertama yaitu treonin dehidratase, dihambat oleh isoleusin

Dalam sistem ini, enzim pertama yaitu treonin dehidratase, dihambat oleh isoleusin Gambar 38. Contoh inhibisi feed

Gambar 38. Contoh inhibisi feed back

56

yaitu produk dari reaksi terakhir dari satu seri reaksi. Hal ini merupakan contoh dari penghambatan alosterik heterotropic. Isoleusin cukup spesifik sebagai inhibitor. Tidak ada zat antara lain dalam urutan ini yang menghambat treonin dehidratase, juga tidak ada enzim lain dalam urutan dihambat oleh isoleusin. Isoleusin tidak terikay pada pusat aktif substrat tetapi pada pusatlain yang spesifik pada molekul enzim yang sama yang disebut pusat pengendali. Pengikatan isoleusin melalui ikatan noncovalen dan reversible. Jika konsentrasi isoleusin menurun akan terjadi kenaikan laju dehidrasi treomin. Dengan demikian aktifitas treonin dehidratase dapat berubah sangat cepat dan reversibel mengikuti fluktuasi konsentrasi isoleusin dalam sel.

57

BAB III

NUKLEOTIDA DAN ASAM NUKLEAT

Nukleotida memiliki berbagai peran dalam metabolisme sel. Nukleotida dapat bertindak sebagai molekul pembawa energi yang dapat dipertukarkan dalam selama jalur metabolisme, pengubung kimia yang penting dalam respon sel terhadap hormon dan rangsangan ekstraseluler lainnya, dkomponen struktural dari berbagai kofaktor enzim dan zat metabolic, dan yang lebih penting nuklotida adalah monomer dari asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA), yaitu suatu molekul penyimpang informasi genetik. Struktur setiap protein, dan akhirnya dari setiap komponen biomolekul dan seluler merupakan produk informasi yang deprogram dalam urutan nukleotida asam nukleat dari sel tersebut. Kemampuan untuk menyimpan dan mengirimkan informasi genetik dari satu generasi ke generasi berikutnya adalah kondisi fundamental bagi kehidupan. Pembahsan bagian ini memberikan gambaran tentang sifat kimia dari nukleotida dan asam nukleat yang ditemukan di sebagian besar sel.

Urutan asam amino dari protein dalam setiap sel, dan urutan nukleotida setiap RNA, ditentukan oleh urutan urutan nukleotida dalam DNA sel tersebut. Sebuah segmen molekul DNA yang berisi informasi yang diperlukan untuk sintesis dari produk biologi fungsional, apakah protein atau RNA, disebut sebagai gen. Sebuah sel biasanya memiliki ribuan gen, dan molekul DNA umumnya sangat besar. DNA hanya berfungsi sebagai penyimpanan dan transmisi informasi biologis. RNA memiliki fungsi yang lebihluas dan beberapa kelompok yang ditemukan dalam sel. RNA ribosom (rRNA) merupakan komponen dari ribosom yaitu suatu kompleks supramolekul yang berfungsi sdalam sintesis protein. Messenger RNA (mRNA) merupakan molekul perantara, membawa informasi genetik dari satu atau beberapa gen ke ribosom, di mana protein yang sesuai dapat disintesis. RNA transfer (tRNA)

58

adalah molekul adaptor yang menerjemahkan informasi dalam mRNA menjadi

urutan spesifik asam amino.

A. Nukleotida dan Asam nukleat Memiliki Basa Karakteristik dan pentose

dan Asam nukleat Memiliki Basa Karakteristik dan pentose Gambar 39. Struktur nukleotida. (a) stuktur dasar

Gambar 39. Struktur nukleotida. (a) stuktur dasar nukleotidak. (b) struktur basa nirtogen.

Nukleotida memiliki tiga komponen : (1) basa nitrogen, (2) pentosa, dan (3)

fosfat (Gambar 39a). Molekul tanpa gugus fosfat disebut nukleosida a. Basa nitrogen

adalah turunan dari dua senyawa induk, pirimidin dan purin (Gambar 39b). Basa

nitogen dan ribosa dari nukleotida umum adalah senyawa heterosiklik. Atom-atom

karbon dan nitrogen dalam struktur induk diberi nomor secara konvensional untuk

memudahkan penamaan dan identifikasi senyawa turunannya.

Basa nukleotida terikat secara kovalen (N-1 pada pirimidin atau N-9 pada purin)

dengan atom karbo 1' dari gula pentosa melalui ikatan N-β- glycosil, dan fosfat yang

diesterifikasi dengan karbon. Ikatan N-β-glycosyl dibentuk melalui reaksi

kondensasi (gugus hidroksil berasal dari pentosa dan hidrogen berasal dari basa),

seperti dalam pembentukan ikatan O-glikosidik. DNA dan RNA mengandung dua

purin utama yaitu adenin (A) dan guanin (G), dan dua pirimidin utama (gambar 40).

Dalam kedua DNA dan RNA salah satu pirimidin adalah sitosin (C), tetapi pirimidin

utama kedua tidak sama di kedua asam nukleat yaitu timin (T) pada DNA dan urasil

(U) pada RNA. Asam nukleat memiliki dua jenis pentosa. Unit ulangan

59

deoksiribonukleotida (DNA) mengandung 2'-deoksi-D- ribosa, dan unit ulangan ribonucleotide RNA mengandung D-ribosa. Dalam nukleotida, kedua jenis pentosenya adalah β- furanosa (cincin 5 C tertutup) bentuk. Gambar 40 memberikan struktur dan nama dari empat asam deoksiribonukleat utama (deoxyribonucleoside 5'-monophosphates), unit struktural DNA, dan empat ribonucleotides utama (ribonucleoside 5'-monophosphates), unit struktural RNA. Sekuens panjang spesifik A, T, G, dan C nukleotida DNA adalah repositori informasi genetik.

spesifik A, T, G, dan C nukleotida DNA adalah repositori informasi genetik. Gambar 40. Nukleotida penyusun

Gambar 40. Nukleotida penyusun DNA dan RNA

60

Gambar 41. Tuang punggung rantai DNA dan RNA. Nukleotida dipolimerase melalui ikatan fosfodiester . B.

Gambar 41. Tuang punggung rantai DNA dan RNA. Nukleotida dipolimerase melalui ikatan fosfodiester.

B. Ikatan fosfodiester.

Nukleotida dalam DNA dan RNA secara berurutan dihubungkan secara

kovalen melalui jembatan fosfat, " di mana gugus atom C-5' dari satu unit nukleotida

bergabung dengan gugus hidroksi-3' dari nukleotida berikutnya menciptakan

hubungan fosfodiester (Gambar. 41). Tulang punggung DNA merupakan unit

ulangan gula ribosa dan fosfatmsedangan basa tidak terlibat dalam pembentukan

ikatan kovalen. Tulang punggung DNA dan RNA bersifat hidrofilik karena guguus

hidroksil dari residu gula membentuk ikatan hidrogen dengan air. Gugus-gugus

fosfat dengan nilai pKa mendekati 0, terionisasi dan bermuatan negatif pada pH 7,

dan muatan negatif umumnya dinetralkan oleh interaksi ionik dengan muatan positif

pada protein, ion logam, dan poliamin. Semua hubungan fosfodiester memiliki

orientasi yang sama sepanjang rantai DNA dan RNA menghasilkan untain asam

61

nukleat linear yang memanjang. Menurut persetujuan monomer DNA diurutkan daari dari ujung 5' ke 3' Tulang punggung DNA dan RNA dihidrolisis sangat lambat dalam reaksi nonenzimatik pada ikatan fosfodiester. Dalam tabung reaksi, RNA dihidrolisis dengan cepat di bawah kondisi alkali, namun DNA tidak dapat dihidrolisis karena hilangnya gugus hidroksi pada C-2'. Gugus hidroksi ini secara langsung terlibat daam hidrolisinya pada suasana alkali. Konvensi internasional , struktur untai tunggal asam nukleat selalu ditulis dari kiri ke kanan dari ujung 5' ke ujung 3' (5' 3') (Gambar 42). Asam nukleat pendek disebut juga dengan oligonukleotida. Definisi " pendek " umumnya untuk polimer yang mengandung lebih kecil dari 50 monomer sedangkan yang lebih besar dari 50 disebut polinucleotida.

Pirimidin dan purin bebas adalah senyawa basa lemah dan dengan demikian disebut basa. Mereka memiliki berbagai sifat kimia yang mempengaruhi struktur dan fungsi asam nukleat. Purin dan pirimidin umum dalam DNA dan RNA adalah molekul yang sangat terkonjugasi, sifat dengan konsekuensi penting terhadap struktur, distribusi elektron, dan penyerapan cahaya dari asam nukleat. Resonansi antara atom dalam cincin pirimididn dan purin memberikan karakter ikatan ganda. Sebagai akibatnya pirimidin adalah molekul planar dan purin hampir planar. Sebagai hasil dari resonansi, semua basa nukleotida menyerap sinar UV, dan asam nukleat ditandai dengan penyerapan yang kuat pada panjang gelombang sekitar 260 nm.

Basa purin dan pirimidin bersifat hidrofobik dan relatif tidak larut dalam air pada pH yang hampir netral dari sel. Pada pH asam atau alkali kelarutannya meningkat dalam air. Interaksi hidrofobik menyebabkan dua atau lebih cincin cincin basa yang planar diposisikan secara planar seperti tumpukan koin yang merupakan model penting untuk interaksi dasar adalah dalam asam nukleat. Susunan juga melibatkan kombinasi van der Waals dan interaksi dipol-dipol antara basa-basa tersebut. Susunan basa membantu untuk meminimalkan kontak basa dengan air, dan pengaturan tersebut sangat penting dalam menstabilkan struktur tiga dimensi asam nukleat.

62

Gambar 42. Antara dua untai DNA dapat membentuk ikatan hidrogen yang terjadi , antara basa

Gambar 42. Antara dua untai DNA dapat membentuk ikatan hidrogen yang terjadi , antara basa purin dan pirimidin. Adenin berpasangan dengan timin, guanin berpasangan dengan sitosin

C. Struktur Asam Nukleat.

Gugus-gugus fungsi asam nukleat yang paling penting dari pirimidin dan

purin adalah cincin basa nitrogen, gugus karbonil, dan gugus amino eksoosiklik.

Ikatan hidrogen melibatkan gugus amino dan karbonil hal yang pentig dalam

interaksi antara basa dalam molekul asam nukleat. Ikatan hidrogen antara basa

memungkinkan hubungan yang saling melengkapi antara dua (dan kadang-kadang

tiga atau empat) untai asam nukleat. Pola ikatan hidrogen digambarkan pertama

kali leh James D. Watson dan Francis Crick pada tahun 1953, di mana ikatan

khusus terjadi antara A dengan T (atau U) dan ikatan juga terjadi antara G dan C.

Kedua jenis pasangan basa mendominasi dalam DNA beruntai ganda dan RNA,

bertanggung jawab untuk pola-pola ini (Gambar 42). Pasangan A-T dan G-C yang

memungkinkan duplikasi informasi genetic. Kelompok-kelompok fungsional

63

yang paling penting dari pirimidin dan purin adalah nitrogen cincin, gugus

karbonil, dan kelompok amino eksosiklik. Ikatan hidrogen melibatkan gugus

amino dan karbonil adalah modus penting kedua interaksi antara dasar dalam

molekul asam nukleat. Ikatan hidrogen antara basa memungkinkan hubungan

yang saling melengkapi dua (dan kadang-kadang tiga atau empat) helai asam

nukleat. Yang paling penting pola ikatan hidrogen adalah yang didefinisikan oleh

James D. Watson dan Francis Crick pada tahun 1953, di mana obligasi A khusus

untuk T (atau U) dan obligasi G ke C Kedua jenis pasangan basa mendominasi

dalam DNA beruntai ganda dan RNA, bertanggung jawab untuk pola-pola ini

(Gambar 42). Inilah pasangan khusus basa yang memungkinkan duplikasi

informasi genetik, seperti yang akan kita bicarakan nanti.

informasi genetik, seperti yang akan kita bicarakan nanti. Gambar 43. Percobaan Avery-MacLeod- McCarty. D. Penyimpanan

Gambar 43. Percobaan Avery-MacLeod- McCarty.

D. Penyimpanan informasi genetik

Penelitian biokimia tentang DNA dimulai dimulai oleh Friedrich Miescher, yang

melakukan pertama studi kimia secara sistematis tentang inti sel. Pada tahun 1868

Miescher mengisolasi zat yang mengandung fosfor, yang selanjunya disebutnya

sebagai ebut "nuklein" dari inti sel darah putih (leukosit) yang diperoleh dari perband

yang dibuang. Dia menemukan nuklein terdiri dari bagian asam, yang kita kenal

sekarang sebagai DNA dan bagian yang mengandung protein. Miescher kemudian

64

menemukan zat asam yang sama di kepala sel sperma dari salmon. Meskipun ia sebagian dimurnikan nuklein dan mempelajari sifat-sifatnya, yang strukturnya seperti digambarkan pada Gambar 42 tidak diketahui dengan pasti sampai akhir tahun 1940-an. Miescher dan banyak peneliti lainnya menduga bahwa nuklein (asam nukleat) berhubungan dalam cara sel mewariskan sifatnya, namun bukti langsung pertama bahwa DNA adalah pembawa informasi genetik datang pada tahun 1944 melalui sebuah penemuan yang dilakukan oleh Oswald T. Avery , Colin MacLeod, dan Maclyn McCarty. Peneliti ini menemukan bahwa DNA yang diekstraksi dari strain bakteri Streptococcus pneumoniae yang virulen (penyebab penyakit), juga dikenal sebagai pneumokokus dan secara genetik berubah strain nonvirulent organisme ini menjadi bentuk ganas (Gambar 43). Avery dan rekan-rekannya menyimpulkan bahwa DNA yang diekstraksi dari strain virulen membawa pesan genetik diwariskan untuk sifat virulensi. Tidak semua orang menerima kesimpulan ini, karena proteim yang ada bersama DNA bisa juga menjadi pembawa informasi genetik. Penemuan ini selanjutnya bisa diterima setelah dibuktikan bahwa inkubasi DNA dengan enzim proteolitik tidak merusak aktivitas transformasi genetik, tetapi inkubasi DNA dengan deoxyribonuclease (enzim yang menghidrolisa DNA).

65

Gambar 44. Percobaan Hershey- Chase Sebuah percobaan penting kedua memberikan bukti independen bahwa DNA membawa

Gambar 44. Percobaan Hershey- Chase

Sebuah percobaan penting kedua memberikan bukti independen bahwa DNA

membawa informasi genetik. Pada tahun 1952 Alfred D. Hershey dan Martha Chase

menggunakan fosfor radioaktif ( 32 P) dan sulfur radioaktif ( 35 S) sebagai marker untuk

menunjukkan bahwa ketika virus bakteri (bakteriofag) T2 menginfeksi sel inangnya,

Escherichia coli, fosfor yang dikandung oleh DNA partikel virus, bukan protein

yang mengandung sulfur dari mantel virus, yang memasuki sel inang dan

melengkapi informasi genetik untuk replikasi virus (Gambar 44). Percobaan awal ini

dan percobaabn lainnya telah membuktikan bahwa DNA adalah komponen

kromosom eksklusif dimana informasi genetik dari sel-sel hidup disimpan dalam sel

.

66

E. Struktur DNA adalah double heliks

Untuk menjelaskan lebih lanjut tentang struktur DNA, Rosalind Franklin dan Maurice Wilkins menggunakan metode difraksi sinar-x untuk menganalisis serat DNA. Mereka menunjukkan di awal 1950-an bahwa DNA menghasilkan pola difraksi sinar-x karakteristik. Dari pola ini itu menyimpulkan bahwa molekul DNA heliks dengan dua periodisitas sepanjang sumbu panjang mereka, yang utama dari 3,4 Å dan satu sekunder 34 Å. Masalahnya kemudian adalah untuk merumuskan suatu model tiga dimensi dari molekul DNA, yang tidak hanya menjelaskan data difreaksi sinar X tetapi bagaimana ikatan hidrogen spessi yang dapat menjelaskan tidak hanya untuk data difraksi sinar-x tetapi juga untuk menjelaskan bagaimana basa spesifik berikatan hidrogen (A T dan G C) dimana sifat ini ditemukan oleh Chargaff bersama sifat kimia laiinya dari DNA. Pada tahun 1953 Watson dan Crick (Gambar 45) mengusulkan model tiga dimensi dari struktur DNA yang menyumbangkan semua data yang tersedia saat ini. Struktur dijelaskan sebagai dua untai DNA heliks yang memutar di sekitar sumbu yang sama untuk membentuk double heliks yg mengikuti aturan putar tangan kanan . Tulang punggung deoksiribosa dan gugus fosfat berada di luar double heliks, menghadap air yang ada di sekitarnya. Cincin furanose dari masing-masing deoksiribosa mimiliki konformasi endo pada C-2'. Basa purin dan pirimidin dari kedua untai ditumpuk di dalam double helix, dengan cicncinnya yang hampir planat dan hidrofobik saling berdekatan dan tegak lurus terhadap sumbu. Setiap basa nukleotida dari satu untai dipasangkan pada nulkelotida lain untai DNA lainnya. Struktur yang diusulkan oleh Watson dan Crick diilustrasikan pada Gambar , G dengan C dan A dengan T , adalah mereka yang paling cocok dalam struktur , memberikan alasan untuk aturan Chargaff bahwa C dan A dalam DNA apapun, G T. Hal ini penting untuk dicatat bahwa tiga ikatan hidrogen dapat C , tetapi hanya dua dapatmembentuk antara G dan C , dilambangkan G T.terbentuk antara A dan T , dilambangkan A Ini adalah salah satu alasan bagi temuan bahwa pemisahan untai DNA T pasanganC ke A dipasangkan lebih sulit semakin tinggi rasio G basa . Pasangan lain cenderung basa ( untuk berbagai tingkat ) untuk mengacaukan struktur heliks ganda . Ketika Watson dan Crick dibangun model mereka , mereka harus memutuskan di awal apakah untai DNA harus paralel atau antiparalel - apakah

67

5 ' , ikatan 3' -fosfodiester mereka harus berjalan dalam arah yang sama atau

berlawanan (Gambar 46). Orientasi antiparalel menghasilkan model yang paling

meyakinkan, dan kemudian penelelitian menggunakan DNA polimerase memberikan

bukti eksperimental bahwa kedua untai DNA terbukti antiparalel. Temuan ini

mengkonfirmasikan sema penemuan sebelumnya melalui analisis tentang data sinar-

x.

penemuan sebelumnya melalui analisis tentang data sinar- x. Gambar 45. Watson dan Crick dengan model DNA

Gambar 45. Watson dan Crick dengan model DNA merek

Untuk menjelaskan periodisitas yang diamati dalam pola difraksi sinar x dari

serat DNA, model molekul Watson dan Crick dimanipulasi untuk mendapatkan

suatu struktur di manaa ditumpuk secara vertikal di dalam double helix yang

jaraknya adalah 3,4 Å (Gambar 46). Satu putaran ulangan berjara sekitar 34 Å, yang

berisi 10 pasangan basa etiap putaran penuh dari helix ganda. Dalam larutan struktur

sedikit berbeda dari yang di serat, yang memiliki 10,5 pasangan tiap satu putaran (

Gbr. 46 ). Seperti Gambar 46 menunjukkan , dua rantai polinukleotida antiparalel

DNA heliks ganda tidak identik baik dalam urutan basa atau komposisi.

68

Gambar 46. Ilustrasi struktur DNA yang diusulkan oleh Watson dan Crick. Jarak antar basa adalah
Gambar 46. Ilustrasi struktur DNA yang diusulkan oleh Watson dan Crick. Jarak antar basa adalah

Gambar 46. Ilustrasi struktur DNA yang diusulkan oleh Watson dan Crick. Jarak antar basa adalah 3,4 Å

Sebaliknya mereka saling melengkapi satu sama lain. Dimanapun adenin terjadi dalam satu untai, timin ditemukan dalam untai lainnya, sama, dimanapun guanin terjadi dalam satu rantai, sitosin ditemukan dalam untailainnya. Helix ganda DNA, atau duplex, yang distabilkan bersama oleh ikatan hidrogen antara pasangan basa komplementer (Gambar 42). Komplementaritas antara untai DNA disebabkan oleh ikatan hidrogen antara pasangan basa. Ciri penting dari model heliks ganda dari struktur DNA didukung oleh banyak bukti kimia dan biologi. Selain itu, model tersebut dapat digunakan untuk mengusulkan mekanisme transmisi informasi genetik.

F. Information Patyways (Jalur informasi genetik)

Mungkin sifat yang paling luar biasa dari sel-sel hidup dan organisme adalah kemampuan mereka untuk mereproduksi diri untuk banyak generasi dengan secara sempurna dan persis sama. Kelangsungan pewarisan terjadi selama jutaan ttahun

69

dimana sifat-sifat tersebut disimpain dalam struktur molekul yang mengandung informasi genetik. Penelitian biokimia modern pada struktur dan fungsi gen telah mengarahan ke biologi revolusi ke arah publikasi teori Darwin tentang asal-usul spesies hampir 150 tahun yang lalu. Pemahaman tentang bagaimana informasi disimpan dan digunakan dalam sel telah membawa wawasan baru untuk beberapa pertanyaan yang paling mendasar tentang struktur dan fungsi sel. Sebuah kerangka konseptual yang komprehensif untuk biokimia yang sedang berkembang sekarang ini. Urutan monomer nukleotida dalam polimer linier mengkode instruksi untuk membentuk semua komponen seluler lainnya dan menyediakan template untuk produksi molekul DNA yang identik untuk dibagikan kepada keturunannya ketika sel membelah. Berlanjutnya keberadaan spesies biologi membutuhkan informasi genetik untuk dipertahankan dalam bentuk yang stabil dan akurat dinyatakan dalam bentuk produk gen dan direproduksi dengan kesalahan yang sangat kecil. Penyimpanan yang efektif , ekspresi , dan reproduksi pesan genetik

yang efektif , ekspresi , dan reproduksi pesan genetik Gambar 47. Dogma sentral mendefinisikan spesies individu

Gambar 47. Dogma sentral

mendefinisikan spesies individu , membedakan mereka dari satu sama lain , dan meyakinkan merek a atas kelangsungan generasi berturut-turut . Pemahaman tentang jalur aliran informasi genetik saat ini telah muncul dari kajian interdisipliner antara ilmu genetika, fisika, dan kimia dalam biokimia modern. Kajian interdispliner ini ditunjukkan oleh penemuan struktur heliks ganda, dan teori genetik DNA

70

memberikan kontribusi konsep coding oleh gen. Revolusi dalam pemahaman kita tentang struktur DNA yang diajkan oleh Watson-Crick diawalai oleh pertanyaan tentang fungsi dari molekul tersebut. Struktur heliks ganda itu sendiri jelas menyarankan bagaimana DNA dapat disalin sehingga informasi yang dikandungnya dapat ditularkan dari satu generasi ke generasi berikutnya. Klarifikasi bagaimana informasi dalam DNA diubah menjadi protein fungsional datang dengan penemuan messenger RNA dan transfer RNA serta penemuan kode genetik. Hal-hal tersebut memnculkan pemikiran tentang dogma sentral (Gambar 47 ), yang terdiri dari tiga proses utama dalam pemanfaatan informasi genetik dalam sel. Yang pertama adalah replikasi, yaitu menyalin DNA orangtua untuk membentuk molekul DNA anak dengan urutan nukleotida yang 100% identik. Yang kedua adalah transkripsi yaitu suatu proses dimana bagian dari pesan genetik yang dikode dalam DNA disalin tepat ke RNA. Yang ketiga adalah terjemahan, dimana pesan genetik yang dikodekan dalam messenger RNA diterjemahkan pada ribosom menjadi polipeptida dengan urutan asam amino yang tertentu.

G. Gen dan Kromosom

DNA mengandung gen dan daerah antargen, yang keduanya mempunyai fungsi vital dalam sel. Genom yang lebih kompleks seperti pada sel-sel eukariotik, membutuhkan tingkat organisasi kromosom yang lebih tinggi, dan ini tercermin dalam ciri struktural kromosom. Kita diskusikan tentang jenis urutan DNA dan elemen struktural dalam kromosom. Pemahaman kita tentang gen telah berkembang pesat selama abad terakhir. Secara klasik, gen didefinisikan sebagai bagian dari kromosom yang menentukan atau mempengaruhi karakter tunggal atau fenotipe (sifat yang tampak), seperti warna mata, warna kulit dsb. George Beadle dan Edward Tatum mengusulkan definisi molekul gen pada tahun 1940. Setelah mempelajari spora dari jamur Neurospora crassa, sinar-X dan zat-zat lain lainnya diketahui dapat merusak DNA dan menyebabkan perubahan dalam urutan DNA (mutasi), mereka mendeteksi strain jamur mutan yang kekurangan satu enzim tertentu, kadang-kadang menyebabkan kegagalan seluruh jalur metabolisme. Berdasarkan pengamatan tersebut Beadle dan Tatum menyimpulkan bahwa gen adalah segmen materi genetik yang menentukan atau mengkode untuk satu enzim (hipotesis satu gen-satu enzim).

71

Kemudian konsep ini diperluas untuk satu gen-satu polipeptida, karena banyak gen mengkod protein yang tidak befugsi sebagai enzim atau untuk satu subunit darai suatu protein kompleks yang mengandung beberapa popipeptida. Definisi biokimia modern gen bahkan lebih tepat. Gen adalah semua DNA yang mengkode urutan utama dari beberapa produk gen akhir, yang dapat berupa polipeptida atau RNA dengan fungsi struktural atau katalitik. DNA juga mengandung segmen lain atau urutan yang memiliki fungsi dalam pengaturan gen. Pengatur gen ini dapat berada di awal atau akhir suatu gen, atau mempengaruhi transkripsi gen, atau dapat juga berfungsi sebagai titik inisiasi replikasi atau rekombinasi. Berapa banyak gen dalam kromosom tunggal? Kromosom Escherichia coli, salah satu genom prokariotik yang telah benar-benar diurutkan berbentuk molekul DNA sirkular (dalam arti sebuah lingkaran tak berujung dan bukan lingkaran sempurna) dengan 4.639.221 bp (pasang basa). Pasangan basa tersebut mengkode sekitar 4.300 gen untuk protein dan 115 gen lainuntuk molekul RNA yang stabil. Di antara eukariota, sekitar 3,2 miliar pasang basa dari genom manusia meliputi 30.000 sampai 35.000 gen pada kromosom 24 yang berbeda. Virus bukan organisme yang hidup bebas, melainkan parasit menular yang menggunakan sumber daya dari sel inang untuk melakukan banyak proses yang mereka butuhkan untuk menyebarkan diri. Banyak virus yang terdiri dari tidak lebih dari genom (biasanya RNA tunggal atau molekul DNA ) yang dikelilingi oleh lapisan protein. Hampir semua virus tanaman dan beberapa virus bakteri dan hewan memiliki genom RNA. Genom ini cenderung sangat kecil. Sebagai contoh, genom retrovirus mamalia seperti HIV sekitar 9.000 nukleotida panjang, dan bahwa dari Q β bakteriofag memiliki 4.220 nukleotida. Kedua jenis virus memiliki genom RNA untai tunggal. Genom virus DNA sangat bervariasi dalam ukuran. Banyak DNA virus membentuk lingkaran. Selama replikasi virus dalam sel inang, tipe tertentu dari DNA virus yang disebut bentuk replikatif mungkin muncul, misalnya, banyak DNA linier menjadi melingkar dan semua DNA beruntai tunggal menjadi beruntai ganda. Sebuah bakteriofag λ ( lambda ), yang menginfeksi E. coli. Dalam bentuk replikatif yang di dalam sel, DNA λ adalah double helix melingkar.

Prokariota tidak memiliki organel membran seperti nukleus, mitokondria, kloroplas, aparatus Golgi, atau retikulum endoplasma. Prokariot memiliki dua jenis

72

DNA sirkular: DNA kromosom dan plasmid. DNA kromosom terletak di daerah yang disebut nucleoid. Plasmid terletak di sitoplasma dan ukuran jauh lebih kecil dibandingkan dengan kromosom, dan telah digunakan untuk rekayasa genetika. Sel eukariotik jauh lebih kompleks. Gambar 48 menunjukkan organisasi kromosom mitotik dalam sel eukariotik. Sebuah kromosom eukariotik mengandung benang nukleosom yang terikat dengan protein dalam kompleks yang disebut kromatin. Pada mitosis, kromatid direplikasi di sentromer. Setiap kromatid terdiri dari satu molekul DNA beruntai ganda. DNA tersebut melilit pada protein yang disebut histon (H1, H2A, H2B, H3, H4 dan), membentuk unit seperti bulatan-bulatan keccil yang disebut nukleosom. Solenoid didefinisikan sebagai kemasan 30nm serat DNA kromatin. Seluruh gen dari satu organisme disebut genom yang menyimpan informasi keturunan organisme yang didalamnya termasuk coding dan non coding.

organisme yang didalamnya termasuk coding dan non coding . Gambar 48. Organisasi kromosom pada sel eukariot

Gambar 48. Organisasi kromosom pada sel eukariot

73

H. Struktur gen

Organisasi gen dalam DNA eukariotik secara struktural dan fungsional jauh lebih kompleks. Gen eukariotik memiliki fitur struktural yang khas dan membingungkan:

urutan nukleotida mereka mengandung satu atau lebih segmen intervensi DNA yang tidak mengkode untuk urutan asam amino dari produk polipeptida. Penyisipan ini nontranslated region ini mengganggu jika penjelasa hubungan collinear antara urutan nukleotida gen dan urutan asam amino dari polipeptida yang dikode. Segmen DNA nontranslated disebut intron, dan segmen pengkode disebut ekson. Pada eukariota lebih tinggi, gen khas memiliki lebih banyak intron daripada ekson. Misalnya, dalam gen yang mengkode rantai polipeptida tunggal dari protein ovalbumin (Gbr.49), intron yang lebih banyak daripada ekson, tujuh intron membentuk 85 % dari DNA gen. Dalam gen untuk subunit β hemoglobin, sebuah intron tunggal berisi lebih dari setengah dari DNA gen. Gen untuk protein titin otot adalah juara intron, dengan 178 intron. Gen untuk histon tampaknya tidak memiliki intron. Dalam kebanyakan kasus fungsi intron tidak jelas. Secara total, hanya sekitar 1,5% dari DNA manusia " coding " atau ekson DNA, membawa informasi untuk protein atau produk RNA. Namun, ketika intron jauh lebih besar termasuk dalam hitungan , sebanyak 30 % dari genom manusia terdiri dari gen. Daam prokariot dalam satu segmen gen semua diterjemahkan menjadi polipeptida.

dalam satu segmen gen semua diterjemahkan menjadi polipeptida. Gambar 49. Intron dan ekson pada eukariot bervariasi

Gambar 49. Intron dan ekson pada eukariot bervariasi

74

I. DNA Replikasi Gambar 50. Percobaan Matthew Meselson dan Franklin Stahl Replikasi DNA Replikasi DNA

I. DNA Replikasi

Gambar 50. Percobaan Matthew Meselson dan Franklin Stahl

Replikasi DNA Replikasi DNA berlangsung secara semikonservatif . Setiap untai

DNA berfungsi sebagai template untuk sintesis untai baru, menghasilkan dua

molekul DNA baru, masing-masing dengan satu untai baru dan satu untai lama. Hail

ini disebut replikasi semikonservatif. Watson dan Crick mengajukan sebuah

hipotesis tentang replikasi semikonservatif segera setelah publikasi dari 1.953 tulisan

mereka pada struktur DNA, dan hipotesis tersebut dibuktikan oleh percobaan yang

dirancang secara cerdik dilakukan oleh Matthew Meselson dan Franklin Stahl, dalam

molekul akan terdiri dari dua untai DNA yang baru disintesis dan yang lain akan

berisi untaian dari induknya, ini tidak akan menghasilkan molekul DNA hibrid pada

percobaan Meselson-Stahl. Hipotesisi semikonservatif tentang replikasi selanjutnya

didukung oleh hasil percobaan Meselson-Stahl. Pada percobaan ini (Gambar 50) sel

ditumbuhkan dalam medium yang mengandung 14 N sehingga mengandung DNA

yang memiliki 14 N. Produk DNA diisolasi dari siklus replikasi kedua menunjukkan

dua pita dalam gradien kerapatan, satu dengan kepadatan sama dengan DNA induk

75

dan yang lainnya dengan kepadatan campuran dengan yang diamati setelah

penggandaan sel pertama.

dengan yang diamati setelah penggandaan sel pertama. Gambar 51. (a) Hasil pengamatan dengan mikroskop elektron

Gambar 51. (a) Hasil pengamatan dengan mikroskop elektron pada DNA yang sedang mengalamai replikaasi, (b) arah replikasi DNA

Replikasi dimulai pada titik awal replikasi dan biasanya terjadi dua arah

(bidirectionally). Setelah mekanisme semikonservatif dari proses replikasi terjawab,

sejumlah pertanyaan muncul. Apakah untai DNA induk sepenuhnya dibuka dari

strukturnya dalam kromosom sebelum setiap direplikasi ? Apakah replikasi dimulai

di tempat-tempat acak atau pada titik yang unik? Setelah inisiasi pada setiap titik

dalam DNA, apakah replikasi melanjutkan dalam satu arah atau keduanya? Indikasi

awal bahwa replikasi adalah proses yang sangat terkoordinasi di mana untaian

orangtua secara bersamaan dibatalkan dan diulang diberikan oleh John Cairns ,

menggunakan autoradiografi. Dia membuat E. coli DNA radioaktif dengan

menumbuhkan sel dalam media yang mengandung timidin berlabel tritium ( 3 H).

Ketika DNA dengan hati-hati diisolasi, disebar, dan dilapis dengan emulsi fotografi

selama beberapa minggu, residu timidin radioaktif menghasikan jejak seperti perak

dalam emulsi, menghasilkan gambar dari molekul DNA. Jejak ini mengungkapkan

bahwa kromosom utuh dari E. coli merupakan lingkaran besar tunggal sepanjang

panjang 1,7 mm dan DNA yang ddiisolasi dari sel radioaktif selama proses replikasi

menunjukkan loop tambahan (Gambar 51). Cairns menyimpulkan bahwa loop

76

dihasilkan dari pembentukan dua untai DNA anak yang radioaktif yang masing-

masing komplemeter dengan untaian DNA induk. Satu atau kedua ujung loop

bersifat dinamis (disebut garpu replikasi), dimana DNA induk sedang dibuka dan

untaian yang sedang terpisah/terbuka dengan cepat direplikasi. Hasil Cairns ini

menunjukkan bahwa kedua untai DNA direplikasi secara bersamaan, dan variasi

pada eksperimennya menunjukkan bahwa replikasi kromosom bakteri terjadi dua

arah: Kedua ujung loop memiliki garpu replikasi yang aktif. Penentuan apakah

replikasi loop berasal pada titik unik dalam landmark DNA diperlukan di sepanjang

molekul DNA. Teknik ini disebut pemetaan denaturasi, yang dikembangkan oleh

ini disebut pemetaan denaturasi, yang dikembangkan oleh Gambar 52. Replikasi dimulai pada banyak titik pada sel

Gambar 52. Replikasi dimulai pada banyak titik pada sel eukariot

Ross Inman dan rekannya. Menggunakan 48.502 bp kromosom bakteriofag λ, Inman

menunjukkan bahwa DNA bisa terdenaturasi secara selektif pada urutan yang kaya

pasangan basa AUT, menghasilkan pola direproduksi gelembung-untai tunggal.

DNA yang diisolasi mengandung loop replikasi dapat terdenaturasi dengan cara yang

sama. Hal ini memungkinkan posisi dan kemajuan garpu replikasi dapat diukur dan

dipetakan menggunakan daerah terdenaturasi sebagai titik acuan. Teknik ini

mengungkapkan bahwa dalam sistem ini replikasi loop selalu memulai pada titik

awal replikasi yang unik, yang disebut awal replikasi (origin of replication). Hal ini

juga dikonfirmasi pengamatan sebelumnya bahwa replikasi biasanya dua arah. Untuk

molekul DNA yang melingkar, dua garpu replikasi bertemu pada suatu titik di sisi

yang berlawanan lingkaran dari titik asal. Titik awal replikasi yang spesifik juga

telah diidentifikasi dan ditandai pada bakteri dan eukariota yang lebih rendah. Tidak

seperti DNA prokariotik, DNA eukariotik linear dan replikasi tidak mulai di hanya

satu asal. (Gambar 52)

77

Sintesis DNA berjalan dalam Arah 5’3’. Sehelai 3 ' arah 5 , dengan ujung 3' OH bebas sebagai titik tumbuh pada perpanjangan DNA (Gambar.53). Karena dua untai DNA adalah antiparalel, untaian yang berfungsi sebagai template dibaca dari uung 3' ke arah 5' perusahaan akhir. Jika sintesisi mempunyai arah 5'3', bagaimanakah kedua untai dapat disintesis secara bersamaan ? Jika kedua untai disintesis terus menerus sementara garpu replikasi bergerak, satu untai harus menjalani sintesisi dari 3'5'. Masalah ini dipecahkan oleh Reiji Okazaki dan rekannya pada tahun 1960. Okazaki menemukan bahwa salah satu untai DNA baru disintesis dalam potongan pendek, sekarang disebut fragmen Okazaki Gambar 54. Karya ini pada akhirnya menyebabkan kesimpulan bahwa satu untai disintesis terus menerus (continue strand) dan untai lainnya disintesis terputus-putus (discontinue strand) (Gambar 53 dan 54 ). Untain yang disintesis dengan arah 5'3' (continue) selanjutnya disebut leading strand dan disintesis dalam arah yang sama dengan gerakan garpu replikasi. Discontinu stranf selanjutnya disebut dengan lagging strand dan disintesisi dengan arah yang berlawanan dengan arah gerakan garpu replikasi. Okazaki fragmen mempunyai ukuran beberapa ratus hingga beberapa ribu nukleotida, tergantung pada jenis sel. Seperti yang akan kita lihat sintesis leading strand dan lagging strand terkoordinasi secara ketat.

strand dan lagging strand terkoordinasi secara ketat. Gambar 53. Garpu replikasi. DNA disintesis oleh DNA

Gambar 53. Garpu replikasi.

DNA disintesis oleh DNA Polimerase. Pencarian enzim yang dapat mensintesis DNA dimulai pada tahun 1955. Arthur Kornberg dan rekan berhasil memurnikan dan mengkarakterisasi DNA polimerase dari sel E. coli, yaitu suatu polipeptida tunggal

78

yang sekarang disebut DNA polimerase I (Mr=103.000 , dikode oleh gen PolA) ). Banyak peneliti kemudian menemukan bahwa E. coli mengandung setidaknya empat DNA polimerase lainnya yang berbeda. Penemua DNA polimerase I selanjutnya diukti dengan peneman dua persyaratan utama untuk polimerisasi DNA. Pertama, semua DNA polimerase membutuhkan template (cetakan). Reaksi polimerisasi dipandu oleh DNA template yang sesuai dengan aturan pasangan basa yang diprediksi oleh Watson dan Crick: bila guanin yang ada dalam template, sebuah deoksinukleotida sitosin ditambahkan ke untai baru, dan sebagainya. Ini adalah penemuan yang sangat penting, tidak hanya karena memberikan dasar kimia untuk replikasi DNA semikonservatif akurat tetapi juga karena itu merupakan contoh pertama dari penggunaan template untuk memandu reaksi biosintesis DNA/replikasi. Kedua, polimerase membutuhkan primer. Primer adalah segmen untai (komplemen dengan template) dengan nukleotida yang mempunyai gugus 3'-hidroksil bebas sehingga nukleotida dapat ditambahkan, Gugus 3' pada akhir primer disebut primer terminal. Dengan kata lain, bagian dari untai baru harus sudah berada di tempat:

DNA polimerase hanya dapat menambahkan/memperpanjangn nukleotida ke untai yang sudah ada sebelumnya. Kebanyakan primer adalah oligonukleotida RNA, dan enzim khusus akan mensintesis primer kapan dan di mana primer diperlukan. Setelah menambahkan nukleotida ke untai DNA yang berkembang, DNA polimerase terdisoseiasi atau bergerak sepanjang template dan menambahkan nukleotida lain. Pemisahan dan reassociation polimerase dapat membatasi keseluruhan proses polimerisasi tingkat tetapi pada umumnya lebih cepat ketika polimerase menambahkan lebih nukleotida tanpa memisahkan diri dari template. Rata-rata jumlah nukleotida yang ditambahkan sebelum polimerase terdisosiasi menentkan prosesnya (processivity). DNA polimerase sangat bervariasi dalam processivity, ada yang hanya menambahkan beberapa nukleotida sebelum disosiasi, yang lain mampu menambahkan ribuan nukleotida.

79

Gambar 54, Sintesis dari fragmen okazaki Sintesis molekul DNA terjadi dalam tiga tahap: inisiasi, elongasi,

Gambar 54, Sintesis dari fragmen okazaki

Sintesis molekul DNA terjadi dalam tiga tahap: inisiasi, elongasi, dan terminasi yang dapat dibedakan dengan baik oleh reaksi yang terjadi dan oleh enzim yang dibutuhkan. Studi yang dibahasa di sini adalah hasil percobaan in vitro menggunakan protein-proteain yang dimurnikan dari E. coli, dan prinsip-prinsip hampir sama dalam semua sistem replikasi yang ada pada makluk hidup. Langkah pertama dalam replikasi DNA adalah pemutusan ikatan hidrogen antara basa dari dua untai DNA antiparalel. Pembukaan terjadi pada titil awal replikasi yaitu daerah-daerah yang kaya akan basaA dan T. Hal ini mdah dipahami hanya dua ikatan hidrogen antara Adenin dan Timin. Helikase adalah enzim yang memotong ikatan hidrogen antara dua untai DNA tersebut. Titik di mana inisiasi membelah mulai disebut "titik awal replikasi". Struktur yang dihasilkan dikenal sebagai "Garpu replikasi". Salah satu langkah yang paling penting dari Replikasi DNA adalah pengikatan RNA primase di titik inisiasi dari rantai 3' - 5' DNA induk. RNA primase dapat menarik nukleotida RNA dan mengikatnya pada nukleotida DNA (3'-5') melalui ikatan hidrogen antarabasa pada DNA dan RNA. Nukleotida RNA disebut primer (pemula) untuk mengikat nukleotida DNA. Proses perpanjangan berbeda untuk untaian 5'-3 'dan 3'-5' (gambar 53 dan 54:

(1) Pada template dengan arah 3'-5' untaian DNA anak dibuat dengan arah at 5'-3' dan disebut leading strand (untai pemimpin). DNA Polymerase III dapat"membaca" template dan terus menerus menambahkan nukleotida

80

yang komplement dengan nukleotida template, misalnya Adenin berlawanan dengan timin dll ). (2) Template dengan arah 5' -3' tidak bisa " dibaca" oleh DNA polimerase III. Replikasi pada template ini rumit menghasilkan untaian baru yang disebut lagging strand. Pada untai ini primase menambahkan lebih banyak oligonukleotida RNA Primer pada DNA induk. DNA polimerase membaca template dan memperpanjang banyak primer menghasilkan fragmen-fragmen DNA anak yang disebut disebut " Fragmen Okazaki " ( Gambar. 53 dan 54). Primer RNA diperlukan oleh DNA polimerase untuk mengawali perpanjangan. Untaian DNA anak diperpanganjang dengan menambahkan nuklotida penyusun DNA. Pada lagging strand aktifitas nuklease dari DNA Polimerase I dan membaca fragmen dan menghapus Primer RNA. Kesenjangannya kemudian ditutup dengan aksi DNA Polymerase DNA I (menambahkan nukleotida melengkapi kesenjangan) dan DNA ligase (menambahkan fosfat dalam celah yang tersisa dari fosfat - tulang punggung gula ). Setiap double helix baru terdiri dari satu untai DNA lama dan satu untai DNA baru, yang disebut dengan replikasi semikonservatif.

Langkah terakhir dari Replikasi DNA adalah terminasi. Proses ini terjadi ketika DNA Polymerase mencapai ke akhir untai DNA induk. Kita dapat dengan mudah memahami bahwa di bagian terakhir dari lagging strand, ketika primer RNA akan dihapus dan DNA yang tidak tergabung digabungkan oleh DNA ligase .

81

(a)

(a) (b) Gambar 55. (a) DNA Template dan nontemplate (coding). (b) Organisasi pengkodean informasi dalam genom
(b)
(b)

Gambar 55. (a) DNA Template dan nontemplate (coding). (b) Organisasi pengkodean informasi dalam genom adenovirus

J.

Transkripsi

Ekspresi informasi dalam gen umumnya melibatkan produksi sebuah molekul

RNA sebagai transkrip (salinan) dari DNA templat. Untai RNA dan DNA mungkin

tampak sangat mirip pada pandangan pertama, hanya daja pada RNA memiliki gugus

hidroksil pada posisi 2'dari aldopentose dan timin digantikan oleh uracil. Namun,

tidak seperti DNA, RNA kebanyakan melaksanakan fungsi mereka sebagai untai

tunggal. Untai tinggal RNA yang melipat dengan dirinya sendiri memiliki potensi

untuk keanekaragaman struktural. Selama replikasi seluruh kromosom biasanya

disalin, tapi penyalinan pada proses transkripsi lebih selektif, dimana hanya gen atau

kelompok gen tertentu ditranskripsikan pada satu waktu, dan beberapa bagian dari

genom DNA tidak pernah ditranskrip. Sel membatasi ekspresi informasi genetik

untuk pembentukan produk gen yang dibutuhkan pada setiap saat tertentu.

Pengendalian yang spesifik menandai awal dan akhir dari segmen DNA yang akan

ditranskripsi dan menunjuk pada untai DNA dupleks yang akan digunakan sebagai

template untuk transkripsi. Kedua untai DNA komplementer memiliki peran yang

berbeda dalam transkripsi. Untai yang berfungsi sebagai template untuk sintesis

RNA disebut untai template strand (cetakan RNA) sedangkan untai DNA yang

komplementer dengan template (untai nontemplate) disebut coding strand. Urutan

basa dari coding strand identik dalam urutan basa untuk RNA hasil transkripsi dari

gen, hanya saja U di RNA menempati posisi T dalam DNA (Gambar 55a). Coding

82

strand untuk gen tertentu mungkin terletak di salah satu untai kromosom tertentu. Urutan regulasi yang mengendalikan transkripsi (secara konvensi ditunjuk oleh urutan di coding strand. Informasi genetik dari genom adenovirus (contoh mudah yang sederhana) dikode oleh molekul DNA beruntai ganda sejumlah 36.000 bp dan kedua untai yang menyandi protein (gambar 55b). Informasi untuk kebanyakan protein dikodekan oleh untai yang di bagian atas dan untai ditranskripsi dari kiri ke kanan tetapi beberapa dikodekan oleh untai bawah, yang tertuang dalam arah yang berlawanan. Sintesis mRNA dalam adenovirus sebenarnya jauh lebih kompleks pada daripada yang ditampilkan di sini. Banyak mRNA untai atas yang awalnya disintesis sebagai transkrip tunggal yang panjang (25.000 nukleotida), yang kemudian diproses menghasilkan mRNA kecil-kecil yang terpisah. Adenovirus menyebabkan infeksi pada saluran pernapasan vertebrata. Transkripsi DNA dikatalisis oleh RNA polimerase. Tiga tipe RNA polimerase telah diidentifikasi dalam inti eukariot. RNA polimerase I (Pol I) bertanggung jawab untuk sintesis hanya satu jenis RNA yaitu transkrip yang disebut RNA preribosomal (atau pra-rRNA), yang berisi prekursor untuk 18S , 5.8S , dan 28S rRNA. Fungsi utama RNA polimerase II (Pol II) adalah sintesis mRNA dan beberapa RNA khusus. RNA polimerase III (Pol III) membuat tRNA, rRNA 5S, dan beberapa RNA khusus lainnya kecil

polimerase III (Pol III) membuat tRNA, rRNA 5S, dan beberapa RNA khusus lainnya kecil Gambar 56.

Gambar 56. Promotor pada bakteri

83

Gambar 57. Inisiasi dan elongasi transkripisi pada E. coli Pertanyaannya adalah "Bagaimana RNA polimerase menemukan

Gambar 57. Inisiasi dan elongasi transkripisi pada E. coli

Pertanyaannya adalah "Bagaimana RNA polimerase menemukan titik yang tepat untuk memulai transcription. Ketepatan dan frekuensi dari transkripsi dikendalikan oleh protein yang terikat pada urutan DNA tertentu. RNA polimerase dapat mengikat banyak daerah pada DNA, tetapi membaca urutan DNA pada tingkat timgkat ≥ 103 bs s - sampai menemuo daerah DNA tertentu yang mengikat dengan afinitas yang lebih tinggi. Wilayah ini disebut promotor, yaitu daerah dimana DNA beasosiasi dengan RNA poliemarase yang menjamin inisiasi transkripsi yang akurat. Daerah promotor merupakan daerah target untuk regulasi tranaskripsi di semua organisme. Gambar 56 menunjukkan urutan konsensus DNA prokariotik. DNA prokariotik mengandung urutan lestari (conserved) yangterletak sekitar sepuluh nukleotida di hulu titik transkripsi yaitu enam nukleotida pada daerah yang kaya A dan T (5'-TATAAT-3'), disebut kotak Pribnow. Dalam DNA eukariotik , kotak TATAA (kotak Hogness) memainkan peran serupa yang terletak sekitar -25 di hulu titik awal transkripsi dimulai. Urutan ini memiliki titik leleh rendah karena kekurangan pasangan nukleotida GC. Dengan demikian Pribnow dan TATA box diperkirakan untuk memudahkan pemisahan antara dua untai DNA sehingga RNA polimerase terikat pada daerah promotor dan dapat memperoleh akses ke urutan nukleotida template untuk disalin ke arah hilir.

84

Gambar 58. Struktur gen pada eukariot mengandiung intron dan ekson. Gambar 59. Kamus dari kode

Gambar 58. Struktur gen pada eukariot mengandiung intron dan ekson.

58. Struktur gen pada eukariot mengandiung intron dan ekson. Gambar 59. Kamus dari kode amino asam

Gambar 59. Kamus dari kode amino asam dalam mRNA. Kodon ditulis dalam arah 5 '3'

Transkripsi terdiri dari langkah-

langkah: (2) inisiasi, (3) perpanjangan ,

dan (4) terminasi (Gambar 57). Inisiasi

transkripsi memerlukan beberapa langkah

dan umumnya dibagi menjadi dua tahap

yaitu tahap pengikatan dan inisiasi. Pada

tahap pengikatan, interaksi awal RNA

polimerase dengan promotor

menyebabkan pembentukan kompleks

tertutup, di mana DNA promotor stabil

terikat tapi tidak memutuskan ikatan

hidrogen. Sekitar 12 sampai 15 bp dari

wilayah DNA dalam wilayah -10 ke

posisi -2 atau -3 kemudian dibuka dengan

memutuskan ikatan hidrogen untuk

membentuk sebuah kompleks terbuka. Intermediet tambahan (tidak ditampilkan)

telah terdeteksi di jalur antara pembentukan kompleks tertutup dan terbuka, bersama

dengan beberapa perubahan konformasi protein. Tahap inisiasi meliputi inisiasi

transkripsi dan pembersihan promotor. Setelah 8 atau 9 nukleotida dari RNA baru

disintesis, yang salah satu subnit (disebut subunit ) dari kompleks RNA polimerase

dilepaskan dan polimerase meninggalkan promotor untuk pemanjangan RNA.

Transkrip utama untuk mRNA eukariotik biasanya berisi sekuens meliputi satu gen,

meskipun urutan pengkodean polipeptida mungkin tidak bersebelahan. Saluran

noncoding yang memecah daerah pengkode transkrip disebut intron dan segmen

coding disebut ekson (gambar 58). Dalam proses yang disebut splicing, intron akan

85

dihapus dari transkrip primer dan ekson kemudian bergabung untuk membentuk urutan yang kontinu yang menentukan urutan polipeptida. mRNA eukariotik juga dimodifikasi pada setiap akhir.

K. Protein Biosintesis

Kode genetik dilaporka pada tahun 1961 oleh Marshall Nirenberg dan Heinrich Matthaei melaporkan temuan baru yang luar biasa tentang kode genetik untuk pertama kalinya. Mereka menginkubasi polyuridylate sintetis buatan mereka poli (U) dengan ekstrak E. coli , GTP , ATP, dan campuran dari 20 asam amino dalam 20 tabung yang berbeda dan masing-masing tabung berisi yang asam amino yang berbeda dan berlabel radioaktif. Ternya poli (U) adalah mRNA terdiri dari banyak triplet UUU berurutan yang mempromosikan sintesis polipeptida hanya mengandung asam amino fenilalanin. Pendekatan yang sama mengungkapkan bahwa polycytidylate/poli (C), mengkode polipeptida hanya berisi prolin (polyproline), dan polyadenylate/poli (A) mengkode polylysine Konsolidasi hasil dari banyak percobaan mengungkap tugas 61 dari 64 tiga kombinasi nuklotida yang disebut kodon sedang kan tiga lainnya bertindak sebagai kodon terminasi , sebagian karena mereka terganggu asam amino pola pengkodean ketika mereka terjadi dalam polimer sintetis RNA . Makna untuk semua kodon triplet (ditabulasikan dalam Gambar. 58) dilengkapi pada tahun 1966 dan telah diverifikasi dalam berbagai cara. Penemuan dari kode genetik dianggap sebagai salah satu penemuan ilmiah yang paling penting dari abad kedua puluh. Kodon adalah kunci untuk terjemahan informasi genetik, mengarahkan sintesis protein spesifik. Reading frame adalah satu set mRNA mulai diterjemahkan menjadi protein dan dipertahankan sebagai mesin sintetis untuk membaca secara berurutan dari satu triplet ke triplet yang berikutnya. Jika bingkai pada reading frame kehilangan satu atau dua baanya maka terjemahan mRNA menjadi kacua. Ada pengecualian yang tidak biasa tapi menarik beberapa aturan ini. kodon inisiasi AUG adalah sinyal paling umum untuk awal sintesis polipeptida di semua sel, selain sebagai kode untuk residu Met pada posisi internal polipeptida. Kodon terminasi ( UAA , UAG , dan UGA ), juga disebut kodon penghenti atau kodon kosong, biasanya menandakan akhir dari sintesis polipeptida dan tidak

86

mengkod asam amino yang dikenal. Inisiasi sintesis protein dalam sel adalah proses

yang rumit yang bergantung pada kodon

inisiasi dan sinyal lain dalam mRNA.

Molekul tRNA adalah sebuah

molekul RNA dengan struktur L terbalik

yang bersaifat lestari di semua

organisme. Salah satu ujung tRNA

mengandung triple nukleotida antikodon

yang berpasangan dengan kodon yang

ada pada mRNA menentukan asam

amino tertentu (Gambar 60). Ujung

tRNA memiliki asam amino yang

melekat pada 3' gugus OH melalui ikatan

ester . tRNA dengan asam amino

terpasang harus selelu diisi. Enzim yang

melekatkan asam amino ke 3'-OH

disebut tRNA aminoasil sintetase

(aaRS). tRNA spesifik untuk setiap

asam amino yang kesemuanya terdiri

dari 20 dalam semua . Demikian pual

dengan RS, juga sangat spesifik untuk

setiap tRNA. Hanya pertama 2

nukleotida pertama dalam antkodon

tRNA menterjemahkan/mendekoding

kodon dari mRNA menjadi asam amino.

Nukleotida ketiga dalam antikodon

kurang ketat dalam memasangkan basa

pasangannya pada kodon di mRNA, dan

disebut sebagai basa bergoyang

("wobble"). Karenanya kode genetik

basa bergoyang ("wobble"). Karenanya kode genetik Gambar 60. Komposisi ribosom pada sel prokariot dan eukariot

Gambar 60. Komposisi ribosom pada sel prokariot dan eukariot

Gambar 60. Komposisi ribosom pada sel prokariot dan eukariot Gambar 61. Struktur dasar tRNA yang memiliki

Gambar 61. Struktur dasar tRNA yang memiliki antikodon di satu ujung dan mengikat asam amino di ujung lainnya

degen erat, yang berarti bahwa lebih

dari satu kodon dapat menentukan asam

87

amino tunggal, antikodon tRNA dapat memasangkan lebih dari satu kodon mRNA dan masih menjadi spesifik untuk asam amino tunggal (Gambar 60). Ribosom adalah organel intraseluler , sekitar 200 A diameter , terdiri dari RNA dan protein . Ribosom terdiri biosintesis protein dimana messenger RNA ( mRNA ) diterjemahkan menjadi protein. Ribosom terdiri dari dua subunit, satu subunit besar dan satu subunit kecil, masing-masing hanya mengandung protein dan RNA. Subunitunit ribosom dengan koefisien sedimentasi mereka , dinyatakan dalam satuan Svedberg (simbol: S). Ribosom prokariotik (70S) terdiri subunit besar (50S) dan subunit kecil ( 30S ) , sedangkan ribosom pada eukariotik ( 80S ) terdiri subunit besar ( 60S ) dan subunit kecil ( 40S ) (Gambar 61). Dua tempat pada subunit besar ribosom terlibat dalam penerjemahan kode genetik, yaitu aminoasil (pisisi A) dan situs peptidil (posisi P ). Ribosom dari prokariota, eukariota, mitokondria, dan kloroplas memiliki protein ribosom khas yang berbeda. Kedua subunit ribosom berbentuk tidak teratur dan membetuk celah dan di mana ribosom bergerak sepanjang rantai mRNA selama terjemahan. Terdapat 55 protein dalam ribosom bakteri dengan variasi dalam ukuran dan struktur. Berat molekul berkisar dari sekitar 6.000 hingga 75.000. Sebagian besar protein memiliki domain globular diatur pada permukaan ribosom. Beberapa juga memiliki protein seperti ular yang menonjol ke dalam inti rRNA ribosom untuk menstabilkan struktur. Fungsi dari beberapa protein ini belum jelaskan. Urutan dari rRNA dari banyak organisme yang sekarang telah banyak diketahui. Masing-masing dari tiga rRNA beruntai tunggal E. coli memiliki konformasi tiga dimensi yang spesifik menampilkan interaksi antar rantai dengan pasangan basa yang bervariasi. Ribosom sel eukariotik (selain ribosom mitokondria dan kloroplas) lebih besar dan lebih kompleks daripada ribosom bakteri, dengan diameter sekitar 23 nm dan koefisien sedimentasi sekitar 80S. Mereka juga memiliki dua subunit , yang bervariasi dalam ukuran antara spesies tetapi rata-rata adalah 60S dan 40S . Secara keseluruhan , ribosom eukariotik mengandung lebih dari 80 protein yang berbeda . Ribosom mitokondria dan kloroplas agak lebih kecil dan lebih sederhana daripada ribosom bakteri . Namun demikian , struktur dan fungsi ribosom yang sangat mirip dalam semua organisme dan organel . Protein biosintesis terjadi dalam lima tahapan. Tahap 1: Aktivasi Asam amino, Untuk sintesis polipeptida dengan urutan yang ditetapkan, dua persyaratan kimia dasar harus dipenuhi: (1) gugus karboksil dari asam amino yang masing-

88

masing harus diaktifkan untuk memfasilitasi pembentukan ikatan peptida , dan (2) link harus dibangun antara masing-masing asam amino baru dan informasi dalam mRNA yang mengkode itu. Kedua persyaratan ini dipenuhi dengan mengikatkan asam amino ke tRNA pada tahap pertama sintesis protein . Memasangkan asam amino yangtepat ke tRNA yang tepatsangat penting. Reaksi ini berlangsung di sitosol, bukan pada ribosom. Masing-masing dari 20 asam amino secara kovalen melekat pada tRNA tertentu denganbantuan energi dari ATP, menggunakan enzim yang tergantung pada keberadaan Mg 2 + disebut sebagai aminoacyltRNA sintetase. Sebagian besar organisme memiliki satu aminoasilltRNA sintetase untuk setiap asam amino. Untuk asam amino dengan dua atau lebih tRNA yang sesuai. enzim yang sama biasanya menkatalisis semua aminoasil. Sintesis yang dikatalis aminoasil- tRNA sintetase, terjadi dalamdua langkah :

amino acid + ATP → aminoasil-AMP + PP i

aminoasil-AMP + tRNA → aminoasil-tRNA + AMP

Jumlah dar kedua reaksi tersebut:

amino acid + tRNA + ATP → aminoasil-tRNA + AMP + PP i

Tahap 2: Inisiasi mRNA. mRNA terikat ke subunit dari ribosom yang lebih kecil dan untuk memulai aminoasil - tRNA. Subunit ribosom besar kemudian bergabung untuk membentuk kompleks inisiasi dan memulai proses sintesis. AUG adalah sinyal awal polipeptida . Proses ini , yang membutuhkan GTP, didorong oleh protein sitosol yang disebut faktor inisiasi. Sintesis protein dimulai pada amino terminal N dan hasilnya ditambah secarabertahap dari ujung karboksil-terminal dari polipeptida yang tumbuh, sebagaimana ditentukan oleh Howard Dintzis pada tahun 1961 (Gambar 62) . Meskipun metionin hanya memiliki satu kodon, (5')AUG , semua organisme memiliki dua tRNA untuk metionin. Salah satunya adalah digunakan secara eksklusif saat 5'AUG sebagai kodon inisiasi untuk sintesis protein dan yanang lainnya digunakan untuk kode untuk residu Met pada posisi internal polipeptida. Pada bakteri, dua jenis tRNA spesifik untuk metionin ditujukan tRNAMet dan tRNAfMet. Asam amino yang tergabung dalam kodon inisisasi (5')AUG N - formilmetionin ( fMet). Pada bakteri , langkah inisiasi membutuhkan (1) subunit

89

ribosom 30S, (2) mRNA yang mengkode polipeptida yang akan dibuat, (3) fMet - tRNAfMet, (4) satu set dari tiga protein yang disebut faktor inisiasi (IF-1, IF-2, dan IF-3), (5) GTP, (6) ribosom subunit 50S, dan (7) Mg 2+ . Pembentukan kompleks inisiasi berlangsung dalam tiga langkah. Pada langkah 1 subunit ribosom 30S mengikat dua faktor inisiasi, IF- dan IF-3. Faktor IF-3 mencegah 30S dan 50S subunit dari menggabungkan secara prematur. mRNA kemudian mengikat subunit 30S . Interaksi mRNA - rRNA memposisikan kodon inisisaso (5 ) AUG dari mRNA pada posisi yang tepat pada 30S subunit dimamana diperlukan untuk inisiasi penerjemahan . (5') Posisi dimana AUG dari fMet - tRNAfMet terikat dibedakan dari kodon metionin lainnya oleh kedekatannya dengan urutan Shine- Dalgarno dalam mRNA. Ribosom bakteri memiliki tiga pusat pengikatan aminoasil - tRNA, aminoasil (A , peptidil (P) , dan tempat keluar (E ). Baik 30S dan 50S subunit berkontribusi pada karakteristik sisi A dan P, sedangkan sisi E sebagian besar terbatas pada subunit 50S. Kodon pemula (5') AUG diposisikan di sisi P, satu- satunya sisi yang dapat mengikat fMettRNAfMet. fMet - tRNAfMet adalah satu- satunya aminoasil-tRNA yang mengikat pertama ke situs P, selama tahap perpanjangan berikutnya , semua aminoasil - tRNA lain ( termasuk Met - tRNAMet) mengikat ke sisi A dan kemudian ke sisi P dan E . Sisi E adalah sisi dimaana tRNA lepas selama elongasi. Faktor IF-1 mengikat di lokasi A dan mencegah tRNA mengikat di sisi ini selama inisias. Pada langkah 2 dari proses inisiasi, kompleks yang terdiri dari subunit ribosom 30S , IF-3 , dan mRNA bergabung dengan kedua GTP yang terikat pada IF-2 dan fMet - tRNAfMet. Antikodon tRNA ini sekarang berpasangan dengan benar dengan kodon inisiasi dari mRNA. Pada langkah 3 kompleks besar menggabungkan dengan subunit ribosom 50S , secara bersamaan , GTP yang terikat IF-2 dihidrolisis menjadi GDP dan Pi, yang dilepaskan dari kompleks. Ketiga faktor inisiasi berangkat dari ribosom pada saat ini.

90

Gambar .62.Biosintesis protein Tahap 3: Rantai polipeptida diperpanjang melalui pembentukan kovalen antar unit asam amino

Gambar .62.Biosintesis protein

Tahap 3: Rantai polipeptida diperpanjang melalui pembentukan kovalen antar unit asam amino yang berurutan, dan masing-masing dibawa ke ribosom dan diposisikan oleh tRNA dengan tepat, dimana basanya berpasangan dengan kodon yang sesuai pada mRNA. Pemanjangan membutuhkan protein sitosol yang dikenal sebagai faktor elongasi. Pengikatan setiap masuk aminoasil-tRNA dan pergerakan ribosom sepanjang mRNA yang difasilitasi oleh hidrolisis GTP saat masing-masing residu ditambahkan ke tumbuh polipeptida. Langkah pertama perpanjangan rantai pada bakteri: pengikatan aminoasil-tRNA yang kedua ke sisi A dari ribosom yang mengikat terikat EF-Tu (yang juga mengandung GTP). Pengikatan aminoasil tRNA kedua ke ke sisi tersebut dibarengi dengan hidrolisis dari GTP menjadi GDP dan Pi dan pelepasan EF- Tu-GDP dari ribosom. GDP dilepaskan ketika kompleks EF-Tu-GDP mengikat EF-Ts , dan EF-Ts selanjutnya dilepaskan ketika molekul lain GTP mengikatkan diri ke EF-Tu. Proses ini mendaur ulang EF-Tu dan membuatnya selalu tersedia untuk mengulang siklus. Langkah kedua perpanjangan pada bakteri adalah pembentukan ikatan peptida pertama dikatalisis oleh peptidil transferase.

91

mengkatalisis reaksi. Gugu N-formylmethionyl ditransfer ke gugus amino dari kedua aminoasil - tRNA di sidi A, membentuk dipeptidyl-tRNA. pada tahap ini, kedua tRNA terikat pada posisi pergeseran ribosom subunit 50S untuk mengambil keadaan hibrid sehinga terjadi pergeseran tRNA yang berakibat unjung 3'dan 5' berada di sisi E 5'ends 3'and dari peptidil tRNA pergeseran ke situs P anticodons tetap berada di A dan situs P elongasi langkah dalam bakteri : . translokasi. ( a) ribosom bergerak satu kodon ke arah ujung 3 ' dari mRNA , menggunakan energi yang disediakan oleh hidrolisis GTP terikat EF - G ( translocase ) . The dipeptidyl - tRNA kini sepenuhnya di situs P , meninggalkan situs A buka untuk masuk ( ketiga) aminoasil - tRNA . yang bermuatan memisahkan tRNA dari situs E , dan siklus pemanjangan dimulai lagi . ( b ) struktur EF - G meniru struktur EF - Tu dikomplekskan dengan tRNA .

Tahap 4: Pemberhentian dan penyelesaian sintesis rantai Penyelesaian rantai polipeptida ditandai oleh kodon terminasi mRNA . Polipeptida baru dilepaskan dari ribosom , dibantu oleh protein yang disebut faktor rilis . Penghentian sintesis protein pada bakteri . Pemutusan terjadi dalam menanggapi kodon terminasi di situs A . Pertama , faktor rilis , RF ( RF - 1 atau RF - 2 ) , tergantung pada kodon terminasi sekarang) , mengikat ke situs A . Hal ini menyebabkan hidrolisis ester keterkaitan antara polipeptida baru lahir dan tRNA di situs P dan pelepasan selesai polipeptida . Akhirnya , mRNA , tRNA deacylated , dan faktor rilis meninggalkan ribosom , dan memisahkan ribosom 30S menjadi subunit 50S dan . Tahap 5 : Folding dan posttranslational Pengolahan Untuk mencapai bentuk biologis aktif , polipeptida baru harus melipat ke dalam konformasi tiga dimensi yang tepat . Sebelum atau setelah melipat, polipeptida baru dapat mengalami pengolahan enzimatik , termasuk penghapusan satu atau lebih asam amino (biasanya dari ujung amino) , penambahan asetil , fosforil , metil , karboksil , atau kelompok lain untuk residu asam amino tertentu; proteolitik , dan / atau lampiran oligosakarida atau kelompok prostetik.

92

BAB IV

PENGANTAR SINGKAT TENTANG DNA TEKNOLOGI BERBASIS

Reaksi Polimerasi Rantai atau PCR (Polymerase Chain Reaction) adalah metode revolusioner yang dikembangkan oleh Kary Mullis pada tahun 1980. PCR didasarkan pada penggunaan kemampuan polimerase DNA untuk mensintesis untai baru DNA yang komplementer dengan template. Karena DNA polimerase dapat menambahkan nukleotida hanya ke gugusyang sudah ada 3'-OH sebelumnya, makan dibutuhkan primer yang dapat menambahkan nukleotida pertama. Persyaratan ini memungkinkan untuk menggambarkan wilayah tertentu dari urutan template yang peneliti ingin memperkuat. Pada akhir reaksi PCR, urutan tertentu akan terakumulasi dalam miliaran salinan (amplikon). RT-PCR (Lookup Transkripsi PCR) adalah PCR didahului dengan konversi RNA sampel menjadi cDNA dengan enzim reverse transcriptase.

Reaksi PCR membutuhkan komponen-komponen berikut : Template DNA - sampel DNA yang berisi urutan target . Pada awal reaksi , suhu tinggi diterapkan dengan aslinya molekul DNA beruntai ganda untuk memisahkan helai dari satu sama lain. DNA polimerase - jenis enzim yang mensintesis untai baru DNA komplementer dengan urutan target . Yang pertama dan paling umum digunakan enzim ini adalah Taq DNA polimerase (dari Thermus aquaticus ) , sedangkan DNA polimerase PFU (dari Pyrococcus furiosus ) digunakan secara luas karena kesetiaan yang lebih tinggi saat menyalin DNA. Meskipun enzim ini agak berbeda , mereka berdua memiliki dua kemampuan yang membuat mereka cocok untuk PCR: 1 ) mereka dapat menghasilkan untaian DNA baru menggunakan template DNA dan primer , dan 2 ) mereka tahan panas. Primer - potongan pendek DNA beruntai tunggal yang melengkapi urutan target . Polimerase mulai mensintesis DNA baru dari ujung primer .Nukleotida ( dNTP atau trifosfat Deoksinukleotida ) - unit tunggal dari basis A , T , G , dan C , yang pada dasarnya " blok bangunan " untuk untai DNA baru.

93

Gambar 63. Proses PCR Reaksi bersepeda PCR: Ada tiga langkah utama dalam PCR (Gambar 63)

Gambar 63. Proses PCR Reaksi bersepeda PCR: Ada tiga langkah utama dalam PCR (Gambar 63) , yang diulang selama 30 atau 40 siklus . Hal ini dilakukan pada pengendara sepeda otomatis, yang dapat memanaskan dan mendinginkan tabung dengan campuran reaksi dalam waktu yang sangat singkat .1 . Denaturasi pada 94 ° C :Selama denaturasi tersebut , untai ganda mencair terbuka untuk DNA beruntai tunggal , semua reaksi enzimatik berhenti ( misalnya : perpanjangan dari siklus sebelumnya )

.2 . Annealing pada 54 ° C ( atau tergantung pada suhu leleh primer ) :Primer yang bergoyang di sekitar , yang disebabkan oleh gerak Brown . Ikatan ion terus terbentuk dan rusak antara primer beruntai tunggal dan template beruntai tunggal . Semakin stabil obligasi terakhir sedikit lebih lama ( primer yang pas ) dan sepotong kecil DNA beruntai ganda (template dan primer ) , polimerase dapat melampirkan dan mulai menyalin template . Setelah ada beberapa basis yang dibangun di , ikatan ionik

begitu kuat antara template dan primer , yang tidak pecah lagi

ekstensi pada 72 ° C

:Ini adalah suhu kerja ideal untuk polimerase . Primer , di mana ada beberapa pangkalan built in, sudah memiliki daya tarik ionik kuat ke template daripada kekuatan-kekuatan melanggar atraksi ini . Primer yang ada di posisi yang tidak sama persis , dapatkan longgar lagi ( karena suhu yang lebih tinggi ) dan tidak

memberikan perpanjangan fragmen. Basis (melengkapi template) yang digabungkan dengan primer pada 3 'sisi ( polimerase menambahkan dNTP itu dari 5 ' ke 3 ' ,

94

membaca template dari 3 ' ke sisi 5 ' , basa ditambahkan melengkapi template )Keterbatasan PCR dan RT - PCR :Reaksi PCR mulai menghasilkan salinan urutan target secara eksponensial . Hanya selama fase eksponensial dari reaksi PCR adalah mungkin untuk menghitung mundur untuk menentukan jumlah awal dari urutan target yang terkandung dalam sampel . Karena inhibitor reaksi polimerase ditemukan dalam sampel , keterbatasan reagen , akumulasi molekul pirofosfat , dan self - anil dari produk terakumulasi , reaksi PCR akhirnya berhenti untuk memperkuat urutan target pada tingkat yang eksponensial dan " efek dataran tinggi " terjadi , membuat titik kuantifikasi akhir produk PCR dapat diandalkan . Ini adalah atribut yang membuat PCR. Real-Time Kuantitatif RT -PCR sangat diperlukan. DNA kloning. Kami akan diskusikan garis besar prinsip-prinsip biokimia dasar disiplin sekarang - klasik kloning DNA . Clone merupakan salinan identik . Istilah ini awalnya diterapkan untuk sel dari satu jenis , terisolasi dan dibiarkan bereproduksi untuk menciptakan populasi sel identik. Kloning DNA melibatkan memisahkan gen tertentu atau segmen DNA dari kromosom yang lebih besar , melampirkan ke sebuah molekul kecil DNA pembawa , dan kemudian mereplikasi ini ribuan DNA diubah atau jutaan kali baik melalui peningkatan jumlah sel dan penciptaan beberapa salinan DNA kloning dalam setiap sel . Hasilnya adalah amplifikasi selektif gen tertentu atau segmen DNA .Kloning o DNA dari organisme apapun memerlukan lima prosedur umum (Gambar 64). Pemotongan DNA pada lokasi yang tepat . Endonuklease -urutan tertentu ( endonuklease restriksi ) memberikan gunting molekul yang diperlukan .2 . Memilih molekul kecil DNA mampu replikasi diri . Ini DNA disebut vektor kloning ( vektor adalah agen pengiriman ) . Mereka biasanya plasmid atau DNA virus.3 . Bergabung dua fragmen DNA kovalen . Enzim Link DNA ligase vektor kloning dan DNA yang akan dikloning . Molekul DNA komposit yang terdiri dari segmen kovalen terkait dari dua atau lebih sumber disebut DNA rekombinan .4 . Pindah DNA rekombinan dari tabung tes ke sel host yang akan menyediakan mesin enzimatik untuk replikasi DNA .5 . Memilih atau mengidentifikasi sel inang bahwa DNA containrecombinant .

95

Gambar 64. Teknologi kloning Metode yang digunakan untuk menyelesaikan tugas ini dan terkait secara kolektif

Gambar 64. Teknologi kloning

Metode yang digunakan untuk menyelesaikan tugas ini dan terkait secara kolektif disebut sebagai teknologi DNA rekombinan atau , lebih informal , rekayasa genetika . Banyak diskusi awal kami akan fokus pada kloning DNA dalam bakteri Escherichia coli , organisme pertama kali digunakan untuk pekerjaan DNA rekombinan dan masih sel inang yang paling umum . E. coli memiliki banyak keuntungan :

metabolisme DNA-nya ( seperti banyak lainnya proses biokimia ) dipahami dengan baik , banyak alami vektor kloning terkait dengan E. coli , seperti plasmid dan bakteriofag ( virus bakteri , juga disebut fag ) , baik ditandai , dan teknik yang tersedia untuk memindahkan DNA secepatnya dari satu sel bakteri yang lain .

96

Endonuklease restriksi dan ligase DNA rekombinan DNA Yield Sangat penting untuk teknologi DNA rekombinan yang tersedia melalui dekade penelitian pada metabolisme asam nukleat . Dua kelas enzim terletak di jantung dari pendekatan umum untuk menghasilkan dan menyebarkan molekul DNA rekombinan. Pertama , endonuklease restriksi ( juga disebut enzim restriksi ) mengenali dan memotong DNA pada sekuens DNA spesifik ( urutan pengakuan atau situs restriksi ) untuk menghasilkan satu set fragmen yang lebih kecil . Kedua , fragmen DNA yang akan dikloning dapat bergabung ke vektor kloning yang cocok dengan menggunakan ligases DNA untuk menghubungkan molekul DNA bersama- sama . Rekombinan vektor ini kemudian dimasukkan ke dalam sel inang , yang menguatkan fragmen dalam perjalanan banyak generasi pembelahan sel . Endonuklease restriksi ditemukan di berbagai spesies bakteri . Werner Arber ditemukan pada awal 1960-an bahwa fungsi biologis mereka adalah untuk mengenali dan memotong DNA asing (DNA dari virus yang menginfeksi , misalnya) , DNA tersebut dikatakan dibatasi . Dalam DNA sel inang , urutan yang akan kegiatan recognizedase dan methylase . Beberapa endonuklease restriksi membuat pemotongan terhuyung-huyung pada dua untai DNA , meninggalkan 2-4 nukleotida dari satu untai berpasangan di setiap akhir yang dihasilkan . Untaian berpasangan disebut sebagai ujung lengket , karena mereka dapat pasangan basa dengan satu sama lain atau dengan ujung lengket komplementer fragmen DNA lainnya . Pembatasan lainnya endonuklease membelah kedua untai DNA pada ikatan fosfodiester lawan, tanpa meninggalkan basa berpasangan di ujung, yang sering disebu ujung tumpul Gambar 65 ) . Setelah fragmen DNA target terisolasi , DNA ligase dapat digunakan untuk bergabung ke kloning sama dicerna vektor yaitu vektor dicerna oleh endonuklease restriksi yang sama , sebuah fragmen yang dihasilkan oleh EcoRI , misalnya , umumnya tidak akan link ke fragmen yang dihasilkan oleh BamHI . Peneliti dapat membuat urutan DNA baru dengan memasukkan fragmen DNA sintetis (disebut linker) antara ujung-ujung yang sedang diikat . Fragmen DNA Dimasukkan dengan beberapa urutan pengakuan untuk endonuklease restriksi ( sering berguna kemudian sebagai poin untuk memasukkan DNA tambahan dengan belahan dada dan ligasi ) disebut polylinkers .

97

Gambar 65. Pembentukan DNA rekombinan 98

Gambar 65. Pembentukan DNA rekombinan

98

BAB V

LIPID

Lipid adalah kelompok heterogen senyawa, termasuk lemak, minyak , steroid , lilin , dan senyawa terkait , yang terkait lainnya dari fisik mereka daripada oleh sifat kimianya. Mereka memiliki kesamaan properti menjadi ( 1 ) relatif tidak larut dalam

air dan ( 2 ) larut dalam pelarut nonpolar seperti eter dan kloroform . Mereka adalah

konstituen makanan penting bukan hanya karena nilai energi yang tinggi tetapi juga karena dari vitamin yang larut dalam lemak dan lemak esensial Asam yang terkandung dalam lemak makanan alami . Lemak disimpan dalam jaringan adiposa ,

di mana ia juga berfungsi sebagai isolator termal dalam jaringan subkutan dan di

sekitar organ-organ tertentu . Lipid nonpolar bertindak sebagai isolator listrik , yang memungkinkan cepat rambat gelombang depolarisasi sepanjang mielin saraf . Kombinasi lipid dan protein ( lipoprotein ) adalah konstituen seluler penting , terjadi baik dalam membran sel dan dalam mitokondria , dan melayani juga sebagai sarana transportasi lipid dalam darah . Pengetahuan biokimia lipid diperlukan dalam memahami banyak biomedis penting daerah , misalnya , obesitas , diabetes mellitus , aterosklerosis , dan peran berbagai asam lemak tak jenuh ganda dalam gizi dan kesehatan.

Lipid diklasifikasikan sebagai lipid sederhana dan lipid kompleks.

1. Lipid sederhana: Ester dari asam lemak dengan berbagai alkohol.

a. Lemak: Ester dari asam lemak dengan gliserol. Minyak adalah lemak dalam keadaan cair.

b. Lilin: Ester dari asam lemak dengan molekul yang lebih tinggi Berat

monohidrat alkohol.

2. Lipid kompleks: Ester dari asam lemak yang mengandung kelompok selain alkohol dan asam lemak.

a. Fosfolipid: Lipid yang mengandung, selain menjadi asam lemak dan

alkohol, fosfat yang residu asam. Mereka sering memiliki nitrogencontaining

99

dasar dan substituen lainnya, misalnya, dalam gliserofosfolipid alkohol adalah gliserol dan sphingophospholipids alkohol adalah sphingosine. b. Glikolipid (glycosphingolipids): Lipid mengandung asam lemak, sphingosine, dan karbohidrat. c. Lipid kompleks lainnya: Lipid seperti sulfolipids dan aminolipids. lipoprotein mungkin juga ditempatkan dalam kategori ini. 3. Prekursor dan turunan lipid: Ini termasuk lemak asam, gliserol, steroid, alkohol lainnya, aldehida lemak, dan badan-badan keton , hidrokarbon, vitamin larut lemak, dan hormon.

Karena mereka tidak bermuatan, acylglycerols (gliserida), kolesterol, dan kolesterol ester disebut lipid netral.

Asam Lemak merupakan asam karboksilat alifatik

Asam lemak terjadi terutama sebagai ester dalam lemak dan minyak alami tetapi terjadi dalam bentuk tanpa esterifikasi sebagai lemak bebas asam, bentuk transportasi yang ditemukan dalam plasma. asam lemak yang terjadi pada lemak alami biasanya turunan rantai lurus mengandung bahkan jumlah atom karbon. Rantai mungkin jenuh (yang tidak mengandung ganda obligasi) atau tidak jenuh (yang mengandung satu atau lebih ganda obligasi).

Nomenklatur sistematis yang paling sering digunakan Nama-nama asam lemak setelah hidrokarbon dengan nomor yang sama dan susunan atom karbon diikuti dengan akhiran dengan - oat. Dengan demikian , jenuh asam diberi akhiran -oat , misalnya , asam oktanoat asam , dan asam tak jenuh ganda dengan diberi akhiran - oat , misalnya asam octadecenoic ( asam oleat ) . Atom karbon diberi nomor dari karbon karboksil (karbon No 1 ) . Atom-atom karbon yang berdekatan dengan karbon karboksil ( No 2 , 3 , dan 4 ) juga dikenal sebagai dengan α , β , dan γ karbon , masing-masing, dan terminal metil karbon dikenal sebagai ω atau n - karbon. Berbagai konvensi menggunakan Δ untuk menunjukkan nomor dan posisi ikatan ganda ( Gambar 66) , misalnya , Δ9 menunjukkan ikatan ganda antara karbon 9 dan 10 dari asam lemak; ω9 menunjukkan ikatan ganda pada karbon kesembilan

100

menghitung dari ω - karbon. Pada hewan , ikatan rangkap tambahan diperkenalkan hanya antara ikatan ganda ada (misalnya , ω9 , ω6 , atau ω3 ) dan karbon karboksil , menyebabkan tiga seri asam lemak dikenal sebagai ω9 , ω6 , dan ω3 keluarga , masing-masing.

sebagai ω9 , ω6 , dan ω3 keluarga , masing-masing. Gambar 66. Struktur hidrokorabon Asam Lemak

Gambar 66. Struktur hidrokorabon

Asam Lemak Jenuh tidak mengadung iktan rangkap

Asam lemak jenuh dapat digambarkan sebagai berdasarkan asam asetat (CH3- COOH) sebagai anggota pertama dari seri di mana -CH2- secara progresif ditambahkan dia antara t gugus CH3- termina dan gugus -COOH.

Asam Lemak Tidak Jenuh mengandung ikatan rangkap Asam lemak dapat dibagi lagi sebagai berikut: (1) tak jenuh tunggal (monoethenoid, monoenoic) asam, mengandung satu ikatan rangkap. (2) tak jenuh ganda (polyethenoid, polyenoic) asam, mengandung dua atau lebih ikatan ganda. (3) Eicosanoids: Senyawa ini, yang berasal dari eicosa-(20-karbon) asam lemak polyenoic, terdiri para prostanoids, leukotrien (LTs), dan lipoxins (LXS). Prostanoids termasuk prostaglandin (PG), prostacyclins (PGIS), dan tromboksan (TXs).

Ikatan rangkap dalam asam Lemak tidak jenuh di alam mempunyai struktur cis. Rantai karbon asam lemak jenuh membentuk sebuah zigzag ketika direntangkan pada suhu rendah. Pada suhu tinggi strukturnya memutar menyebabkan rantainya memendek yang menjelaskan mengapa biomembranes menjadi tipis dengan peningkatan suhu. Bentuk geometri dari asam lemak tidak jenuh sangat tergantung pada i orientasi atom atau gugus di sekitar sumbu ikatan ganda. Ikatan ganda tidak

101

memungkinkan rotasi. Jika gugus asil berada di sisi yang sama maka akan membentuk konfigurasi cis, seperti dalam asam oleat, jika terjadi pada di sisi berlawanan, itu adalah trans-, sebagai dalam asam elaidat, isomer trans dari asam oleat (Gambar 67) Gugus tak jenuh pada rantai asam lemak lemak alamiah hampir semua memiliki konfigurasi cis , yang menyebabkan molekulnya " bengkok " sebesar 120 derajat pada ikatan ganda. Dengan demikian , asam oleat memiliki bentuk L , sedangkan asam elaidat tetap " lurus. " Peningkatan jumlah ikatan ganda cis dalam asam lemak menyebabkan berbagai kemungkinan konfigurasi spasial dari molekul - misalnya , asam arakidonat asam , dengan empat ikatan rangkap cis , memiliki " Kinks " atau U bentuk. Hal ini memiliki makna yang mendalam pada pengemasan molekul dalam membran dan di posisi yang diduduki oleh asam lemak dalam molekul yang lebih kompleks seperti fosfolipid . Ikatan rangkap trans mengubah hubungan-hubungan spasial . Asam lemak trans yang hadir dalam makanan tertentu , timbul sebagai produk sampingan dari kejenuhan asam lemak selama hidrogenasi , atau " pengerasan , " minyak alami dalam pembuatan margarin .

pengerasan , " minyak alami dalam pembuatan margarin . Gambat 67. Struktur asam lemah tak jenuh

Gambat 67. Struktur asam lemah tak jenuh

Titik leleh dari lemak dengan atom karbon berjumlah genak asam meningkat dengan panjang rantai dan menurun dengan bertambanya jumlah ikatan tidak jenuhnya. Sebuah triasilgliserol berisi tiga jenuh asam lemak dengan masing masing mengandung 12 karbon atau lebih bersifat padat pada suhu tubuh, sedangkan jika

102

residu asam lemaknya diganti dengan 18:2, akan berwujud cair di bawah 0 ° C. Dalam prakteknya, acylglycerols alami mengandung campuran asam lemak disesuaikan dengan peran fungsional mereka. Lipid membran, yang harus fluida pada semua suhu lingkungannya, dan lebih tidak jenuh dibandingnkan dengan lipid yang berfungsi sebagai penyimpan energi. Sedangnkan lipid yang berada pada jaringan yang berfungsi harus tahan pada pendinginin , misalnya, dalam hibernators atau dalam ekstremitas hewan, lebih jenuh.

Triasilgliserol (trigliserida) berfungsi sebagai penyimpan energi dan insulasi.

Dalam sel eukariotik kebanyakan , trigliserida membentuk terpisah fase mikroskopis seperti tetesan berminyak di air sitosol , menjabat sebagai depot bahan bakar metabolik . Pada vertebrata , sel-sel khusus yang disebut adiposa, atau sel-sel lemak , menyimpan sejumlah besar trigliserida sebagai tetesan lemak yang mengisi hampir mengisi sel. trigliserida yang juga disimpan sebagai minyak dalam biji banyak jenis tanaman , menyediakan energi dan prekursor biosintesis selama perkecambahan biji. Sel adiposa dan biji yang berkecambah mengandung lipase yaitu enzim yang mengkatalisis reaksi hidrolisis trigliserida yang disimpan untuk menghasilkan asam lemak asam untuk ekspor ke lokasi di mana dibutuhkan bahan bakar .

Ada dua keuntungan yang signifikan dengan menggunakan trigliserida sebagai bahan bakar yang disimpan , daripada polisakarida seperti glikogen dan pati . Pertama , karena karbon atom asam lemak lebih mudah direduksi dibandingkan gula dan oksidasi trigliserida menghasilkan energi dari dua kali lebih banyak energi (gram per gram) daripada oksidasi karbohidrat . Kedua , karena trigliserida adalah hidrofobik sehingga selalu berada dalam bentuk bebas air dengan demikian organisme yang membawa lemak sebagai bahan bakar tidak harus membawa beban ekstra air hidrasi yang berhubungan dengan polisakarida yang tersimpan . Manusia memiliki jaringan lemak ( terutama terdiri dari adipocytes ) di bawah kulit , di dalam rongga perut , dan dalam kelenjar susu. Orang cukup gemuk dengan 15 sampai 20 kg dari trigliserida disimpan dalam sel lemak mereka bisa memenuhi kebutuhan energi mereka selama berbulan-bulan. Sebaliknya, tubuh manusia dapat menyimpan kurang dari pasokan energi sehari dalam bentuk glikogen . karbohidrat seperti glukosa dan

103

glikogen melakukan penawaran tertentu keuntungan sebagai sumber energi yang cepat metabolisme , salah satunya karena kelarutannya sehingga glikogen lebih siap pakai.

Struktur lipid di dalam membran

glikogen lebih siap pakai. Struktur lipid di dalam membran Gambar 68. Struktura lipid bilayer Fitur arsitektur

Gambar 68. Struktura lipid bilayer

Fitur arsitektur pusat membran biologis adalah lapisan ganda lipid *gambar 68), yang bertindak sebagai penghalang terhadap bagian dari molekul polar dan ion. Lipid bersifat amphipathic: salah satu ujung molekul adalah hidrofobik, dan ujung lainnya hidrofilik. Bagian-bagian hidrofobik mereka berinteraksi satu sama lain dan bagian hidrofiliknya berinteraksi dengan air dan mengarahkan nya menjadi lembaran disebut membran bilayers. Terdapat lima jenis lipid yang umum ditemukan di mambran yaitu: gliserofosfolipid, di mana daerah hidrofobik terdiri dari dua asam lemak bergabung dengan gliserol; galactolipids dan sulfolipids, yang juga mengandung dua asam lemak yang untuk gliserol, tetapi tidak memiliki fosfat karakteristik fosfolipid; lipid tetraether archaebacterial, di mana dua rantai alkil sangat panjang eter terkait dengan gliserol pada kedua berakhir, sphingolipids, di mana asam lemak tunggal bergabung ke amina lemak, sphingosine, dan sterol, senyawa mencirikan rigiditas dari cincin

1.

Gliserofosfolipid Gliserofosfolipid , juga disebut phosphoglycerida , adalah membran lipid di mana dua asam lemak terikat dalam bentuk ester pada atom karbon pertama dan kedua dari gliserol , dan satu gugus yang sangat sangat polar terikat

104

melalui ikatan fosfodiester pada karbon ketiga. Gliserol adalah prokiral , ia tidak memiliki karbon asimetris , namun tambahan gugus fosfat di salah satu ujung mengubahnya menjadi senyawa kiral ,dengan nama L - gliserol 3 - fosfat , D - 1 - gliserol fosfat , atau snglycerol 3 -fosfat. Gliserofosfolipid diberi nama sebagai turunan dari senyawa induk , asam fosfatidat phosphatidic (Gambar 69) , sesuai dengan gugus alkohol polar yang terikat. Fosfatidilkolin dan fosofatidiletanolamine memiliki kolin dan etanolamin dalam yang bersifat polar Dalam semua senyawa ini , gugus gugus tersebut terikat pada gliserol melalui sebuah ikatan fosfodiester, di mana gugus fosfat polar bermuatan negatif pada pH netral . Alkohol polar mungkin bermuatan negatif (seperti dalam phosphatidylinositol 4,5- bifosfat ) , netral (fosfatidilserin ) , atau positif ( fosfatidilkolin , phosphatidylethanolamine ) . Senyawa-senyawa ini memiliki sumbangan yang sangat besar terhadap sifat permukaan membran (gambar 70)

sumbangan yang sangat besar terhadap sifat permukaan membran (gambar 70) Gambar 69. Struktur umum glicerofosfolipid 105

Gambar 69. Struktur umum glicerofosfolipid

105

Gambar 70. Gugus X pada Gliserofosfolipid Gliserofosfolipid yang umum adalah diacylglycerols yang mengikat gugus-gugus

Gambar 70. Gugus X pada Gliserofosfolipid

Gliserofosfolipid yang umum adalah diacylglycerols yang mengikat gugus-gugus pada alkohol melalui ikatan fosfodiester. Asam phosphatidic, phosphomonoester adalah senyawa induk. Setiap derivat dibei nama sesuai gugus X yang terikat pada alcohol (X), dengan awalan "fosfatidil-." D (Gambar 70).

2. Galactolipid dan sulfolipid

Kelompok kedua membran lipid adalah lipid yang mendominasi membran sel tanaman yaitu galactolipids, di mana satu atau dua residu galaktosa dihubungkan oleh ikatan glikosidik dengan atom C ke 3 dari 1,2-diasilgliserol (Gambar71). Galactolipids yang terlokalisasi di membran tilakoid (membran internal) kloroplas; yang meliputi 70% - 80% dari jumlah membrane lipid dari tanaman. Jenis membran lipid ini yang paling melimpah dalam biosfer.

106

Gambar 71. Galakto lipid Membran tanaman juga mengandung sulfolipid, dimana residu glukosa tersulfonasi bergabung dengan
Gambar 71. Galakto lipid Membran tanaman juga mengandung sulfolipid, dimana residu glukosa tersulfonasi bergabung dengan

Gambar 71. Galakto lipid

Membran tanaman juga mengandung sulfolipid, dimana residu glukosa tersulfonasi bergabung dengan sebuah diasilgliserol melalui ikatan glikosidik. Dalam sulfolipids, sulfonat memberikan muatan negatif tetap seperti itu dari kelompok fosfat dalam fosfolipid

3. archaebacterial lipid tetraeter Archaebacteria , yang sebagian besar tinggal di kondisi ekologi yang ekstrim (air mendidih , pH rendah , kekuatan ion tinggi),memiliki membran lipid yang mengandung hidrokarbon rantai panjang ( 32 karbon ) bercabang terikat pada gliserol (Gambar 72) melalui ikatan eter , yang jauh lebih stabil terhadap hidrolisis pada pH rendah dan suhu tinggi daripada ikatan ester yang ditemukan dalam lipid dari Eubacteria dan eukariota . Lipid adalah archaebacterial rata rata dua kali panjang dari fosfolipid dan sphingolipids dan terentang lebih lebar pada permukaan membran. Pada setiap akhir dari molekul diperpanjang dengan kepala polar yang terdiri dari gliserol yang mengikat fosfat atau residu gula. Nama umum untuk senyawa ini , gliserol

107

dialkyl tetraethers gliserol ( GDGTs ) , mencerminkan mereka yang unik struktur . Gliserol bagian dari archaebacterial tidak stereoisomer yang sama seperti yang di lipid dari Eubacteria dan eukariota , karbon pusat memiliki konfiguras R dalam archaebacteria sedangkan pada kingdom lainnya memiliki konfigurasi S.

sedangkan pada kingdom lainnya memiliki konfigurasi S. Gambar 72. Struktur lipid pada Archaea 4. sphingolipid

Gambar 72. Struktur lipid pada Archaea

4. sphingolipid Ketika sphingolipids oleh dokter-ahli kimia Johann Thudichum, peran biologisnya masih misteriusn seperti Spinx. Pada manusia, setidaknya 60 yang sphingolipid yang berbeda telah diidentifikasi pada membrane sel dan sangat banyak dijumpai dalam plasma plasam membran dari neuron, dan beberapa sangat jelas ditemukan pada permukaan sel, tetapi hanya beberapa yang diketahu fungsinya. sejauh ini. Gugus karbohidrat sphingolipids tertentu menentukan golongan darah manusia. Gangliosida terkonsentrasi di permukaan luar sel, di mana mereka bermanfaat sebagai pengenal molekul ekstraseluler atau permukaan sel tetangga. Jenis dan jumlah gangliosides dalam plasma membran berubah secara dramatis selama perkembangan embrio.

108

Gambar 73. glicosphingolipid Gambar 73 adalah glicosphingolipid sebagai penentu darah kelompok. Kelompok darah manusia (O,

Gambar 73. glicosphingolipid

Gambar 73 adalah glicosphingolipid sebagai penentu darah kelompok. Kelompok darah manusia (O, A, B) ditentukan sebagian oleh gugus oligosakarida (biru) dari glycosphingolipids ini. Tiga oligosakarida yang sama juga ditemukan menempel pada protein darah tertentu individu jenis darah O, A, dan B, masing-masing. (FUC mewakili fucose gula.) 5. Sterol Sterol adalah lipid struktural yang dijumpai dalam membrane sel eukariotik yang paling. Kelompok kelima membran lipid adalah steroid. Ciri khusus karakteristik kelompok lipid yang kelima yang dijumpai di membrane adalah adanya inti steroid , yang terdiri dari empat cincin yang menyatu , tiga dengan enam karbon dan satu dengan lima (Gambar 74 ) . Inti steroid hampir planar dan relatif kaku; cincin yang menyatu tidak memungkinkan rotasi ikatan COC . Kolesterol yaitu sterol utama

109

dalam jaringan hewan , bersifat amphipathic , dengan gugus polar ( gugus hidroksil pada C - 3 dan hidrokarbon nonpolar ( inti steroid serta hidrokarbon rantai samping pada C - 17 ). Sterol yang mirip pada eukariota ditemukan pada tanaman misalnya stigmasterol dan ergosterol dalam jamur. Bakteri tidak dapat mensintesis sterol , sebuah spesies bakteri akan tetapi beberapa mampu menggabungkan sterol eksogen ke dalam membran mereka. Sterol dari semua eukariota disintesis dari lima carbon sederhana yaitu isoprena , Selain peran mereka sebagai konstituen membran , sterol berfungsi sebagai prekursor untuk berbagai produk dengan aktivitas biologis tertentu. Hormon steroid , miisalnya,berfungsi sebagai sinyal biologis ampuh yang mengatur ekspresi gen. Asam empedu adalah turunan kolesterol polar yang bertindak sebagai deterjen/surfaktan dalam usus , pengemulsi lemak makanan untuk membuat mereka lebih mudah diakses oleh lipase.

dalam usus , pengemulsi lemak makanan untuk membuat mereka lebih mudah diakses oleh lipase. Gambar 74.

Gambar 74. Kolesterol

110

BAB V

MEMBRAN BIOLOGI DAN TRANSPORT

Membran menentukan batas-batas eksternal sel dan mengatur lalu lintas

molekul di perbatasan sel yan, dalam sel eukariotik , mereka membagi ruang internal

dalam sel menjadi kompartemen diskrit untuk memisahkan proses dan komponen .

Membran (Gambar 75) mengatur urutan reaksi kompleks dan sentral untuk

konservasi energi biologi dan komunikasi antar

sel. Aktifitas biologis membran disebabkan

karena sifat fisiknya yang luar biasa. Membrane

bersifat leksibiltas self-sealing, dan selektif

Membrane bersifat leksibiltas self-sealing, dan selektif Gambar 75. Foto mikroskop elektron dari membran permeabel

Gambar 75. Foto mikroskop elektron dari membran

permeabel terhadap zat terlarut polar .

fleksibilitasnya memungkinkan perubahan

bentuk yang menyertai pertumbuhan dan

pergerakan sel (seperti gerakan amoeboid).

Dengan kemampuannya untuk memecah diri dan

menyusun kembali, dua membran dapat menyatu, seperti dalam eksositosis , atau

membran penutup kompartemen dapat menjalani pemisahan/fisi untuk menghasilkan

dua kompartemen, seperti dalam endositosis atau pembelahan sel, tanpa menciptakan

kebocoran pada permukaan seluler, karena membran selektif permeabel , mereka

mempertahankan senyawa dan ion tertentu dalam sel dan dalam kompartemen

seuluer tertentu.

Membran bukan pemisah hanya pasif. Pada membrane terdapat sejumlah

protein khusus yang mengijinkan berbagai prose atau reaksi katalisis dari berbagai

proses seluler. Pada permukaan sel, transporter memindahkan larutan organik

tertentu dan ion anorganik melintasi membran, reseptor sinyal ekstraseluler dan

perubahan molekul-molekul yang memicu proses dalam sel; dan adhesi molekul

menyebabkan interkasi sel bersama-sama sel tetangganya. Dalam sel, membran

mengatur proses seluler seperti sintesis lipid dan protein tertentu, dan transduksi

energi dalam mitokondria dan kloroplas. Karena membran terdiri dari hanya dua

lapisan molekul, mereka sangat tipis (ditinjau dari 2 dimensi).

111

Arsitektur membran.

Analisis kimia dari membran yang diisolasi dari berbagai sumber mengungkapkan sifat umum tertentu. Masing-masing kerajaan, masing-masing spesies, masing-masing jaringan atau sel jenis, dan organel dari setiap jenis sel memiliki karakteristi yang berbeda pada membrane lipidnya. Membran plasma, misalnya, diperkaya kolesterol dan tidak mengandung terdeteksi cardiolipin, dalam membran mitokondria dari hepatosit, distribusi ini dibalik: kolesterol yang sangat rendah dan cardiolipin tinggi. cardiolipin sangat penting untuk fungsi protein tertentu dalam membran mitokondria. Sel secara jelas memiliki mekanisme untuk mengontrol jenis dan jumlah membrane lipidnya serta mensintesis dan menargetkan lipid khusus untuk organel tertentu. Dalam banyak kasus, kita bisa menduga yang keuntungan adaptif kombinasi yang berbeda dari membrane lipid, dalam kasus lain, makna fungsional kombinasi ini adalah sebagai belum diketahui akan tetapi dapat diduga menunjukkan spesialisasi fungsi. Membran sangat kedap terhadap molekul polar atau zat terlarut poar, tetapi permeabel terhadap senyawa nonpolar ; mereka mempunyai ketebalan sekitar 5 sampai 8 nm ( 50 sampai 80 Å ) ketika dilihat sebagai penampang dengan mikroskop electron. Gabungan bukti dari mikroskop electron dan studi komposisi kimia, serta hasil studi permeabilitas dan gerakan protein dan molekul lipid dalam membran, menghasilkan suatu model membrane biologis yang dkenal model mosaik cair untuk menggambarkan struktur membran biologis (Gambar 76). Fosfolipid membentuk bilayer di mana daerah nonpolar dari molekul lipid dalam menghadapi setiap lapisan inti lapisan ganda dan kelompok kepala kutub mereka menghadap ke luar, berinteraksi dengan fase berair di kedua sisi. Protein yang tertanam dalam lembaran bilayer, berinteraksi secara hidrofobik antara membran lipid dan domain hidrofobik dalam protein. Beberapa protein menonjol hanya satu sisi membran , sedang yang lainnya memiliki domain yang menonjol pada kedua sisi membran . Orientasi protein dalam bilayer asimetris, memberikan mengarah pada satu sisi membran: domain protein mengarah pada salah satu sisi bilayer berbeda dari mereka yang menonjol pada sisi lain. Hal ini mencerminkan fungsional yang asimetri pula. Lipid dan protein membran membentuk mosaik cair dengan pola bebas untuk berubah terus- menerus. Mosaik membran cairan disebabkan karena adanya interaksi non-kovalen

112

antara komponennya yang mengijinkan . moleukul lipid dan molekul protein bebas bergerak secara lateral pada bidang membran

protein bebas bergerak secara lateral pada bidang membran Gambar 76. Model mosaic dari membran. Protein yang

Gambar 76. Model mosaic dari membran. Protein yang terdapat pada membran digolongkan manjadi 2 jenis yaitu protein integral dan protein periferal.

1. Protein integral

Protein integral (gambar 77) terasosiasi pada membrane melalui interaksi hidrofobik antara domain hidrofobik dari protein dengan bagian hidrofobik dari lipid bilayer. Kebanyakan protein membran merupakan protein integral yang berinteraksi secara ekstensif dengan fosfolipid dan membutuhkan penggunaan deterjen untuk solubilisasi mereka. Protein integral biasanya globular dan diri mereka amphipathic yang memiliki satu atau dua ujung hidrofilik dipisahkan oleh hidrofobik. Bagian hidrofobik tersebut yang mampu melokalisasikan dirinya pada inti membran bilayer yang bersifat hidrofobik.

113

Gambar 77. Contoh protein membran 2. Protein periferal Protein periferal berasosiasi dengan membran melalui interaksi
Gambar 77. Contoh protein membran 2. Protein periferal Protein periferal berasosiasi dengan membran melalui interaksi

Gambar 77. Contoh protein membran

2. Protein periferal Protein periferal berasosiasi dengan membran melalui interaksi elektrostatik dan ikatan hidrogen dengan domain hidrofilik protein integral atau dengan gugus hidrofilik dari membran lipid. Protein periferal dapat dilepaskan dengan mudah dengan mengganggu interaksi elektrostatik atau hidrogen. Reagen yang umum digunakan untuk melepaskan protein periferal antara lain adalah karbonat pada pH yang tinggi atau penambahan garam. Protein periferal umumnya berfungsi sebagai regulator enzim yang terikat membran atau untuk membatasi mobilitas protein integral tehadap tarikan intraseluler.

114

B. Transport Molekul Melalui Membran Setiap sel hidup memperoleh bahan baku untuk biosintesis dan produksi energy dari lingkungannya, dan harus melepaskan produk sampingan metabolism ke lingkungan. Senyawa nonpolar beberapa dapat larut dalam lapisan ganda lipid dan menyeberangi membran tanpa bantuan, tetapi senyawa polar atau bermuatan atau ion tidak dapat menyeberangi membran secara bebas. Protein membran sangat penting untuk mobilitatas molekul molekul polar dalam menyeberangi transmembran. Dalam beberapa kasus protein membran hanya memfasilitasi difusi zat terlarut mengikuti gradient konsentrasi yang menurun, tapi transportasi sering terjadi terhadap gradien konsentrasi, muatan listrik, atau keduanya yang meningkat. Dalam hal zat terlarut harus "dipompa" melalui suatu proses yang membutuhkan energi (Gambar 78). Energi mungkin berasal langsung dari hidrolisis ATP atau mungkin diberikan dalam bentuk gerakan zat terlarut lain yang mengikuti gradien elektrokimia menurun dengan energi yang cukup untuk membawa zat melawan gradien nya. Ion juga dapat bergerak melintasi membran melalui saluran ion yang dibentuk oleh protein, atau mereka mungkin dilakukan oleh seluruh ionofor, molekul kecil yang menutupi muatan ion dan memungkinkan mereka untuk menembusmelalui lapisan lipid ganda. Dengan sangat sedikit pengecualian, lalu lintas molekul kecil melintasi membran plasma dimediasi oleh protein seperti saluran transmembran,operator, atau pompa. Dalam sel eukariotik, kompartemen yang berbeda memiliki konsentrasi intermediet metabolisme dan produk dan ion yang berbeda, dan ini juga harus bergerak melintasi membran intraseluler yangdi diatur secara ketat dan semua prosesnya dimediasi oleh proses protein.

115

Gambar 78. Jenis jenis transport pada membran Transport Pasif Ketika dua kompartemen berair yang mengandung

Gambar 78. Jenis jenis transport pada membran

Transport Pasif Ketika dua kompartemen berair yang mengandung konsentrasi zat larut atau ion yang tidak sama dan dipisahkan oleh pembagi permeable (membran), zat terlarut akan bergerak dengan difusi sederhana dari daerah dengan konsentrasi yang lebih tinggi melalui membran, ke daerah dengan konsentrasi yang lebih rendah, sampai kedua kompartemen memiliki konsentrasi zat terlarut yang sama. Ketika ion muatan yang berlawanan dipisahkan oleh sebuah membran permeabel, ada gradien listrik transmembran dengan membran potensial, Vm (dinyatakan dalam volt atau milivolt). Pootensial membran tersebut menghasilkan gaya melawan gerakan ion yang meningkatkan Vm yang pada akhirnya menggerakan ion dan berkahir mengurangi Vm. Dengan demikian arah perpindahan zat terlarut cenderung bergerak secara

116

spontan melintasi membran tergantung pada kedua gradien kimia (perbedaan dalam konsentrasi zat terlarut) dan gradien listrik (Vm) melintasi membran. Kedua faktor yang disebut sebagai elektrokimia gradien atau potensial elektrokimia. Perilaku zat terlarut tersebut sesuai dengan Hukum kedua termodinamika: molekul cenderung spontan mencapai distribusi secara random dengan tingkat energi terendah. Untuk melewati lipid bilayer , senyawa polar terlarut harus terlebih dahulu melepaskan interaksinya dengan molekul air dalam bentuk hidrasi , terdifusi pada jarak sekitar sekitar 3 nm ( 30 Å ) melalui pelarut pelarut ( lipid ) yang bersifat dangat tidak larut dalam air. Energi dibutuhkan untuk melepaskan diri dari hidrasi dan untuk memindahkan senyawa polar dari air ke dalam dan melalui lipid kembali sebagai senyawa terhidrasi di sisi lain dari membran. Tahap peralihan transmembran mirip dengan besarnya energi untuk mencapai keadaan transisi dalam reaksi kimia enzimatik. Dalam kedua kasus , sebuah energi penghalang aktivasi harus diatasi mencapai tahap transisi Energi aktivasi untuk translokasi zat terlarut membran bilayer begitu besar dan lipid bilayer murni hampir kedap untuk senyawa polar dan bermuatan. Membran protein menurunkan energi aktivasi pada transportasi senyawa polar dan ion dengan menyediakan jalur alternatif melalui bilayer untuk zat terlarut tertentu. Protein memfasilitasi proses difusi, atau dikenal dengan transpor pasif. Dalam hal ini " substrat " dipindahkan dari satu kompartemen tanpa ada perubahan kimiawi. Protein membrane yang dapat memindahkan substrat secara cepat melintasi membran memalui proses difusi disebut transporter atau permease. Ada dua kategori transporter: pembawa (carrier) dan saluran (Channel). Transporter mengikat substrat stereospesifisitas yang tinggi, mengkatalisasi transportasi dengan energi di bawah batas difusi bebas, dan dapat jenuh seperti halnya Enzim-Substrat:

sehingga peningktan konsentrasi substrat pada suatu saat tidak diikuti dengan kenaikan aktivitas transport yang lebih tinggi. Sistim saluran umumnya memungkinkan perpindahan molekul melalui transmembran pada tingkat konsentrasi lebih besar daripada yang sistem pembawa bahkan mencapai tingkat difusi tanpa hambatan.

117

Transport Aktif

Dalam transpor pasif, zat selalu berpindah ke arah gradien elektrokimia yang menurun dan zat terlarut tidak terakumulasi di atas konsentrasi kesetimbangan. Transport aktif, sebaliknya, dapat menghasilkan akumulasi dari zat terlarut sampai di atas titik kesetimbangan. Transpor aktif secara termodinamika tidak menguntungkan (endergonik) dan mengambil menempatkan hanya ketika digabungkan (langsung atau tidak langsung) dan terjadi hanya jika digabung dengan proses eksergonik seperti penyerapan sinar matahari, reaksi oksidasi, pemecahan ATP, atau terjadi bersamaan dengan aliran beberapa zat terlarut kimia lainnya ke arah gradien elektrokimia yang menurun. Dalam transpor aktif yang bersifat primer, akumulasi zat terlarut digabungkan langsung dengan reaksi kimia eksergonik, seperti konversi ATP menjadi ADP adn Pi. Transpor aktif sekunder terjadi ketika transport yang endergonik melawan gradien zat terlarut digabungkan dengan transport eksergonik ke arah gradient zat yang konsentrasinyanya menurun.

118

BAB VI BIOENERGITIKA DAN METABOLISME

Bioenergetika, atau termodinamika biokimia, adalah studi tentang perubahan energi yang menyertai reaksi biokimia reaksi. Sistem biologis pada dasarnya isotermik dan menggunakan energi kimia untuk proses hidup. Bagaimana binatang memperoleh bahan bakar yang sesuai dari makanan untuk menyediakan energi ini adalah dasar bagi pemahaman tentang nutrisi dan metabolisme. Kematian karena kelaparan terjadi ketika cadangan energi yang tersedia habis, dan malnutrisi yang berhubungan dengan ketidakseimbangan energi (marasmus). Hormon tiroid mengontrol laju pelepasan energi (tingkat metabolisme), dan dapat menyebabkan penyakit apabila tiroid tidak berfungsi. Penyimpanan kelebihan energi penyebab obesitas, salah satu penyakit yang paling umum di masyarakat Barat dan mulai banyak ditemukan di negara berkembang seperti di Indonesia. Proses penting seperti reaksi sintesis , kontraksi otot , konduksi impuls saraf , dan transport aktif membutuhkan energi ( endorgenik) dan memperoleh energinya dengan menghubungkan proses dengan reaksi kimia, atau kopling dengan reaksi oksidatif yangmenghasilkan energi (eksergonik). Dalam sistem hidup, proses endergonik tidak bisa terjadi secara independen tetapi harus digabung dengan proses eksergonik dengan perubahan energi secara total harus bersifat eksergonik . Reaksi eksergonik didapatkan pada proses defradasi biomolekul yang disebut katabolisme , sedangkan reaksi sintesis biomolekul yang disebut anabolisme bersifat endorgenik. Gabungan proses katabolik dan anabolik merupakan metabolisme . Metabolisme adalah aktivitas selular yang sangat terkoordinasi di mana banyak sistem multienzim (jalur metabolik) bekerja sama untuk (1) memperoleh energi kimia dengan menangkap energi matahari atau menguraian nutrisi yang kaya energy dari lingkungan, (2) mengubah molekul nutrisi menjadi molekul yang dieprulakan secara spesifik oleh sel itu sendiri , termasuk prekursor makromolekul, (3) polimerisasi prekursor monomer ke dalam makromolekul: protein, asam nukleat, dan polisakarida, serta (4) mensintesis dan mendegradasi biomolekul yang diperlukan untuk fungsi sel yang khusus, seperti lipid membran, pembawa pesan intraseluler, dan pigmen.

119

Semua organisme hidup membutuhkan sumber nitrogen, yang diperlukan untuk sintesis asam amino, nukleotida, dan senyawa lainnya.Tanaman umumnya dapat menggunakan salah amonia atau nitrat sebagai satu-satunya sumber nitrogen, tapi vertebrata harus memperoleh nitrogen dalam bentuk asam amino atau senyawa organik lainnya.Hanya beberapa organisme-spesies cyanobacteria dan banyak bakteri tanah yang hidup bersimbiosis pada akar beberapa tanaman-mampu mengkonversi ("memperbaiki") nitrogen atmosfer (N 2 ) menjadi amonia. Bakteri lain (bakteri nitrifikasi) mengoksidasi amonia menjadi nitrit dan nitrat, namun organismen mengkonversi nitrat ke N 2 . Dengan demikian, di samping siklus karbon global dan siklus oksigen, siklus nitrogen beroperasi di biosfer. Siklus karbon, oksigen, dan nitrogen, yang semuanya melibatkan semua spesies, sangat tergantung pada keseimbangan antara kegiatan produsen (autotrof) dan konsumen (heterotrof) dalam biosfer kita.

Siklus materi didorong oleh aliran energy dalam jumlah besar ke dalam dan melalui biosfer, dimulai dengan penangkapan energi matahari oleh organisme fotosintesis dan penggunaan energi ini untuk menghasilkan karbohidrat yang kaya energi dan nutrisi organik lainnya. Nutrisi ini kemudian digunakan sebagai sumber energi oleh organisme heterotrofik. Dalam proses metabolism dan dalam semua transformasi energi, ada proses yang kehilangan energi yang berguna (energi bebas) dan peningkatan jumlah energi tidak dapat digunakan yang tidak dapat dihindari (panas dan entropi). Tidak seperti siklus materi, energi mengalir satu arah melalui biosfer, organisme tidak dapat meregenerasi energi yang telah digunakan dan energi hilang sebagai panas dan entropi. Karbon, oksigen, dan nitrogen didaur ulang secara terus menerus, tetapi energi selalu berubah menjadi bentuk yang tidak dapat digunakan seperti panas.

menjadi bentuk yang tidak dapat digunakan seperti panas. A. Peran ATP Dalam sel hidup, senyawa antara

A. Peran ATP

Dalam sel hidup, senyawa antara atau pembawa energi tinggi utama adalah adenosine trifosfat (ATP) (gambar 79). Dalam semua organisme, ATP memainkan peran sentral dalam transfer energi

Gambar 79. Struktur nukleotida

bebas dari proses ke endergonik proses. ATP adalah

120

sebuah nukleotida trifosfat yang mengandung adenin, ribosa, dan tiga gugus fosfat. Dalam reaksi dalam sel, Mg 2+ berfungsi sebagai ion pengomplek (Gambar X). Pentingnya fosfat dalam metabolisme perantara menjadi jelas dengan ditemukannya peran ATP, adenosin difosfat (ADP), dan anorganik fosfat (Pi) dalam glikolisis. Simbol ~P menunjukkan bahwa gugus terikat dan di transfer ke akseptor yang tepat, menghasilkan sejumlah besar energi bebas. Jadi, ATP mengandung ikatan berenergi tinggi. ATP mengandung dua gugus fosfat berenergi tinggi dan ADP (adenosin difosfat mengandung satu ikatan fosfat berenergi tinggi, sedangkan fosfat di AMP (adenosin monofosfat) adalah dari jenis-energi rendah, karena ikatannya merupakan ikatan ester biasa.

ATP dapat bertindak sebagai donor fosfat berenergi tinggi untuk membentuk senyawa-senyawa di bawah ATP pada Tabel 6.1. Demikian juga , dengan enzim yang diperlukan, ADP dapat menerima fosfat berenergi tinggi untuk membentuk ATP dari senyawa di atas ATP dalam tabel . Akibatnya, iuklus ATP/ADP menghubungkan proses-proses yang menghasilkan ~P denganproses-proses yang memanfaatkan ~ P , secara terus menerus terjadi konsumsi ATP dan regenerasi ATP . Hal ini harus terjadi sangat cepat, dimana jumlah total ATP/ADPsangat kecil dan cukup untuk mempertahankan jaringan tetap aktif hanya beberapa detik.

Tabel 6.1.Energi bebas dari beberap molekul penting

untuk mempertahankan jaringan tetap aktif hanya beberapa detik. Tabel 6.1.Energi bebas dari beberap molekul penting 121

121

Ada tiga sumber utama ~P mengambil bagian dalam konservasi energi atau menangkap energi :

(1) Fosforilasi oksidatif: Merupakan proses yang menyumbangkan ~P dalam organisme aerobik. Energi bebas berasal dari oksidasi rantai pernapasan menggunakan molekul O2 dalam mitokondria.

(2) Glikolisis : proses ini menghasilkan dua ~P dari konversi molekul glukosa menjadi laktat. Fospat berenergi tinggi dihasilkan melalui dua tahap reaksi dalam glikolisis yang dikatalisasi oleh phosphoglycerate kinase dan piruvat kinase

(3) siklus asam sitrat : Satu ~ P dihasilkan langsung dalam siklus asam sittar pada tahap yang dikatalisisi oleh suksinil thiokinase.

Phosphagens juga dapat bertindak sebagai bentuk penyimpanan energi tinggi fosfat. Diantaranya adalah creatine fosfat terjadi di vertebrata otot rangka , jantung, spermatozoa , dan otak, dan arginin fosfat terjadi pada otot invertebrata. Ketika ATP dengan cepat dimanfaatkan sebagai sumber energi untuk kontraksi otot , phosphagens mengizinkan konsentrasinya untuk dipertahankan rendah, tetapi ketika ATP / ADP rasio yang tinggi , konsentrasi mereka dapat meningkatkan untuk bertindak sebagai penyimpan fosfat berenergi tinggi.

Enzim

adenylil

kinase

memperbolehkan

interkonversi

senyawa-senyawa

nukleotda adenin untuk memenuhi kebutuhan ATP dan ADP.

nukleotda adenin untuk memenuhi kebutuhan ATP dan ADP. Hal ini memungkinkan hal berikut terjadi 1. Fosfat

Hal ini memungkinkan hal berikut terjadi

1. Fosfat berenergi tinggi dalam ADP untuk digunakan dalam sintesis ATP.

2. AMP dibentuk sebagai konsekuensi dari beberapa mengaktifkan reaksi yang melibatkan ATP, untuk dipulihkan oleh rephosphorylation ke ADP.

122

(3) AMP dapat digunakan untuk meningkatkan konsentrasi ketika ATP menjadi habis dan bertindak sebagai sinyal metabolik (alosterik) untuk meningkatkan laju reaksi katabolik, yang pada gilirannya menyebabkan generasi lebih ATP.

Ketika AMP dibentuk dari ATP PPi dihasilkan sebagai hasil samping, misalnya dalam reaksi berikut:

sebagai hasil samping, misalnya dalam reaksi berikut: Reaksi ini disertai dengan hilangnya energi bebas sebagai

Reaksi ini disertai dengan hilangnya energi bebas sebagai panas, yang menjamin bahwa reaksi aktivasi akan terjadi ke kanan, dan selanjutnya melalui aktifitas hidrolisa PPi yang dikatalisis oleh pyrophosphatase anorganik PPi diubah menjadi Pi. Energi bebsa yang dihasilkan dari reaksi tersebut (ΔG0') dalah -27,6 kJ / mol.Aktivasi melalui jalur pirofosfat mengakibatkan hilangnya dua ~P tidak satu ~P sebagaimana yang terjadi ketika ADP dan Pi terbentuk. Kombinasi reaksi di atas memungkinkan fosfat untuk didaur ulang dan nukleotida adenin untuk saling dipertukarkan. Melalui aktifitas nuklosida difosfat kinase memungkinakna UTP,UGP dan CTP disintesis dari reaksi antara ATP sebagai sumber fosfat dengan bentuk difosfat dari masing-masing nukleosida.

B. Oksidasi Biologi

Dalam ilmu kimia, oksidasi didefinisikan sebagai penghilangan elektron dan reduksi sebagai penambahan elektron. Sehingga oksidasi selalu disertai dengan reduksi dari akseptor elektron. Prinsip oksidasi-reduksi berlaku sama untuk sistem biokimia dan merupakan konsep yang sangat penting yang mendasari sifat oksidasi biologis. Banyak oksidasi biologis dapat berlangsung tanpa partisipasi dari molekul oksigen , misalnya proses dehydrogenation. Kehidupan hewan tingkat tinggi benar- benar tergantung pada pasokan oksigen untuk respirasi , proses dimana sel memperoleh energi dalam bentuk ATP dari reaksi antara hidrogen dengan oksigen untuk membentuk air. Selain itu, molekul oksigen terinkorporasi ke berbagai substrat

123

oleh enzim ditunjuk sebagai oxygenases. Banyak obat , polutan, karsinogen ( xenobiotik ) dimetabolisme oleh enzim dari kelompok oksigenasetersebut yang dikenal sebagai sistem sitokrom P450 . Pemberian oksigen dapat menyelamatkan nyawa dalam pengobatan pasien dengan pernapasan atau sirkulasi kegagalan. Dalam reaksi yang melibatkan oksidasi dan reduksi, perubahan energi bebas sebanding dengan kecenderungan reaktan untuk menyumbangkan atau menerima elektron. Dengan demikian, selain mengekspresikan perubahan energi bebas (ΔG0'), dengan cara yang sama reaksi juga mengungkapkannya secara numerik sebagai oksidasi-reduksi atau potensial redoks (E' 0 ). Potensial redoks dari suatu sistem (E 0 ) biasanya dibandingkan dengan potensi elektroda hydrogen (0,0 volt pada pH 0,0). Namun, untuk sistem biologis, potensial redoks (E'0) biasanya dinyatakan pada pH 7,0, di mana pH potensial elektroda dari elektroda hidrogen -0.42 volt. Potensi redoks dari beberapa sistem biokimia pada mamalia ditunjukkan pada Tabel 6.2. Posisi relative sistem redoks dalam tabel memungkinkan prediksi arah aliran elektron dari satu pasangan redoks yang lain.

Tabel 6.2 Beberapa potesial reduski standard dari beberapa molekl penting

potesial reduski standard dari beberapa molekl penting Enzim yang terlibat dalam oksidasi dan reduksi disebut

Enzim yang terlibat dalam oksidasi dan reduksi disebut oxidoreductases dan diklasifikasikan ke dalam empat kelompok: oksidase, dehidrogenase, hydroperoxidases, dan oksigenase.

124

1.

Oksidase Oksidase mengkatalisis pemindahan hidrogen dari substrat

menggunakan oksigen sebagai akseptor hydrogen menhasilkan air atau hidrogen peroksida sebagai produk reaksi. Contoh enzim golongan ini adalah

a.

Sitokrom c oksidase Sitokrom oksidase adalah hemoprotein yang terdistribusi secara luas di banyak jaringan, memiliki khas heme sebagai gugus prostetik seperti yang didapatkan pada mioglobin, hemoglobin, dan sitokrom lainnya. Sitokrom c adalah komponen terminal dari rantai pernapasan yang ditemukan dalam mitokondria dan malakukukan transfer elektron yang dihasilkan dari oksidasi molekul substrat oleh dehidrogenase ke akseptor elektrin terakhir mereka yaitu oksigen. Enzim ini bisa diinhibisi oleh karbon monoksida, sianida, dan hidrogen. Lebih jauh anzim ini memliliki dua molekul heme(Gambar 80), masing-masing memiliki satu atom Fe yang berosilasi antara Fe 3+ dan Fe 2+ selama oksidasi dan reduksi. Di samping itu enzim ini juga mempunya dua atom Cu yang hadir, masing- masing berasosiasi dengan unit heme.

Cu yang hadir, masing- masing berasosiasi dengan unit heme. Gambar 80. Struktur Heme Contoh oksidase lainnya

Gambar 80. Struktur Heme

Contoh oksidase lainnya adalah flavoprotein. Enzim flavoprotein mengandung flavin mononukleotida (FMN) atau flavin adenin dinukleotida (FAD) sebagai gugus prostetik kelompok. FMN dan FAD terbentuk dalam tubuh dari vitamin riboflavin. FMN dan FAD biasanya terikast kuat pada protein tetepi tidak terikat secara

125

kovalen. Metalloflavoproteins mengandung satu atau lebih logam sebagai kofaktor penting. Contoh enzim ini adalah L-amino oksidase, xantin oksidase dan aldehid dehidrogenase.

b.

Dehidrogenase

Ada sejumlah besar enzim di kelas ini yang berfungsi melakukan 2 fungsi

utama :

(1) transfer hidrogen dari satu substratke substrat yang lain dalam reaksi oksidasi-reduksi (Gambar 81). Dehydrogenase sangat spesifik terhadap substrat substrat tapi sering memanfaatkan koenzim umum atau hidrogen operator, misalnya, NAD + . Karena reaksinya reversible, maksa memungkinkan ekivalen pereduksi ini ditransfer secara bebas dalam sel. Jenis reaksi ini memungkinkan substrat dioksidasi dengan mengorbankan substrat lain (Gambar 82). Hail ini sangat berguna pada proses oksidasi tanpa adanya oksigen seperti selama fase anaerobik glikolisis (2) Sebagai komponen dalam rantai pernapasan yang menjembatanai transport elektron dari substrat ke oksigen

menjembatanai transport elektron dari substrat ke oksigen Gambar 81.Oksidasi metabolit yang katalisis oleh dua

Gambar 81.Oksidasi metabolit yang katalisis oleh dua dehidrogenase

Dehidrogenase menggunakan nikotinamida adenin dinukleotida (NAD + ) atau dinukleotida nikotinamide adenine fosfat (NADP + ) atau keduanya sebagai kofaktor. Dalam tubuh kedua kofaktor tersebut dibentuk dari vitamin niacin. Koenzim direduksi oleh substrat spesifik daridehidrogenase dan direoksidasi oleh akseptor elektron yang sesuai. Mereka mungkin berada dalam keadaan bebas dan secara reversibel dapat memisahkan diri dari apoenzymes masing-masing. Dehydrogenases umumnya terkait dalam reakasi redoks yang melibatkan NAD + seperti pada reaksi redoks dalam jalur metabolism oksidatif ,khususnya dalam glikolisis, siklus asam

126

sitrat, dan dalam rantai pernapasan di mitokondria. Dehydrogenases yang menggunakan NADP + ditemukan karakteristik dalam sintesis reduktif, seperti dalam extramitochondrial seperti halnya jalur sintesis asam lemak dan steroid dan juga di jalur pentosa fosfat. Gugus flavin juga banyak ditemukan dalam dehydrogenases seperti halnua FMN dan FAD yang ditemukan di oksidase. Flavin umumnya lebih erat terikat dalam apoenzymes dibandingkan adalah koenzim nicotinamide . Sebagian besar dehydrogenase mengandung riboflavin yang ditemukan dalam transpor elektron di rantai pernapasan . NADH dehidrogenase bertindak sebagai pembawa elektron antara NADH dan komponen potensial redoks yang lebih tinggi. Dehydrogenases lainnya seperti suksinat dehidrogenase , asil CoA dehidrogenase , dan mitokondria gliserol - 3 fosfat memindahkan elektron secara langsung dari substrat ke rantai pernapasan. Peran lain dari flavin dependent dehydrogenases dalam dehidrogenasi (dengan dihydrolipoyl dehidrogenase ) mereduksi lipoat , metabolit antara dalam dekarboksilasi oksidatif piruvat dan α – ketoglutarat.

Para sitokrom adalah hemoproteins yang mengandung besi yang berosilasi antara Fe3 + dan Fe2 + selama oksidasi dan reduksi. Kecuali untuk sitokrom oksidase (dijelaskan sebelumnya), mereka juga diklasifikasikan sebagai dehydrogenases. Dalam rantai pernapasan, mereka terlibat sebagai pembawa elektron dari flavoproteins ke sitokrom oksidase di sisi lain. Beberapa sitokrom diidentifikasi terdapat di rantai pernapasan, yaitu sitokrom b, c1, c, a, dan a3 (sitokrom oksidase). Sitokrom juga ditemukan di lokasi lain, misalnya retikulum endoplasma (sitokrom P450 dan b5), dan dalam sel tanaman, bakteri, dan ragi.

127

Gambar 81 Mekanisme redosk koenzim nicotinamid.Ada stereospesifisitas pada posisi 4 dari nicotinamide ketika direduksi

Gambar 81 Mekanisme redosk koenzim nicotinamid.Ada stereospesifisitas pada posisi 4 dari nicotinamide ketika direduksi oleh substrat AH 2 . Salah satu atom hydrogen hilang dari substrat dengan membawa ekstra elektron (ion hidrida, H-) dan ditransfer ke posisi 4, yang dapat masuk pada posisis A atau posisi B yang dikatalisis oleh dehidrogenase tertentu. Sisa hydrogen dari pasangan hidrogen terbebas sebagai hydrogen ion.

c.

Peroksidase

Peroksidase ditemukan dalam susu dan leukosit, trombosit, dan jaringan lain

yang terlibat dalam metabolisme eicosanoid. Gugus prostetiknya umumnya adalah

protoheme. Pada reaksi yang dikatalisasi oleh peroksidase, hidrogen peroksida

berkurang dengan mengorbankan beberapa zat yang akan bertindak sebagai akseptor

elektron, seperti askorbat, kuinon, dan sitokrom c. Reaksi yanga dikatalisis oleh

peroksidase adalah kompleks, namun reaksi keseluruhan adalah sebagai berikut:

kompleks, namun reaksi keseluruhan adalah sebagai berikut: Dalam eritrosit dan jaringan lain, enzim glutation

Dalam eritrosit dan jaringan lain, enzim glutation peroksidase mengandung

selenium sebagai gugus prostetik, mengkatalisis penghancuran H 2 O 2 dan

hidroperoksida lipid oleh glutation tereduksi untuk melindungi membran lipid dan

hemoglobin terhadap oksidasi oleh peroksida

Katalase adalah hemoprotein memiliki empat gugus heme. Selain memiliki

aktivitas peroksidase, ia mampu menggunakan satu molekul H 2 O 2 sebagai elektron

donor (reduktan) dan molekul lain dari H 2 O 2 sebagai akseptor electron (oksidan).

128

Di bawah kondisi in vivo, aktivitas peroksidase dari katalase tampaknya banyak dijmpai. Katalase ditemukan dalam

Di bawah kondisi in vivo, aktivitas peroksidase dari katalase tampaknya banyak dijmpai. Katalase ditemukan dalam darah, sumsum tulang, membran mukosa, ginjal, dan hati. Fungsinya diasumsikan sebagai penghancuran hidrogen peroksida yang dibentuk oleh aksi oksidase. Peroksisom ditemukan di banyak jaringan, termasuk hati. Mereka kaya oksidase dan katalase, sehingga enzim yang menghasilkan H 2 O2 dikelompokkan dalam satu tempat dengan enzim yang menghancurkan. Namun pada mitokondria dan mikrosom sistem transpor elektron serta xanthine oxidase harus dianggap sebagai sumber tambahan H2O2. d. Oksigenase. Oksigenase berkaitan dengan sintesis atau degradasi dari berbagai jenis metabolit. Oksigenase mengkatalisis penggabungan oksigen ke dalam molekul substrat dalam dua langkah: (1) oksigen terikat pada sisi aktif enzi,, dan (2) oksigen terikat berkurang atau ditransfer ke substrat. Oksienase dapat dibagi dalam dua sub kelompok, sebagai berikut :

- Dioksigenase : enzim ini mengkatalisis reaksi A + O 2 AO 2 . Contohnya termasuk enzim yang ada di hati, homogentisat dioxygenase (oksidase) dan 3-hydroxyanthranilate dioxygenase (oksidase) dan L- triptofan dioxygenase

- Monooksigenase : enzim mempunyai aktivitas gabungan yaitu oksidase dan hidrolasi dalam memasukkan satu atom oksigen ke dalam suatu senyawa dan satu atom oksigen lainnya direduksi menjadi air, tambahan adanya elektron donor atau kosubstrat (Z) yang diperlukan untuk tujuan ini A-H + O 2 + ZH AOH + H 2 O + Z. Sitokrom P450 adalah monooksigenase yang penting untuk berbagai proses detoksifikasi.

C. Rantai Pernafasan dan Fosforilasi Oksidatif. Organisme aerobik mampu menangkap proporsi yang jauh lebih besar dari energi bebas yang ada pada substrat rantai pernapasan daripada organisme anaerob. Sebagian besar ini terjadi di dalam mitokondria, yang disebut sebagai"Powerhouses" dari sel. Respirasi digabungkan generasi

129

senyawa antawa berenergi tinggi, ATP, oleh fosforilasi oksidatif. Teori

kemiiosmotik menjelaskan bagaimana hal ini dapat terjadi. Sejumlah obat

(misalnya, amobarbital) dan racun (misalnya, sianida, karbon monoksida)

menghambat fosforilasi oksidatif, biasanya dengan konsekuensi yang sangat

fatal.

Mitokondria memiliki membran luar yang permeable untuk sebagian besar

metabolit, membran nalam merupakan membran yang permeabel selektif. Diantara

kedua membran terhadap dan matriks antar membran yang disebut periplasma.

Membran luar ditandai oleh adanya berbagai enzim, termasuk

asil-CoA sintetase dan glycerolphosphate acyltransferase.

Adenylyl kinase dan kreatin kinase ditemukan di ruang

antarmembran ini ruang. The fosfolipid cardiolipin

terkonsentrasi dalam membran dalam bersama dengan enzim

dari rantai pernapasan.

membran dalam bersama dengan enzim dari rantai pernapasan. Gambar 83 struktur dari mitokondria Karbohidrat, asam lemak,

Gambar 83 struktur dari mitokondria

Karbohidrat, asam lemak, dan asam amino tersedia

dalam mitokondria sebagai reducing ekivalen (-H atau elektron)

(Gambar 83). Mitokondria mengandung rantai pernapasan,

yang mengumpulkan dan mengangkut ekivalen perduksi serta

mengarahkan mereka ke final reaksi dengan oksigen untuk

membentuk air. Rantai pernafasan (Gambar 84) bertindak sebagai mesin untuk

menjebak energi bebas yang dibebaskan sebagai fosfat berenergi tinggi. Mitokondria

juga mengandung enzim β - oksidasi dan dari siklus asm sitrat yang menghasilkan

sebagian besar ekivalen pereduksi.

sitrat yang menghasilkan sebagian besar ekivalen pereduksi. Gambar 84. Peran rantai pernapasan di mitokondria dalam

Gambar 84. Peran rantai pernapasan di mitokondria dalam konversi energi makanan menjadi ATP. Oksidasi bahan makanan utama mengarah ke generasi ekivalen pereduksi(2H) yang dikumpulkan oleh rantai pernapasanuntuk oksidasi digabung dengan generasi ATP

130

Rantai Pernafasan.

Enzim-enzim yang terdapat dalam rantai pernafasan berkerja secara berurutan deri enzim dengan pusat aktif ber potensial rendah ke potensial tinggi. Hidrogen dan elektron mengalir melalui rantai pernapasan ( Gambar 85 dan 86) melalui rentang redoks 1,1 V dari NAD + / NADH ke O 2 /2H 2 O. Rantai pernapasan terdiri dari sejumlah operator redoks yang melanjutkan dari sistem dehidrogenase yang berkaitan dengan NAD , melalui flavoproteins dan sitokrom , ke molekul oksigen. Tidak semua substrat terkait dengan rantai pernapasan melalui dehydrogenases yang secara spesifik menggunakan NAD. beberapa , karena redosk potensialnya yang lebih positif ( misalnya , fumarat / suksinat) berhubungan langsung dengan dehydrogenase flavoprotein , yang pada gilirannya dihubungkan dengan sitokrom dari rantai pernapasan. Ubiquinone atau Q ( koenzim Q ) menghubungkan flavoproteins ke sitokrom b , anggota rantai sitokrom dengan potensial reduksi terendah . Koenzim Q berada dalam bentuk teroksidasi dibawah kondisi aerobic dan berada dalam bentuk tereduksi di bawah kondisi anaerobik.Struktur Q sangat mirip dengan vitamin K, vitamin E, dan plastoquinone , ditemukan dalam kloroplas . Q bertindak sebagai komponen yang bergerak dalam rantai pernapasan yang mengumpulkan ekivalen pereduksi dari kompleks flavoprotein dam memberikan ekivalen pereuksi ke sitokrom. Komponen lainnya dari rantai pernafasam adalah protein besi-sulfur ( FeS , zat besi nonheme ) yang menghubungkan dengan flavoproteins ( metalloflavoproteins ) dan dengan sitokrom b . Protein yang mengandung inti besi-belerang berperan dalam reaksi redoks antara flavin dan Q , yang melibatkan hanya elektron tunggal, atom besi menngalamai kesetimbangan redosk antara Fe 2+ dan Fe 3+ .Piruvat dan α - ketoglutarat dehidrogenase memiliki sistem yang kompleks yang melibatkan lipoate dan FAD memberikan elektron ke NAD + , sedangkan perpindahan elektron dari fdehydrogenase lain , misalnya , L(+ )- 3- hydroxyacyl-CoA dehidrogenase , berpasangan langsung dengan NAD + .

131

Gambar 85 Transport ekivalen pereduksi melalu rantai pernafasan Gambar 86 Komponen rantai respirasi di mitokondria,

Gambar 85 Transport ekivalen pereduksi melalu rantai pernafasan

85 Transport ekivalen pereduksi melalu rantai pernafasan Gambar 86 Komponen rantai respirasi di mitokondria,

Gambar 86 Komponen rantai respirasi di mitokondria, menunjukkan titik untuk pengumpulan ekivalen pereduksi dari substrat penting. FeS dalam Fp atau Cyt b.

D. Ringkasan Umum Metabolisme

Metabolisme adalah istilah yang digunakan untuk menggambarkan semua reaksi kimia yang dilakukan oleh makluk hidup dalam menjaga keadaan hidup sel dan organisme. Metabolisme dapat dibagi menjadi tiga kategori: (1) katabolisme yaitu pemecahan molekul untuk memperoleh energi dan (2) anabolisme yaitu sintesis semua senyawa yang dibutuhkan oleh sel-sel. (3) amphibolic terjadi di "persimpangan" metabolisme, bertindak sebagai penghubung antara jalur anabolik dan katabolik, misalnya, sitrat siklus asam.

132

Makanan yang dikonsumsi menentukan pola dasar metabolisme. Produk hasil

pencernaan dari karbohidrat, lemak, dan protein yang berupa glukosa, asam lemak

dan gliserol, dan asam amino

diserap di usus dan selanjutnya

melalui proses katabolism

diubah menjadi produk umum,

asetil-koenzim (Asetil-KoA),

yang kemudian dioksidasi oleh

siklus asam sitrat untuk

menghasilkan energi. (Gambar

oleh siklus asam sitrat untuk menghasilkan energi. (Gambar Gambar 87. Jalur katabolisme dari karbohidrat, protein dan

Gambar 87. Jalur katabolisme dari karbohidrat, protein dan lemak. Semua menghasilkan asetil-Coa yang dapat teroksidasi dalam siklus asam sitrat menghasilkan ATP dalam proses fosforilasi oksidatif.

87)

Dalam katabolisme glukosa

diubah menjadi piruvat melalui

jalur yang disebut jalur glikolisis

(gambar 88). Apabila proses

terjadi secara anaerobik (dalam

ketiadaan oksigen), produk akhir

proses tersebut adalah asam

laktat. Pada jaringan yang

mengandung oksigen (erobik)

piruvat dubah menjadi asetil-

CoA, yang selanjutnya dapat

memasuki siklus asam sitrat untuk selanjutnya mengalami oksidasi lengkap menjadi

CO2 dan H2O dan proses ini terkait dengan pembentukan ATP dalam proses

fosforilasi oksidatif. Glukosa adalah bahan bakar utama pada semua jaringan.

Glukosa dan metabolitnya juga mengambil bagian dalam proses lainnya (1)

penyimpanan glikogen di otot rangka dan hati. (2) jalur pentosa fosfat, jalur

glikolisis adalah penghasil NADPH yang digunakan untuk biosintesis dan sumber

ribose untuk sintesis nukleotida dan asam nukleat (3) Piruvat dan intermediet dari

siklus asam sitrat menyediakan kerangka karbon untuk sintesis asam amino, dan

asetil-CoA, precursor. Glukosa juga merupakan bahan dasar sintesei or asam lemak

dan kolesterol (bahan dasar sintesisi steroid). Anabolisme dari glukosa dikenal

133

dengan nama glukoneogenesis yaitu proses pembentukan glukosa dari bahan dasar noncarbohydrate , misalnya, asam laktat, asam amino, dan gliserol.

, misalnya, asam laktat, asam amino, dan gliserol. Gambar 88. Overview katabolisme karbohidrat dan produk

Gambar 88. Overview katabolisme karbohidrat dan produk utamanya

Asam lemak rantai panjang berasal dari asupan lipid atau sintesis de novo dari asetil- CoA yang berasal dari karbohidrat. Asam lemak dapat dioksidasi menjadi asetil-CoA melalui jalur β-oksidasi atau diesterifikasi dengan gliserol, membentuk triasilgliserol (lemak) sebagai cadangan bahan bakar utama tubuh (gambar 89).

134

Asetil-KoA dibentuk oleh β-oksidasi dapat

mengalami beberapa jalur rekasi dalam

metabolisme: (1) Seperti halnya asetil-CoA

yang dihasilkan dari proses glikolisis, itu

akanteroksidasi menjadi CO2 + H2O melalui

siklus asam sitrat.

(2) Asetil-Coa juga merpakan precursor (bahan

dasar) untuk sintesis kolesterol dan steroid

lainnya.

(3) Dalam hati, membentuk badan keton

(aseton, asetoasetat, dan 3-hidroksibutirat).

Senyawa-senyawa ini merupakan bahan bakar

penting dalam kondisi kelaparan yang

berkepanjangan

bakar penting dalam kondisi kelaparan yang berkepanjangan Gambar 89. Overview metabolisme asam lemak menunjukkan jalur

Gambar 89. Overview metabolisme asam lemak menunjukkan jalur utama dan produk akhir. Keton tubuh terdiri antara lain asetoasetat, 3-hidroksibutirat, dan aseton

terdiri antara lain asetoasetat, 3-hidroksibutirat, dan aseton Gambar. 90. Ringkasan jalur metabolisme asam amino 135

Gambar. 90. Ringkasan jalur metabolisme asam amino

135

Asam amino diperlukan untuk sintesis protein. Ringasan katabolisme asam amino digambarkan pada gambar 90. Beberapa asam amino harus terkandung dalam makanan (asam amino esensial) karena mereka tidak dapat disintesis dalam tubuh. Sisanya adalah asam amino nonesensial yang terdapat dalam makanan tetapi dapat dibentuk dari metabolisme intermediet melalui reaksi transaminasi dengan gugus amino dari asam amino lainnya. Setelah deaminasi, amino nitrogen diekskresikan sebagai urea, dan karbon kerangka setelah transaminasi dapat (1) teroksidasi menjadi CO2 melalui siklus asam sitrat, (2) diguanakan untuk membentuk glukosa melalui glukoneogenesis, atau (3) membetuk bentuk badan keton. Beberapa asam amino juga merupakan prekursor dari senyawa nitrigen lainnya senyawa, misalnya, purin, pirimidin, hormon seperti sebagai epinefrin dan tiroksin, dan neurotransmitter.

Darah mengintegrasikan metabolisme berbagai metabolit ke dalam organ dan jaringan.

Pada jaringan dan tingkat organ, substrat dan dan metabolit hanya masuk dan meninggalkan jaringan tertentu . di tingkat subselular, masing-masing organel sel (misalnya, mitokondria) atau kompartemen lain (misalnya, sitosol) memiliki peran spesifikdalam jaulur metabolisme subselular .

Asam amino yang dihasilkan dari pencernaan protein dari makanan dan glukosa yang dihasilkan dari pencernaan karbohidrat diserap dan diarahkan ke hati melalui pembuluh darah portal . Hati memiliki peran mengatur konsentrasi darah dari hampir semua metabolit yang larut dalam air ( Gambar 91) . Kelebihan glukosa akan diubah secara langsung menjadi glikogen melalui prosesn ( glikogenesis atau diubah menjadi lemak melalui proses lipogenesis. Antara waktu makan , hati berperan untuk mempertahankan kadar glukosa darah dengan cara mendegradasi glukosa dari glikogen glikogen ( glikogenolisis ) dan , bersama dengan ginjal, dengan mengubah metabolit noncarbohydrate seperti halnya laktat , gliserol , dan asam amino menjadi glukosa melalui peroses yang disebut dengan glukoneogenesis. Pemeliharaan konsentrasi glukosa yang memadai dalam darah sangat penting bagi jaringan terustama pada otak dimana glukosa merupakan bahan bakar utama dan glukosa juga meruapakan satu-satunya bahan bakar pada eritrosit. Hati juga

136

berperana dalam mensintesis plasma protein utama ( misalnya , albumin ) dan

melakukan deaminasi kelebihan asam amino yang melebihi persyaratan yang

akhirnya diubah menjadi urea , yang diangkut ke ginjal dan diekskresikan sebagai

urin.

Otot rangka memanfaatkan glukosa sebagai bahan bakar utama , membentuk

laktat dan CO 2 . Yang menyimpan glikogen sebagai bahan bakar untuk yang

digunakan dalam kontraksi otot dan mensintesis protein otot dari plasma asam

amino. Otot mencapai sekitar 50% dari massa tubuh dan akibatnya merupakan

penyedia protein terbesar yang dapat dimanfaatkan sebagai sumber asam amino

untuk glukoneogenesis dalam kondisi kelaparan.

asam amino untuk glukoneogenesis dalam kondisi kelaparan. Gambar 91. Transport karbohidrat, asam amino dana beberapa

Gambar 91. Transport karbohidrat, asam amino dana beberapa metabolit. Konsentrasi glukosa dalam otot sangat kecil karena glukosa akan difosforilasi setalah memasuki jaringan otot

Lipid dalam makanan yang berupa triasilgliserol dihidrolisis menjadi

monoacylglycerols dan asam lemak dalam usus , kemudian di reesterifikasi dalam

kelenjar mukosa usus. Lipida tidak larut dalam ar sehingga pada jaringan ini

lipiddikemas dengan protein dan disekresikan ke dalam sistem limfatik dan

selanjutnya masuk ke aliran darah sebagai kilomikron, yaitu lipoprotein plasma yang

terbesar. Kilomikron juga mengandung nutrisi lipid yang larut, misalnya , vitamin .

Tidak seperti glukosa dan asam amino, chylomicron triasilgliserol tidak diambil

langsung oleh hati tetapi dimetabolisme oleh jaringan yang memiliki lipoprotein

lipase , yang mempu menghidrolisis triasilgliserol tersebut menghasilkan asam

137

lemak yang dimasukkan ke jaringan lemak atau dioksidasi sebagai bahan bakar .

Sumber utama lainnya asam lemak rantai panjang berasal sintesis lemak

(lipogenesis) dari karbohidrat , terutama dalam jaringan adiposa dan hati .

Triasilgliserol pada jaringan adiposa adalah cadangan bahan bakar utama

tubuh . Pada hidrolisis lipid (lipolisis), asam lemak bebas dilepaskan ke sirkulasi

darah dan diambil oleh kebanyakan jaringan kecuali tidak otak atau eritrosit dan

diesterifikasi acylglycerols atau teroksidasi sebagai bahan bakar . Dalam hati ,

triasilgliserol dihasilkan dari lipogenesis , asam lemak bebas , dan

sisa-sisa chylomicron (Gambar 92) disekresikanke dalam sirkulasi sebagai

lipoprotein densitas sangat rendah (Very Low Density Lipoprotein/VLDL ) .

Triasilgliserol ini mengalami jalur yang sama dengan kilomikron . Oksidasi parsial

dari lemak asam dalam hati menyebabkan produksi keton tubuh( ketogenesis ) .

Badan keton diangkut ke jaringan ekstrahepatik , di mana mereka bertindak sebagai

sumber bahan bakar dalam kelaparan .

bertindak sebagai sumber bahan bakar dalam kelaparan . Gambar 92. Ringkasan metabolisme lipid pada tingkat organ

Gambar 92. Ringkasan metabolisme lipid pada tingkat organ

Tinjauan metabolisme pada tingkat subseluler (Glikolisis terjadi di sitosol dan siklus asa sitrat terjadi di mitokondria)

Kompartmentasi jalur metabolisme pada kompartemen subseluler yang

terpisah atau organel yang berbeda mengizinkan integrasi dan regulasi metabolisme .

138

Tidak semua jalur metabolisme penting dalam semua sel. Gambar 93 menggambarkan subselular kompartmentasi jalur metabolisme dalam sel parenkim hati. Peran sentral mitokondria sangat jelas yang terfokus pada metabolisme karbohidrat , lipid , asam amino . Dalam mitokindria terdapat enzim-enzim dari siklus asam sitrat , β - oksidasi asam lemak , dan ketogenesis , serta rantai pernapasan dan ATP Synthase. Glikolisis, jalur pentosa fosfat , dan sintesis asam lemak semuanya ditemukan dalam sitosol . Di glukoneogenesis , substrat seperti laktat dan piruvat , yang terbentuk di sitosol , masuk ke mitokondria untuk menghasilkan oksaloasetat sebelum pembentukan glukosa . Membran retikulum endoplasma mengandung sistem enzim untuk sintesis acylglycerol , dan ribosom bertanggung jawab untuk sintesis protein .

Aliran metabolit diatur (diregulasi) secara keseluruhan melalui jalur penting untuk menjamin pasokan subatrat yang tepat, jika diperlukan untuk produksi produk pada jalur-jalur metabolisme tersebut itu. Regulasi tersebut dicapai dengan mengendalikan satu atau lebih reaksi kunci dalam jalur metabolsime, dikatalisasi oleh "enzim pengatur." Faktor fisikokimia yang mengontrol reaksi enzim-katalis, misalnya, konsentrasi substrat merupakan faktor utama dalam pengendalian keseluruhan jalur metabolisme.

Dalam reaksi kesetimbangan, reaksi ke dua arah terjadi pada tingkat kecepatan yang sama, dan oleh karena itu tidak ada. Padareaksi in vivo, di bawah kondisi"steady- state" , ada aliran dari kiri ke kanan karena ada pasokan kontinyu. Dalam prakteknya, selalu ada satu atau lebih reaksi nonequilibrium dalam suatu jalur metabolisme, di mana reaktan hadir dalam konsentrasi yang jauh lebih tinggi dari konsentrasi keseimbangan. Dalam upaya untuk mencapai keseimbangan, sistem reaksi melepaskan panas, menyebabkan rekasi dasarnya menjadi ireversibel. Jalur semacam itu memiliki aliran dan arah. Enzim yang mengkatalis reaksi nonequilibrium biasanya hadir dalam konsentrasi rendah dan memiliki berbagai model mekanisme regulasi. Namun, banyak dari reaksi dalam jalur metabolik tidak dapat diklasifikasikan sebagai keseimbangan atau nonequilibrium tetapi berada diantaranya

139

Gambar 93. Komparmentasi metabolisme pada tingkat seluler Sebuah jalur metabolisme A ↔ B ↔ C

Gambar 93. Komparmentasi metabolisme pada tingkat seluler

Sebuah jalur metabolisme A BCD dengan reaksi di mana reaksi A ↔ B dan C ↔ D adalah keseimbangan reaksi dan B → C adalah reaksi nonequilibrium, maka aliran melalui jalur tersebut dapat diatur oleh ketersediaan substrat A. ini tergantung pada pasokan dari darah , yang pada gilirannya tergantung baik pada asupan makanan atau reaksi kunci yang menjaga dan melepaskan substrat dari cadangan jaringan ke darah. Aliran juga tergantung pada transportasi substrat A melintasi membran sel, berkurangnya produk akhir D dan ketersediaan dari kosubstrat atau kofaktor . Reaksi enzimatik nonequilibrium yang dikatalisator oleh protein alosterik tergantung pada" umpan balik " atau " umpan-maju " yang mengkontrol perubahan alosterik dalam merespon kebutuhan sel. Seringkali, produk dari jalur biosintesis akan menghambat enzim yang mengkatalis reaksi pertama di jalur tersebut. Mekanisme kontrol lain tergantung pada aksi dari hormon dalam menanggapi kebutuhan tubuh secara keseluruhan, mereka dapat bertindak cepat ,

140

dengan mengubah aktivitas molekul enzim yang ada , atau perlahan-lahan , dengan mengubah laju sintesis enzim.

E. Glikolisis

Glikolisis adalah rute utama untuk meabolisme glukosa dan jalur utama untuk metabolisme fruktosa , galaktosa , dan karbohidrat lainnya yang berasal dari makanan (Gambar 94). Kemampuan glikolisis untuk menyediakan ATP tanpa

adanya oksigen sangat penting karena memungkinkan otot rangka untuk beraktifitas

di tingkat yang sangat tinggi ketika suplai oksigen tidak mencukupi dan karena

memungkinkan jaringan untuk bertahan pada kondisi anoksik. Namun, otot jantung, yang kerja secara aerobik , memiliki aktivitas glikolitik yang relatif rendah. Penyakit

di mana enzim dari glikolisis ( misalnya kinase piruvat ) dalam kondisi defisiensi

dilihat sebagai anemia hemolitik atau, jika cacat akan mempengaruhi otot rangka ( misalnya , fosfofruktokinase ), seperti halnya kelelahan. Dalam sel-sel kanker yang tumbuh cepat , glikolisis berlangsung pada tingkat yang lebih tinggi dari yang

dibutuhkan oleh siklus asam sitrat , membentuk sejumlah besar piruvat , yang akan mereduksinya menjadilaktat. Ini menghasilkan asam yang relatif lingkungan lokal dalam tumor yang mungkin memiliki implikasi untuk terapi kanker . Laktat ini digunakan untuk glukoneogenesis dalam hati , suatu proses yang mahal - energi yang

terjadi pada banyak hipermetabolisme terlihat pada cachexia kanker . Hasil asidosis laktat dapat disbabkan oleh beberapa hal, termasuk aktivitas gangguan piruvat

dehidrogenase

Ketika kontraksi otot dalam medium yang bersifat anaerob, glikogen menghilang dan laktat muncul sebagai produk akhir utama. Ketika oksigen ada kembali, pemulihan aerobik terjadi dan laktat menghilang. Namun, jika kontraksi terjadi di bawah kondisi aerobik, laktat tidak menumpuk dan piruvat adalah produk utama akhir glikolisis. Piruvat dioksidasi lebih lanjut menjadi CO2 dan air Ketika oksigen berada dalam jumlah terbatas, mitokondria mereoksidasi NADH yang terbentuk dari NAD + selama glikolisis terganggu, dan NADH direoxidasi dengan mengurangi piruvat menjadi laktat, sehingga memungkinkan glikolisis untuk

melanjutkan. Sementara glikolisis dapat terjadi di bawah kondisi aerobik akan membatasi jumlah ATP yang terbentuk per mol glukosa yang teroksidasi, sehingga

141

lebih banyak glukosa harus dimetabolisme di bawah anaerobik daripada di bawah kondisi aerobik.

di bawah anaerobik daripada di bawah kondisi aerobik. Gambar 94. Kesimpulan umum jalur glikolisis Persamaan

Gambar 94. Kesimpulan umum jalur glikolisis

Persamaan

keseluruhan

adalah sebagai berikut:

untuk

glikolisis

dari

glukosa

menjadi

laktat

Glukosa + 2ADP + 2Pi 2 L(+)-laktat + 2ATP + 2 H 2 O

Semua enzim glikolisis ditemukan dalam sitosol. Glukosa memasuki glikolisis oleh fosforilasi menjadi glukosa 6-fosfat, dikatalisis oleh heksokinase, menggunakan ATP sebagai donor fosfat. di bawah kondisi fisiologis, fosforilasi glukosa menjadi glukosa 6-fosfat dapat dianggap sebagai tidak dapat diubah. Heksokinase dihambat secara allosterik oleh produknya, glukosa 6-fosfat. Dalam jaringan selain hati dan sel B- pankreas, ketersediaan glukosa untuk glikolisis ( atau sintesis glikogen dalam otot dan lipogenesis dalam jaringan adiposa ) dikendalikan oleh transportasi ke sel , yang pada gilirannya diatur oleh insulin . heksokinase memiliki afinitas tinggi (rendah Km) terhadap substrat nya , glukosa , dan dalam hati dan sel B pancreas dalam semua kondisi normal kosentrasi glukosa mencapai tingkat kejenuhan dan enzim

142

mencapai laj yang konstan dalam menyediakan glukosa 6 - fosfat untuk memenuhi kebutuhan sel. Hati dan sel-sel pankreas B juga mengandung isoenzim dari heksokinase , glukokinase , yang memiliki Km sangat jauh lebih tinggi daripada konsentrasi glukosa intraseluler yang normal. Fungsi glukokinase dalam hati adalah untuk menghilangkan glukosa dari darah setelah makan, menyediakan glukosa 6- fosfat melebihi persyaratan untuk glikolisis , yang akan digunakan untuk sintesis glikogen dan lipogenesis. Dalam pankreas, glukosa 6-fosfat yang dibentuk oleh glukokinase meningkatkan sinyal ketersediaan glukosa dan mengarah ke sekresi insulin.

143

Gambar 95. Jalur glikolisis 144

Gambar 95. Jalur glikolisis

144

Glukosa 6 fosfat merupakan senyawa penting pada persimpangan beberapa jalur metabolime (glikolisis, glukoneogenesis, jalur pentosa fosfat, glikogenesis, dan glikogenolisis). Dalam glikolisis (Gambar 95) , glukosa-6-fosfat akan diubah menjadi fruktosa 6-fosfat oleh phosphohexoseisomerase, yang melibatkan isomerisasi aldosa - ketosa. Reaksi ini diikuti oleh fosforilasi lain dengan ATP yang dikatalisis oleh enzim fosfofruktokinase (atau fosfofruktokinase-1) , membentuk fruktosa 1,6-bifosfat. Reaksi fosfofruktokinase mungkin dianggap ireversibel seara fungsional di bawah kondisi fisiologis. Reaksi ini dapat diinduksi dan dikenddalikan secara alosterik dan memiliki peran utama dalam mengatur laju glikolisis. Fruktosa 1,6- bifosfat selanjutnya dipotong oeh aldolase (fruktosa 1,6-bifosfat aldolase) menjadi dua triosa fosfat yaitu gliseraldehida 3fosfat dan dihidroksiaseton fosfat. Gliseraldehida 3 - fosfat dan dihidroksiaseton fosfat dapat mengalami interkomversi oleh enzim phosphotriose isomerase. Glikolisis berlanjut dengan oksidasi gliseraldehida 3 -fosfat menjadi 1,3-bisphosphoglycerate. Enzim yang mengkatalis oksidasi ini adalah gliseraldehida -fosfat dehidrogenase yang aktifitasnya tergantung pada NAD. Enzim ini secara struktural terdiri dari empat polipeptida yang identik (monomer) membentuk tetramer. Masing-masing polipeptida memiliki gugus -SH yang berasal berasal dari residu sistein dalam rantai masing-masing polipeptida. Salah satu gugus -SH pada enzim bergabung dengan substrat membentuk sebuah thiohemiacetal yang dioksidasi menjadi ester tiol; hidrogen dihilangkan dalam reeaksi oksidasi ini, ditransfer ke NAD + (Gambar 96). Ester tiol kemudian mengalami phosphorolysis dan anorganik fosfat (Pi) ditambahkan, membentuk 1,3- bisphosphoglycerate, dan gugus SH direkonstitusi kembali. Dalam reaksi berikutnya yang dikatalisis oleh fosfogliserat kinase, fosfat ditransfer dari 1,3- bisphosphoglycerateke ADP, membentuk ATP (disebut dengan fosforilasi tingkat substrat) dan 3-fosfogliserat. Dari proses glokolisis ini karena itu dua molekul triose fosfat terbentuk per molekul glukosa dan dua molekul ATP dihasilkan sampai tahap ini. Toksisitas arsenik dalam tubuh karena persaingan arsenat dengan fosfat anorganik (Pi) dalam reaksi diatas menghasilkan 1- arseno-3-fosfogliserat, yang terhidrolisis secara spontan untuk memberikan 3-fosfogliserat dan menghasilkan panas tanpa menghasilkan ATP. 3-Phosphoglycerate mengalami isomerisasi menjadi 2fosfogliserat yang dikatalisis oleh fosfogliserat mutase. Sangat mungkin bahwa 2,3-bisphosphogliserat (diphosphoglycerate; DPG) adalah produk antara dalam

145

reaksi ini. Langkah reaksi berikutnya dikatalisis oleh enolase dan melibatkan proses dehidrasi 2fosfogliserat, membentuk fosfoenolpiruvat. Enolase dihambat oleh fluoride. Untuk mencegah glikolisis dalam pengukuran kadar glukosa darah, darah dikumpulkan dalam tabung yang mengandung fluoride. Enzim ini juga tergantung pada ada atau tidaknya ketersediaan Mg 2+ atau Mn 2+ . Gugus fosfat dari fosfoenolpiruvat ditransfer ke ADP oleh piruvat kinase untuk menghasilkan dua molekul ATP per molekul glukosa yang diokasidasi oksidasi. Produk dari reaksi katalisisi ini yaitu enolpyruvate, mengalami isomerisasi spontan (nonenzmatik) menjadi piruvat sehingga rekasinya tidak dituliskan sebagai reaksi bolak-balik. Reaksi oleh piruvat kinase adalah contoh proses ireversibel dalam kondisi fisiologis. Keadaan redoks jaringan sekarang menentukan pemilihan atas dua jalur selanjutnya. Dalam kondisi anaerobik, reoksidasi NADH oeh oksigen melalui rantai pernapasan tidak terjadi. Pada keadaan konsentrasi oksigen terbatas piruvat diredukasi oleh NADH menjadi laktat yang dikatalisasioleh laktat dehidrogenase. Reoksidasi NADH melalui pembentukan laktat memungkinkan glikolisis untuk berlanjut dalam ketiadaan oksigen dengan regenerasi NAD + dari siklus selain dari reaksi dikatalisis olehdehidrogenase gliseraldehida-3-fosfat. Di bawah kondisi aerobik, piruvat dipindahkan ke dalam mitokondria dan setelah dikonversi menjadi asetil-CoA akan dioksidasi menjadi CO 2 oleh siklus asam sitrat.

akan dioksidasi menjadi CO 2 oleh siklus asam sitrat. Gambar 96. Mekanisme oksidasi gliseraldehid-3-fosfat. 146

Gambar 96. Mekanisme oksidasi gliseraldehid-3-fosfat.

146

F. Siklus Asam Sitrat.

F. Siklus Asam Sitrat. Siklus asam sitrat adalah serangkaian reaksi dalam mitokondria yang mengoksidasi residu asetil

Siklus asam sitrat adalah

serangkaian reaksi dalam mitokondria

yang mengoksidasi residu asetil

(sebagai asetil-CoA) dan mereduksi

koenzim yang selanjutnya

direoksidasi pada pembentukan ATP.

Siklus asam sitrat merupakan jalur

akhir yang umum untuk oksidasi

karbohidrat, lipid, dan protein pada

kondisi aerobik oleh karena glukosa,

asam lemak, dan kebanyakan amino

asam dimetabolisme menjadi asetil-

CoA atau zat antara siklus. Senyawa

antara ini juga memiliki peran sentral

dalam glukoneogenesis, lipogenesis,

dan interkonversi asam amino.

Proses-proses tersebut sebagian besar

terjadi di jaringan, dan hati adalah

satu-satunya jaringan di mana semua

proses terjadi sampai batas yang signifikan. Dampak menjadi sangat nyata, misalnya,

sejumlah besar sel hati yang rusak seperti di hepatitis akut atau digantikan. Sangat

sedikit, kelainan genetik sitrat enzim siklus asam telah dilaporkan.

Siklus asam sitrat dimulai dengan reaksi antara gugus asetil dari asetil-CoA

dengan asam oksaloasetat (asam karboksilat dengan 4C), membentuk asam

trikarboksilat (6 karbon), yaitu asam sitrat. Dalam reaksi berikutnya, dua molekul

CO 2 dilepaskan dan oksaloasetat diregenerasi (Gambar 97). Hanya sejumlah kecil

oksaloasetat diperlukan untuk oksidasi dalam jumlah besar asetilCoA. Siklus asam

sitrat merupakan bagian integral dari proses dimana sebagian besar energi bebas

dilepaskan selama oksidasi dari bahan bakar yang tersedia. Selama oksidasi asetil-

CoA, koenzim berkurang dan kemudian reoxidized dalam rantai pernapasan, yang

Gambar 97. Siklus asam sitrat dan aitannya dengan rantai pernafasan

147

Gambar 98 Reaksi reaksi yang terjadi dalam siklus asam sitrat. berkaitan dengan pembentukan ATP (fosforilasi

Gambar 98 Reaksi reaksi yang terjadi dalam siklus asam sitrat.

berkaitan dengan pembentukan ATP (fosforilasi oksidatif) lihat Gambar 98. Proses berlangsungini aerobik, yang membutuhkan oksigen sebagai oksidan akhir untuk meredukasi koenzim. Enzim-enzim siklus asam sitrat terletak di dalam matriks mitokondria, baik terlarut bebas dalam larutan mitokondria atau terletak pada membran mitokondria, di mana enzim rantai pernafasan juga ditemukan. Reaksi awal antara asetil-CoA dan oksaloasetat untuk membentuk sitrat dikatalisis oleh sitrat sintase yang membentuk ikatan karbon-karbon antara atom C dari gugus metil dari asetil-CoA dengan atom karbon pada gugus karbonil dari oksaloasetat. Ikatan thioester dari citril-CoA yang dihasilkan selanjutnya dihidrolisis melepaskan sitrat dan CoASH dan reaksi ini adalah reaksi eksergonik. Sitrat selanjutnya diisomerisasi menjadi isositrat oleh enzim akonitase (akonitat hidratase).

148

Reaksi ini terjadi pada dua langkah: dehidrasi menghasilkane cis-akonitat yang tetap terikat pada enzim dan mengalami rehidrasi menghasilkan isositrat. Meskipun sitrat adalah molekul simetris, akonitase bereaksi dengan sitrat secara asimetris, sehingga dua atom karbon yang hilang dalam siklus pertaman ini berasal dari asetil-CoA yang digabung di atas. Perilaku asimetris ini disebabkan penyaluran produk sitrat sintase langsung ke pusat aktif akonitase tanpa terlarut secar bebas ke larutan mitokondria. Proses ini menyediakan integrasi aktivitas siklus asam sitrat dan penyediaan sitrat dalam sitosol sebagai sumber asetil CoA untuk sintesis asam lemak. Fluoroacetate adalah racun karena fluoroacetyl-CoA dapat berkondensasi dengan oksaloasetat untuk membentuk fluorocitrate yang menghambat akonitase dan berakibat pada penumpukan sitrat. Isositrat selanjutnya mengalami dehidrogenasi dikatalisis oleh isositrar dehidrogenase menghasilkan oxalosuksinat, yang tetap terikat pada enzim dan mengalami dekarboksilasi menghasilkan α-ketoglutarat. Dekarboksilasi membutuhkan ion Mg 2+ atau Mn 2+ . Ada tiga isoenzim isositrat dehidrogenase. Satu enzim yang menggunakan NAD + hanya ditemukan dalam mitokondria. Dua enzim yang lain menggunakan NADP + dan ditemukan dalam mitokondria dan sitosol. Oksidasi pada rantai yang dihubungkan dengan hasil isocitrate sepenuhnya melalui aktifitas yang menggunakan NAD + . α-Ketoglutarat mengalami dekarboksilasi oksidatif dalam reaksi yang dikatalisis oleh kompleks multi-enzim mirip dengan yang terlibat dalam dekarboksilasi oksidatif piruvat. Kompleks α-Ketoglutarat dehidrogenase membutuhkan kofaktor yang sama dengan kompleks piruvat dehidrogenase yaitu thiamin diphosphate, lipoate, NAD + , FAD, dan CoA menghasilkan pembentukan suksinil-CoA. Reaksi keseimbangan pada tahap ini lebih mengara ke pembentukan suksinilCoA. Seperti dalam kasus oksidasi piruvat arsenit menghambat reaksi dehidrogenase α-ketoglutarat, menyebabkan penumpukan α –ketoglutarat. Suksinil-CoA selanjutnya diubah menjadi suksinat oleh enzim suksinat thiokinase (suksinil-CoA sintetase). Ini adalah satu-satunya contoh dalam siklus asam sitrat yang melibatkan fosforilasi tingkat-substrat. Jaringan di mana glukoneogenesis terjadi (hati dan ginjal) mengandung dua isoenzim dari suksinat thiokinase, satu khusus untuk GDP dan yang lainnya untuk ADP. GTP yang terbentuk digunakan untuk dekarboksilasi oksaloasetat menjadi fosfoenolpiruvat dalam glukoneogenesis dan mengendalikan pengendalian antara aktivitas siklus

149

asam sitrat dan penarikan oksaloasetat untuk glukoneogenesis. Jaringan non- glukogenik hanyan mempunya suksinat thiokinase yang memberikan fosfat ke ADP. Ketika badan keton dimetabolisme di jaringan ekstrahepatik terdapat sebuah reaksi alternatif katalisisi oleh suksinil - CoA - acetoacetate - CoA transferase (thiophorase) yang bekerja memindahkan CoA dari suksinil CoA untuk asetoasetat, membentuk asetoasetil-CoA. Metabolisme suksinat seanjutnya dalah regenerasi oksaloasetat. Jalur ini sama dengan prose yang terjadi pada β-oksidasi lemak asam yaitu proses dehidrogenasimenghasilkan ikatan rangkap diiduktu dengan penambahan molekul air untuk membentuk gugus hidroksil, dan dehidrogenasi lebih lanjut menghasilkan gugus oxo dalam oksaloasetat. Reaksi dehidrogenasi yang pertama menghasilkan fumarat dikatalisis oleh suksinat dehidrogenase, yang terikat pada permukaan bagian dalam membran mitokondria. Enzim tersebut mengandung FAD dan protein yang mengikat besisulfur (Fe:S) dan langsung direduksi oleh ubiquinone di rantai pernapasan. Fumarase (fumarat hidratase) mengkatalisi penambahan air di ikatan rangkap dalam fumarat menghasilkan malat. Malate dikonversi menjadi oksaloasetat oleh malat dehidrogenase, reaksi ini membutuhkan NAD + . Meskipun kesetimbangan reaksi ini lebih mengarah ke pembentukan malat, aliran total lebih mengarah ke oksaloasetat tetapi karena konsentarsi oksaloasestat terus-menerus diambil (baik untuk membentuk sitrat atau sebagai substrat untuk glukoneogenesis atau digunakan untuk pembuatan aspartat atau reoksidasi secara terus-menerus oleh NADH.

150